Kapsamlı İki Boyutlu Gaz Kromatografisi ile Toplanan Veriler için Şablon Eşleştirmeye Göre Kromatografik Parmak İzi

Özet

Bu protokol, parmak izi için bir yaklaşım sunar ve kütle spektrometresi ile birleştiğinde kapsamlı iki boyutlu gaz kromatografisi tarafından toplanan çok boyutlu verileri araştırır. Özel desen tanıma algoritmaları (şablon eşleştirme), sızma zeytinyağı uçucu fraksiyonunda (yani volatilome) şifrelenen kimyasal bilgileri keşfetmek için uygulanır.

Özet

Veri işleme ve değerlendirme, özellikle kütle spektrometresi ile birleştiğinde, kapsamlı iki boyutlu gaz kromatografisinin (GCxGC) kritik adımlarıdır. Verilerde şifrelenen zengin bilgiler son derece değerli olabilir, ancak verimli bir şekilde erişmek zor olabilir. Veri yoğunluğu ve karmaşıklığı uzun detaylandırma sürelerine yol açabilir ve zahmetli, analiste bağımlı prosedürler gerektirebilir. Bu nedenle, etkili ancak erişilebilir veri işleme araçları, bu gelişmiş çok boyutlu tekniğin günlük kullanım için laboratuvarlarda yayılmasını ve kabul edilmesine olanak sağlamanın anahtarıdır. Bu çalışmada sunulan veri analizi protokolü, karmaşık iki boyutlu kromatogramların bireysel kromatogramlar içinde ve kromatogram kümeleri arasında bilgilendirici desenlerin gelişmiş tanınması için bireysel kimyasal özelliklere son derece otomatik yapısızlaştırılması hedefine ulaşmak için kromatografik parmak izi ve şablon eşleştirme kullanır. Protokol, çok az müdahale ile yüksek tutarlılık ve güvenilirlik sağlar. Aynı zamanda, analist gözetimi, farklı ihtiyaçlara ve hedeflere uyum sağlamak için esneklik ve kapasite sağlamak için özelleştirilebilen çeşitli ayarlarda ve kısıtlama işlevlerinde mümkündür. Şablon eşleştirme, sızma zeytinyağı volatilomlarını keşfetmek için güçlü bir yaklaşım olarak gösterilmiştir. Tepelerin çapraz hizalaması sadece bilinen hedefler için değil, aynı zamanda çok çeşitli uygulamalar için karakterizasyon gücünü önemli ölçüde artıran hedefsiz bileşikler için de gerçekleştirilir. Benzer koşullar altında analiz edilen numune setlerinden kromatografik desenlerin sınıflandırılması ve karşılaştırılması için performansın kanıtlandırılmasına örnekler sunulmuştur.

Giriş

Kapsamlı iki boyutlu gaz kromatografisi, uçuş zamanı kütle spektrometrik algılaması (GC×GC-TOF MS) ile birlikte günümüzde karmaşık numunelerin kimyasal karakterizasyonu için en bilgilendirici analitik yaklaşımdır 1 ,^2,3,4,5. GC×GC'de sütunlar, ikinci boyut⁽²D) sütununa yeniden enjeksiyondan önce ilk boyuttan⁽¹D) sütundan elde edilen bileşenleri hapseden bir modülatör (örneğin, termal veya valf tabanlı bir odaklama arayüzü) tarafından seri olarak bağlanır ve arayüzlenir. Bu işlem, genellikle 0,5-8 s arasında değişen sabit bir modülasyon süresi(P_M)içinde yapılır. Termal modülasyon ile, işlem kriyo tuzaklama ve genel ayırma gücü için bazı yararları ile eluting bandı odaklanma içerir.

GC×GC iki boyutlu bir ayırma tekniği olmasına rağmen, işlem sıralı veri değerleri üretir. Dedektör analogdan dijitale (A/D) dönüştürücü kromatografik sinyal çıkışını belirli bir frekansta elde eder. Daha sonra, veriler yalnızca dijitalleştirilmiş verileri değil, ilgili meta verileri (veriler hakkında bilgi) de içeren belirli özel biçimlerde depolanır. GC×GC sistemlerinde kullanılan A/D dönüştürücü, kromatografik sinyalin yoğunluğunu iki analitik boyutta zamanın bir işlevi olarak dijital bir sayıya (DN) eşlemeye yardımcı olur. Tek kanallı dedektörler (örneğin, alev iyonizasyon dedektörü (FID), elektron yakalama dedektörü (ECD), kükürt chemiluminescence dedektörü (SCD) vb.) örnekleme süresi başına tek değerler üretirken, çok kanallı dedektörler (örneğin, kütle spektrometrik dedektörü (MS)) analitik çalışma boyunca örnekleme süresi başına birden fazla değer (tipik olarak spektral aralık üzerinden) üretir.

²B verileri görselleştirmek için detaylandırma, tek bir modülasyon dönemi (veya döngüsü) veri değerlerinin piksel sütunu (dedektör olaylarına karşılık gelen resim öğeleri) olarak rasterleştirilmesiyle başlar. Ordinat boyunca (Y ekseni, aşağıdan yukarıya) ^2Bayırma süresi görselleştirilir. Piksel sütunları sırayla işlenir, böylece abscissa (X ekseni, soldan sağa) ^1Bayırma süresini bildirir. Bu sıralama, ²B verilerini sağ el Kartezyen koordinat sisteminde sunar ve diziye ilk dizin olarak ¹D saklama sırası sunar.

²B kromatogramların veri işlemesi, ham verilerden daha yüksek bir bilgi düzeyine erişim sağlayarak ²D tepe algılama, tepe tanımlama, nicel analiz için yanıt verilerinin çıkarılmasını ve karşılaştırmalı analiz sağlar.

²D tepe desenleri, numunenin benzersiz parmak izi olarak kabul edilebilir ve etkili çapraz karşılaştırmalı analiz için minutiae özellikleri olarak tespit edilen bileşikler. Şablon tabanlı parmak izi^6,7olarak bilinen bu yaklaşım, biyometrik parmak izi⁶. Otomatik biyometrik parmak izi doğrulama sistemleri, aslında benzersiz parmak ucu özelliklerine dayanır: sırt çatallanmaları ve uçları, lokalize ve mürekkepli gösterimlerden veya ayrıntılı görüntülerden çıkarılır. Minutiae özellikleri olarak adlandırılan bu özellikler daha sonra kullanılabilir depolanan şablonlar^8,9ile çapraz eşleştirilir.

Yukarıda belirtildiği gibi, her GC×GC ayırma deseni, iki boyutlu bir düzlem üzerine rasyonel olarak dağılmış ²D tepelerden oluşur. Her tepe tek bir analite karşılık gelir, bilgilendirici potansiyeli vardır ve karşılaştırmalı desen analizi için tek bir özellik olarak kabul edilebilir.

Burada, GC×GC-TOF MS tarafından tandem iyonlaşma içeren kimyasal parmak izi için etkili bir yaklaşım sunuyoruz. Amaç, bir kromatogram kümesinden özellikleri kapsamlı ve nicel olarak kataloglamaktır.

Mevcut ticari yazılım veya şirket içi rutinlerle karşılaştırıldığında^10,11 en yüksek özellikler yaklaşımını kullanan şablon tabanlı parmak izi, yüksek özgüllük, verimlilik ve sınırlı hesaplama süresi ile karakterize edilir. Ek olarak, minutia özelliklerinin ^{(yani, 2}D tepeler) farklı enstrümantasyon tarafından veya uzun süreli çerçeve çalışmalarında elde edilenler olarak ciddi şekilde yanlış hizalanmış kromatogramlar arasında çapraz hizalamasını sağlayan içsel bir esnekliğe sahiptir^12,13,14.

Önerilen yöntemin temel işlemleri, okuyucuyu ²B desen karmaşıklığını ve bilgi gücünü iyi anlamaya yönlendirmek için kısaca açıklanmıştır. Daha sonra, cihaz çıkış veri matrisi keşfedilerek, kimyasal tanımlama yapılır ve iki boyutlu uzay üzerinde bulunan hedeflenen analitler bilinir. Hedeflenen tepeler şablonu daha sonra inşa edilir ve aynı analitik toplu işlem içinde elde edilen bir dizi kromatograma uygulanır. Saklama süreleri, spektral imzalar ve yanıtlarla ilgili meta veriler (mutlak ve göreli), hedeflenen tepelerin yeniden hizalanmış desenlerinden ayıklanır ve örnek kümedeki kompozisyon farklılıklarını ortaya çıkarmak için benimsenmiştir.

İşlemin ek, benzersiz bir adımı olarak, parmak izi potansiyelini hem bilinen hem de bilinmeyen analitlere genişletmek için önceden hedeflenmiş kromatogramlarda birleşik hedefsiz ve hedefli (UT) parmak izi de gerçekleştirilir. İşlem, büyük ölçüde otomatikleştirilmiş gerçekten kapsamlı bir karşılaştırmalı analiz için bir UT şablonu üretir.

Son adım olarak, yöntem, yüksek ve düşük elektron iyonizasyon enerjileri (70 ve 12 eV) ile üretilen iki paralel dedektör sinyalinde özelliklerin çapraz hizalamasını gerçekleştirir.

Protokol, tek bir kromatogramın veya bir kromatogram kümesinin ve değişken kromatografi ve/veya çoklu dedektörlerin analizlerini desteklemede oldukça esnektir. Burada protokol, bir MS kitaplığı ve arama yazılımı ile birlikte ticari olarak kullanılabilen bir GC×GC Yazılım paketi (bkz. Malzeme Tablosu)ile gösterilmiştir (bkz. Gerekli araçlardan bazıları diğer yazılımlarda mevcuttur ve benzer araçlar Reichenbach ve iş arkadaşları 15 , 16 ,17^,18,19tarafından literatürdeki açıklamalardan bağımsız olarak uygulanabilir. Gösteri için ham veriler, yazarların laboratuvarında yapılan sızma zeytin (EVO) yağı üzerine yapılan bir araştırma çalışmasından türetilmiştir¹⁴. Özellikle, İtalyan EVO yağlarının uçucu fraksiyonu (yani volatilom), headspace solid phase microextraction (HS-SPME) tarafından örneklenmiş ve numunelerin kalitesi ve duyusal yeterliliği için tanısal parmak izlerini yakalamak için GC×GC-TOF MS tarafından analiz edilir. Numuneler, örnekleme koşulları ve analitik kurulum ile ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda verilmiştir.

Adım 1-6 kromatogramların ön işlemesini açıklar. Adım 7-9, bireysel kromatogramların işlenmesini ve analizini açıklar. 10-12 arası adımlar, çapraz örnek analizinin temeli olan şablon oluşturma ve eşleştirmeyi açıklar. 13-16. adımlar, ut analizi için 14-16 adımlarıyla protokolün bir kromatogram kümesine uygulanmasını açıklar.

Protokol

1. Ham verilerin içe aktarıcı

NOT: Bu, görselleştirme ve işleme için iki boyutlu bir raster dizisi oluşturur.

1. Görüntü yazılımını başlatın.
2. Dosya | Seç İthalat; GC×GC-TOF MS sistemi tarafından alınan "VIOLIN 101.lsc" ( Tamamlayıcı Dosya1)adlı ham veri dosyasına gidin ve seçin; ardından Aç 'ıtıklatın. Kromatogram bu yazılımda açılır.
   NOT: Ham veri dosyası formatı cihaz üreticisine bağlıdır. Yazılım, kullanıcı kılavuzunda listelenen çeşitli dosya biçimlerini içe aktarır.
3. İçe Aktar iletişim kutusunda Modülasyon Dönemi'ni (P_M) 3,5 sn olarak ayarlayın; ardından Tamam'ı tıklatın.
   NOT: Bazı edinme yazılımları modülasyon dönemini kaydetmeyebilir.
4. Dosya | Seç Resmi Farklı Kaydet; istediğiniz klasöre gidin; "Oil 1 RAW.gci" (Ek Dosya 2)adını girin; ardından Kaydet 'itıklatın.

2. Modülasyon aşamasının kaydırılması

NOT: Bu, modülasyon döneminin sonunu bir sonraki modülasyon döneminin boşluk süresine saran tepeler de dahil olmak üzere, her modülasyon döngüsündeki tüm zirveleri aynı görüntü sütununa koyar²⁰.

1. İşleme | Seç Vardiya Aşaması.
2. Vardiya Aşaması iletişim kutusunda, Vardiya Tutarı'nı -0,8 sn olarak ayarlayın; ardından Tamam'ı tıklatın.

3. Temel düzeltme²¹

1. Grafik | Seç Dikdörtgen Çizin.
2. Görüntüde tepe noktası algılanmayan bir dikdörtgen çizmek için tıklatıp sürükleyin.
3. Araçlar | Seç Verileri Görselleştirin; dedektör sinyalinin ortalama ve standart sapması dikkate, burada, 21.850 ± 1.455 SD birimsiz dijital numara (DN); ardından aracı kapatın.
4. İşleme | Seç Doğru Taban Çizgisi.

4. Kromatografik görüntünün bir değer haritası ve renk haritası kullanarak renklendirimi²⁰

1. Görünüm |'ni seçin Renklendir.
2. Renklendir iletişim kutusunda İçeri/Dışarı Aktar sekmesini seçin; ek malzeme olarak sağlanan #AAAA (Tamamlayıcı Dosya 3) özel renk haritasını seçin; ardından İçeri Aktar'ı tıklatın.
3. Değer Eşleme denetimlerinde, değer aralığını en düşük ve en büyük değerlere ayarlayın; ardından Tamam'ı tıklatın.

5. Analizler için ²D tepe noktası (yani bloblar)^{algılaması 18}

1. İşleme | Seç Blob'ları varsayılan ayarlarla algıla; ardından, bazı zirvelerin bölündüğünü ve sahte algılamalar olduğunu gözlemleyin.
2. | Yapılandır'ı seçin Ayarlar | Blob Algılama; ardından Yumuşatma'yı ilk boyut için 0,1 ve ikinci boyut için 2,0 olarak ayarlayın ve Minimum Hacim'i (yani, toplam değerler için eşik) 1,00 E6 olarak ayarlayın; ardından Tamam'ı tıklatın.
3. İşleme | Seç Blob'ları yeni ayarlarla algıla; ardından, iyileştirmeleri gözlemleyin.

6. ²D tepeler filtrasyonu

NOT: Bu, ¹D boyunca sütun taşmaları ve ²D boyunca çarpmalar veya kuyruklar nedeniyle anlamsız algılamaları otomatik olarak kaldırmak için yapılır.

1. İşleme | Seç Etkileşimli Blob Algılama.
2. Blob algılama ayarlarına dikkat edin; ardından Algıla'ya tıklayın.
3. Gelişmiş Filtre oluşturucusunda Ekle 'yitıklatın; ardından, Yeni Kısıtlama iletişim kutusunda Bekletme II'yi seçin; ardından Tamam'ı tıklatın.
4. Kısıtlama kaydırıcılarında, filtrenin gerçek tepeleri kaybetmeden yanlış tepe sayısını azaltmak için minimum ve en fazla ²D saklama sürelerini ayarlayın.
5. Uygula 'yıtıklatın; ardından, algılama ayarlarına yeni filtreyle kaydetmek için Evet'i tıklatın.
   NOT: İyon pik algılama veya ortak elutionlar için dekonvolüs¹⁹gibi belirli algılama sorunlarıyla başa çıkmak için daha gelişmiş araçlar gerekebilir.

7. Doğrusal tutma endeksleri kalibrasyonu

NOT: Bekletme dizini (RI) standartları kümesinde (genellikle n-alkanes) belirli saklama süreleri için bu adım²² (I^T)gerçekleştirin.

1. | Yapılandır'ı seçin RI Tablo | Bekletme Dizini (Col I).
2. RI Tablosu Yapılandırması iletişim kutusunda İçeri Aktar'ı tıklatın; ardından, "LRI tablo.csv" - (Tamamlayıcı Dosya 4)adlı RI kalibrasyon dosyasını (ad, saklama süresi ve bekletme dizini ile CSV biçiminde) seçin.
3. Dosya | Seç Resim A'yı kaydedin. İstediğiniz klasöre gidin; "Oil 1 LRI CALIBRATED.gci" (Ek Dosya 5)adını girin; ardından Kaydet 'itıklatın.

8. NIST17 MS kitaplığındaki tepe spektrumunu arama²³

1. | Yapılandır'ı seçin Ayarlar | Kitaplık 'ı arayın.
2. Arama Kitaplığı iletişim kutusunda Spektrum Türünü En Yüksek MS' e, Yoğunluk Eşiğini 100'e, NIST Arama Türünü Basit (Benzerlik), NIST RI Sütun Türünü Standart Kutupsal'a ve NIST RI Toleransını 10olarak ayarlayın; ardından Tamam'ı tıklatın. NIST MS Search, burada varsayılan olarak ayarlanmış birçok başka ayar sunar.
3. İşleme | Seç Tüm Bloblar için Kitaplık 'ı arayın.

9. Analiz tanımlamalarını gözden geçirin ve düzeltin

1. Araç paletinde imleç modunu Blob | olarak ayarlayın Bloblar 'ı seçin.
2. Görüntü görünümünde, istediğiniz tepeye sağ tıklayın.
3. Blob Özellikleri iletişim kutusunda blob özelliklerini inceleyin; ardından, Hit List'i tıklatın.
4. Ölüm listesini inceleyin; ardından, kimlik yanlışsa, doğru tanımlamanın yanındaki onay işaretini seçin.
5. Blob Özellikleri iletişim kutusunda, kimyasal sınıfı ve istenen diğer meta verileri belirlemek için Grup Adı'nı girin; ardından Tamam'ı tıklatın.
6. Dosya | Seç Resmi Farklı Kaydet; istediğiniz klasöre gidin; "Oil 1 COLORIZED for Template construction.gci"(Ek Dosya 6)adını girin; ardından Kaydet 'itıklatın.
   NOT: Bu dosya, 10.

10. Hedeflenen zirvelere sahip bir şablon oluşturun¹⁵

1. Görüntü görünümünde (9.1 adımından blobları seçme modunda) ilk tepeye tıklayarak istediğiniz zirveleri seçin ve CTRL + ek tepelere tıklayın.
2. Araç paletinde Şablona Ekle düğmesini tıklatın.
3. Şablon tamamlandığında Dosya | Şablonu Kaydet; klasör ve dosya adını belirtin; ardından Kaydet 'itıklatın.
4. Dosya | Seç Resmi Kapat.
   NOT: Bu noktada, bu talimatlar "Hedeflenen tamplate.bt" (Tamamlayıcı Dosya 7)olarak kullanılabilen istenen hedef zirveleri içerecek şekilde oluşturulan şablonla devam eder.

11. Şablonu eşleştirin ve uygulayın

NOT: Eşleştirme, algılanan tepelerdeki şablon desenini yeni bir kromatogram tanır. Şablondan yeni kromatogramda eşleşen kümelerin kimliklerini ve diğer meta verileri uygulama.

1. Dosya | Seç Resmi Aç; "Oil 2 COLORIZED.gci" (Tamamlayıcı Dosya 8) kromatogram dosyasına (önceden işlenmiş) gidin ve seçin; ardından Aç 'ıtıklatın.
2. Araç paletinde imleç modunu Şablon | olarak ayarlayın Nesneler 'i seçin.
3. Şablon | Seç Şablonu Yükle.
4. Şablonu Yükle iletişim kutusunda Gözat'ı tıklatın; hedeflenen tepeler şablonuna gidin ve seçin "Hedeflenen template.bt" ( TamamlayıcıDosya 7); ardından Aç 'ıtıklatın.
5. Şablonu Yükle iletişim kutusunda Yükle'yi tıklatın ve sonra Kapat 'ı tıklatın.
6. Görüntü görünümünde, şablon zirvesine sağ tıklayın; ardından, qCLIC ve başvuru MS dahil olmak üzere nesne özelliklerini inceleyin.
7. Şablon | Seç Etkileşimli Eşleştirme ve Dönüştürme Şablonu.
8. Etkileşimli Eşleştirme arabiriminde, Tümünü Eşleştir'i tıklatın; ardından, eşleşen sonuçları hem tabloda hem de her şablon zirvesinin doldurulmamış dairelerle işaretlenmiş olduğu görüntüde gözden geçirin ve bir eşleşme yapılırsa, algılanan tepe için doldurulmuş bir daireye bağlantı vardır.
9. Eşleşmeleri istediğiniz gibi düzenleyin; memnun kaldığında, meta verileri şablondan kromatograma aktarmak için Uygula'yı tıklatın.
   NOT: qCLIC gibi eşleşen kısıtlamalar, yeni kromatogramın algılanan zirveleri arasında doğru deseni eşleştirmeye yardımcı olur. Kısıtlama parametreleri, şablon başvurusu olarak kullanılan MS imzasının türünü (en yüksek MS veya blob MS) ve spektral benzerlik için eşik değerlerini (Doğrudan Eşleşme Faktörü (DMF) ve Ters Eşleşme Faktörü (RMF)) içerir. Burada parametreler, yanlış negatif eşleşmeleri sınırlamak için önceki çalışmalar^13,14 temel alınarak ayarlanır: en yüksek MS ve DMF ve RMF benzerlik eşiği 700.

12. Şablonu önemli ölçüde farklı kromatografi için dönüştürün

NOT: Kromatografik koşullar şablonun yeni bir kromatogramla yanlış hizalanabilmesine neden olmadıkça( örneğin, uzun süreli çalışmalarda veya yeni bir sütun yüklendikten sonra) bu adım gerekli değildir. Bu gibi durumlarda, şablon yeni kromatogram^12,13'edaha iyi uyacak şekilde kromatografik tutma süreleri düzleminde geometrik olarak dönüştürülebilir. Bu örnekte, şablonun ve kromatogramın tepe desenleri benzerdir, ancak farklı kromatografik koşullar için görüleceği gibi tutma süreleri geometrisinde farklılık gösterir.

1. Hedeflenen şablon 2.bt (Tamamlayıcı Dosya 9) için gezinmek, seçmek ve yüklemek dışında 11.2–11.5adımlarınıyineleyin.
2. Şablon | Seç etkileşimli eşleştirme şablonu; ardından Dönüşümü Düzenle 'yitıklatın.
3. Şablonu Dönüştür arabiriminde, şablonu algılanan tepelerle daha iyi hizalamak için ¹D ve ²D ölçeklerini, çevirileri ve makasları değiştirir; ardından Şablonu Dönüştür 'ütıklatın.
4. Dönüştürülmüş şablonla, Eşleşmeyi Düzenle 'yitıklatın; ardından, 11.8–11.9 adımlarını yineleyin.

13. Bir kromatogram kümesinde birleştirilmiş hedefsiz ve hedefli analiz gerçekleştirin

NOT: Bir renklendirici kümesinin her biri ile eşleştirildiğinde, birdizi kromatogramla eşleştirildiğinde, hedeflenmemiş ve hedeflenen analitler arasında yazışmalar oluşturduğunda, desen tanıma için tutarlı çapraz örnek özellikleri ayıklanır.

1. Setteki tüm kromatogramlar (örneğin, yağların 2 D kromatogramları) için ön işleme (adım 1-6) ve UT şablonu eşleştirmesi (adım ^11.1–11.9)gerçekleştirin. Alternatif olarak, bu adımı burada açıklanamayan proje yazılımı veya benzer yazılımlarla otomatikleştirin.
2. Araştırmacı yazılımını başlatın.
3. Dosya | Seç Açık analiz; ardından, "Feature Jove su 70 eV.gca"(Ek Dosya 10)seçeneğini belirleyin ve açın.
4. Sonuçları açmak ve incelemek için Tamam'ı tıklatın.
5. Belirli analitlerin (yani, ilişkili kimyasal adlara sahip hedeflenen analitler) veya tüm kromatogramlara hizalanmış (#) tanımlayıcılara sahip hedeflenmemiş analitlerin ölçüm değerlerini ve istatistiklerini gözden geçirmek için Bileşikler sekmesine tıklayın, ardından aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Kromatogramlardaki belirli ölçümlerin değerlerini ve istatistiklerini gözden geçirmek için Öznitelikler sekmesine tıklayın.
   2. Hem bileşiklerin hem de özelliklerin özet istatistiklerini gözden geçirmek için Özet sekmesine tıklayın. Kromatogramlar, bu durumda İtalya'nın iki farklı bölgesinde hasat edilen zeytinlerden üretilen yağlarda olduğu gibi farklı sınıflardansa, Özet sekmesinde, sınıflar arasında ayrım yapma özelliklerine ilişkin içgörüler sağlayan Fisher oranı istatistikleri (F ve FDR) listelenir.
   3. Tüm sekmelerde çeşitli grafikleri görüntüleyin ve istenirse Öznitelikler sekmesinde Asıl Bileşen Analizi (PCA) gerçekleştirin.

14. Paralel MS analizi için UT şablonını değiştirme

NOT: Analiz hem 70 eV hem de 12 eV (yani yüksek ve düşük) elektron iyonlaşma enerjileri^26,27ile gerçekleştirilmesiyle gerçeklenmiştir.

1. 12 eV kromatogramdan birini açın, örneğin, "Oil 1 12 eV RAW.gci" (Tamamlayıcı Dosya 11),ön işleme gerçekleştirin (adım 1-6) ve 11.1-11.6 adımlarında açıklandığı gibi UT şablon "UT şablonu 70 relaxed.bt" (Ek Dosya 12) yükleyin. Dosyalar ek malzeme olarak sağlanır.
2. Gerekirse, şablonu 12. Burada, tandem sinyalleri çoklanmış olduğundan önemli bir yanlış hizalama yoktur. Bununla birlikte, farklı iyonlaşma ayarlarının farklı parçalanmalar ürettiğinden, DMF ve RMF spektral benzerliği üzerindeki qCLIC kısıtlamaları için kısıtlamaları gevşetmek gerektiği belirtilmelidir (burada gösterilmez).
3. Dosya | Seç Şablonu Kaydet; klasör ve dosya adını belirtin, örneğin, "UT şablon 12.bt" (Tamamlayıcı Dosya 13); ardından Kaydet 'itıklatın.

15. 12 eV kromatogramda birleşik hedefsiz ve hedefli analiz gerçekleştirin

1. Dosya | Seç Açık analiz; ardından "Feature Jove su 12 eV.gca" - Ek Dosya 14 dosyasını seçin ve açın.
2. Sonuçları açmak ve incelemek için Tamam'ı tıklatın.
3. Metrik değerleri gözden geçirmek için Bileşikler sekmesine tıklayın, belirli analitler (yani, ilişkili kimyasal adlara sahip hedeflenen analitler) veya tüm kromatogramlara hizalanmış (#) tanımlayıcılara sahip hedeflenmemiş analitler için 12 eV yanıtına ve istatistiklerine bakın, ardından aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. Kromatogramlardaki belirli ölçümlerin değerlerini ve istatistiklerini gözden geçirmek için Öznitelikler sekmesine tıklayın.
   2. 12 eV'de hem bileşiklerin hem de özelliklerin özet istatistiklerini gözden geçirmek için Özet sekmesine tıklayın. Kromatogramlar, bu durumda İtalya'nın iki farklı bölgesinde hasat edilen zeytinlerden üretilen yağlarda olduğu gibi farklı sınıflardansa, Özet sekmesinde, sınıflar arasında ayrım yapma özelliklerine ilişkin içgörüler sağlayan Fisher oranı istatistikleri (F ve FDR) listelenir.
   3. Tüm sekmelerde kullanılabilen çeşitli grafikleri görüntüleyin ve istenirse Öznitelikler sekmesinde Asıl Bileşen Analizi (PCA) gerçekleştirin.

Sonuçlar

GC×GC-TOF MS desenleri yüksek kaliteli sızma zeytinyağı volatilomları, 100 sinyal-gürültü oranı (SNR) eşiğinin yaklaşık 500 ²D zirvesini sergiler. Böyle bir eşik, gıda uçucuları¹⁴,²⁷ üzerinde daha önce yapılan^{araştırmalarla,}karşılaştırmalı analiz için güvenilir spektrum elde etmek için eşik üzerindeki minimum göreceli sinyal olarak tanımlanmıştır. Bileşenler kromatografik alan üzerinde, iki kromatografik boyuttaki göreceli tutmalarına göre ve özellikle ¹D'deki volatilitelerine/polaritelerine ve ²D'deki volatilitelerine göre dağıtılır. Burada sütun kombinasyonu kutupsal × yarı kutupludur (yani Carbowax 20M × OV1701).

²B deseni yüksek derecede düzen gösterir. Homolog seriler ve sınıflar için göreli tutma desenleri Şekil 1A'da doğrusal doymuş hidrokarbonlar (siyah), doymamış hidrokarbonlar (sarı), doğrusal doymuş aldehitler (mavi), mono doymamış aldehitler (kırmızı), çoklu doymamış aldehitler (somon), birincil alkoller (yeşil) ve kısa zincirli yağ asitleri (cyano).

Tespit edilen ^2Btepeler daha sonra tüm ²D zirvesinden(blob spektrumu) veya en büyük spektrumdan(apeks spektrumu) çıkarılan ortalama MS spektrumu karşılaştırılarak tanımlanabilir. Şekil 2, blob 5 için apex spektrum aramasının çıktısını gösterir ve (E)-2-onaltılık için yüksek benzerlik eşleşmesi (ilk 10 isabet) döndürür. Araştırılan veritabanları, yöntemin 8.

Kimlik, etkin bekletme dizini oluşturma tarafından doğrulanır. Deneysel I^T değeri ²D tepeler için hesaplanmıştır, böylece bu aşamada kütüphane araması tutarlı tablolu I^Tdeğerleriyle sonuçlara öncelik verir. Tolerans pencereleri analist deneyimine, referans veritabanı değerlerinin sabit aşamaya göre güvenilirliğine ve uygulanan analitik koşullara göre özelleştirilebilir. n-alkanes ile deneysel kalibrasyon olmadan doğrusal tutma endekslerinin akıllı kalibrasyonu için yeni araçlar, yakın zamanda Reichenbach ve^ark.

Tanımlanan ²B tepelerinin (yani hedeflenen zirvelerin) toplanması, tüm örnek kromatogramlarda aynı bileşik arasında güvenilir yazışmalar oluşturmak için hedeflenen zirvelerin bir şablonunun oluşturulması için benimsenebilir. Hedeflenen şablon tepelerinin koleksiyonu Şekil 1B'de görselleştirilmiştir. Kırmızı daireler, bağlantı hatlarına sahip şablon zirvelerine bağlı iki İç Standart (IS) dahil olmak üzere hedeflenen 196 bileşiklere karşılık gelir. IS yanıt normalleştirme için kullanılır ve bağlantı hatları, her ^2Btepe/blob yanıtını normalleştirmek için dahil edilen IS'den hangisinin benimseneceğini görselleştirmeye yardımcı olur.

Şekil 1B'de, doldurulmuş daireler şablon zirvesi ile gerçek desen arasındaki pozitif eşleşmeleri gösterirken, boş daireler yazışmaların doğrulanmamış şablon zirveleri içindir. Yanlış negatif eşleşmeler, eşik parametrelerinin, referans spektrumlarının ve kısıtlama işlevlerinin^{13 , 14,}18^,19'unuygun seçimi^ilesınırlanabilir. Birden çok elution içeren karmaşık desenler için, spektral dekonvolüasyona dayanan iyon tepe algılama işlevleri tavsiye edilir ve geçerli bir seçenek olabilir¹⁹. Şablon tepe meta verileri, (E)- 2-onaltılık için Şekil 1B'nin genişletilmiş panelinde gösterilir.

Şablon eşleştirmenin özgüllüğü, algoritmanın arama penceresine düşen, belirli bir eşiğin üzerinde MS spektral benzerliğine sahip olan aday zirveleriyle pozitif yazışmaları sınırlayan kısıtlama işlevleri uygulama olanağına dayanır. Bu durumda, adım 11'de, yanlış negatif eşleşmeleri sınırlayan en uygun parametreleri tanımlamayı amaçlayan önceki denemelere göre²³ benzerlik eşikleri 700 olarak ayarlanmıştır¹⁴. Şekil 1B'deki şablon tepe özelliklerinin vurgulanan alanları, başvuru MS spektrum dizesi ve qCLIC kısıtlama işlevi (örneğin, (Eşleştir("

Şablonu bir kümenin tüm kromatogramlarına uygulayarak, desenlerin kısmi yanlış hizalanması durumunda olduğu gibi zorlu durumlarla karşılaşabilirsiniz. Bunun nedeni fırın sıcaklığı tutarsızlıkları, taşıyıcı gaz akışı/basınç dengesizlikleri veya kolon ikamesi veya modülatör döngü kılcal damar değişimi durumunda olduğu gibi sisteme manuel müdahale^14,28olabilir. Şekil 3, hedeflenen şablon ile gerçek kromatogram arasında kısmi bir yanlış hizalama durumunu gösterir. En az yanlış hizalama için etkileşimli şablon dönüşümleri(Şekil 3, kontrol paneli) şablon tepelerini daha iyi bir uyum için yeniden konumlandırabilir. Yeniden konumlandıktan sonra, şablon yazışmaları oluşturmak için eşlenebilir. Örnekte, şablon (Şekil 3, adım 12) gerçek ²B deseniyle doğru şekilde eşleşir. Burada tartışılmayan ciddi yanlış hizalamalar durumunda, eşleşme dönüştürme-güncelleştirme eylemlerinin tekrarlanması, şablon tepe noktası konumunu gerçek tepe^{deseni 12 , 13,14}'e yinelemeli olarak uyarlayabilir.

Burada, hedeflenen tepeler (yani bilinen analitler) kromatografik sonucun yaklaşık% 40'ını sağlar (ortalama olarak yaklaşık 500 tespit edilebilir zirvenin 196 hedeflenen zirvesi). Bileşiklerin diğer %60'ı, getirdikleri bilgilerle birlikte, hedeflenen analizlerde dikkate alınmaz. Soruşturmayı gerçekten kapsamlı hale getirmek için, hedefsiz ²D zirvelerinin tutarlı çapraz hizalaması da kurulmalıdır. Şablon eşleştirmenin tüm tespit edilebilir analizlere genişletildiği ilk uygulama kavrulmuş kahvenin karmaşık volatilomu ile ilgilendi⁷. Bu işlem, burada 14-15.

Bu süreçte, üzerinde çalışılan örneklem kümesine ait önceden hedeflenmiş görüntüler (20 örnek), tüm görüntü desenlerinin çapraz eşlemli olarak güvenilir zirveleri tanımlamak için^{kullanılır 29}. Daha sonra, özellik şablonu^17'deUT güvenilir zirvelerini ve tepe bölgelerini (yani ²D tepe ayak izini) tanımlayabileceğiniz bileşik bir kromatogram oluşturulmuştır.

70 eV'de elde edilen analizler için süreç, 76'sını hedeflenen zirveler listesine ait olan²⁹'luk rahat güvenilirlikle 144 güvenilir zirve belirledi. Bu 144 güvenilir tepe noktasına dayanarak, işlem tüm kromatogramları güvenilir tepelerin ortalama tutma süreleriyle tutarlı bir şekilde hizalar ve daha sonra bunları birleştirerek bileşik bir kromatogram oluşturur. Şekil 4, yağın üretim bölgesine (solda) ve her numunedeki (sağda) güvenilir tepe/blob hacimlerinin listesine göre etiketlenmiş tüm örneklerin listesini gösterir.

Hedefsiz özellik şablonu, Şekil 5A'dagösterilen bileşik kromatogramda algılanan ve güvenilir tepeler şablonuyla eşleşen analitlerden ²D tepelerden oluşur (n = 168 – hedeflenen tepeler için kırmızı daireler ve hedefsiz tepeler için yeşil daireler). Bileşik tepelerin kütle spektrumları ve tutma süreleri, genişlemiş alanda (Z)- 3-hexenol asetat için gösterildiği gibi özellik şablonuna kaydedilir. Tepe bölgeleri Şekil 5B'de kırmızı renkli grafikler olarak gösterilir; bunun yerine, bileşik kromatogramda ⁽ⁿ= 3578) algılanan tüm 2 D tepelerinin anahatlarıyla tanımlanırlar.

Analiz edilen 20 numunede hedeflenen tepeler dağılımına Ana Bileşen Analizi ile denetimsiz örüntü tanıma uygulandığında, Sicilya ve Toskana yağları kümesi ayrı ayrı pedo-iklim koşullarının ve terroir'in uçucuların göreceli yaygınlığını etkilediğini düşündürmektedir. Sonuçlar Şekil 6A'da, güvenilir tepeler dağılımından elde edilen PCA sonuçları şekil 6B'degösterilmiştir. İki yaklaşım, farklı coğrafi alanlardan gelen yağların farklı olduğunu çapraz doğrularken, hedefli veya hedefsiz bileşikler veya her ikisi de tutarlı, kimyasal imzalar eşlenir.

Son olarak, yazılım, desenlerin paralel algılama kanallarında hızlı ve etkili bir şekilde yeniden hizalanmasını sağlar. Bu uygulamada, tandem iyonlaşma sinyalleri için yeniden hizalama önerilir. MS'in iyon kaynağı, kanal başına 50 Hz alım frekansı olan iki iyonlaşma enerjisi (yani, 70 ve 12 eV) arasında^{çoklayıcıdır.} Elde edilen iki kromatografik desen, spektral veriler (yani spektral imzalar ve yanıtlar) farklı dinamik yanıt aralıklarına sahip tamamlayıcı bilgiler getirirken^26,27. Hizalanmış desenler, özelliklerin⁽²D tepe noktaları ve tepe bölgeleri) tek eşli kimliklerle (yani, hedeflenen tepeler için kimyasal adlar ve hedeflenmemiş tepeler ve tepe bölgeler için benzersiz numaralandırma # ) ayıklanmasına izin verir.

Şablon eşleştirme etkili çapraz hizalama sağlar. Bu durumda, çok fazla yanlış hizalama yoktur, ancak UT zirveleri için eşleşmelere izin vermek için MS kısıtlamaları gevşetilmelidir. Öte yandan, MS kısıtlaması olmayan öne çıkan UT tepe bölgeleri, yanlış negatif eşleşmeler olmadan hemen eşleştirilir. Şekil 5C, 70 eV verisinden oluşturulan özellik şablonunun eşleştiği 12 eV kromatogramın genişletilmiş bir alanını gösterir. Güvenilir UT tepeleri, düşürülen qCLIC kısıtlamaları nedeniyle pozitif olarak eşleştirilir (örneğin, 600'deki DMF eşiği). Not etmek için, 12 eV'de, düşük iyonlaşma enerjisinin neden olduğu sınırlı parçalanma nedeniyle daha az tespit edilmiş tepe vardır.

Şekil 1: çift boyutlu kontur çizimi ve hedeflenen şablon. (A) Toskana'dan sızma bir zeytinyağının uçucu kısmının kontur arsası. Homolog serisinin ve sınıflarının sıralı desenleri farklı renk ve çizgilerle vurgulanır: doğrusal doymuş hidrokarbonlar (siyah çizgi ve ²D konturlar) doymamış hidrokarbonlar (sarı), doğrusal doymuş aldehitler (mavi) mono doymamış aldehitler (kırmızı), çoklu doymamış aldehitler (somon), birincil alkoller (yeşil) ve kısa zincirli yağ asitleri (cyano). (B) İç Standartları (IS) birbirine bağlayan bağlantı hatları ile bilinen analitlerin (kırmızı renkli daireler) hedeflenen şablonunun üzerine bindirilmiş. Paneller ^2Btepe/blob özellikleri meta verilerini (Decanal) veya Şablon tepe özelliklerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Apex MS araması. Blob 5 için apex MS aramasının çıktısı. Kitaplıktan kullanılabilen en yüksek benzerlik eşleşmesi ve ilgili meta verilere sahip veritabanı girdilerinin listesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Şablon yeniden hizalama. Şablonun dönüşüme göre yeniden hizalanmasına izin veren adımları gösteren iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: GC Araştırmacı arayüzü. Yağın üretim bölgesine (solda) ve her örnekteki güvenilir tepe/blob hacimlerinin listesine (sağda) göre etiketlenmiş tüm seçilmiş görüntülerin yer alan araştırmacı paneli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hedeflenen ve UT şablonu. (A) 11. adımda otomatik işlemeden kaynaklanan güvenilir zirveler; kırmızı daireler bilinen analitlere karşılık gelirken, yeşil daireler bilinmezliklerdir. Üst üste bindirilmiş panelde, (Z)-3-onaltılık için şablon nesnesi özellikleri gösterilir. (B) UT şablonunun UT tepelerini (kırmızı ve yeşil daireler) ve tepe bölgelerini (kırmızı grafikler) gösteren genişlemiş alan, 70 eV iyonizasyon enerjisinde elde edilen örnek bir yağ üzerinde eşleşir. (C) UT şablonu, 12 eV iyonizasyon enerjisinde elde edilen bir numune yağı ile eşleşti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: PCA yükleme çizimleri. Numunelerin (Toskana ve Sicilya'dan gelen yağlar) doğal uyumunu gösterirler, çünkü(A)hedeflenen tepe dağılımı veya (B) UT tepe dağılımı ile sonuçlanırlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

GC×GC-TOF MS verilerinin görselleştirilmesi, kapsamlı iki boyutlu ayrımlarla elde edilen sonuçların uygun bir şekilde anlaşılması için temel bir adımdır. Özelleştirilmiş renklendirmeye sahip görüntü çizimleri, analistlerin dedektör tepki farklılıklarını ve dolayısıyla örnek bileşenlerin diferansiyel dağılımını takdir etmelerini sağlar. Bu görsel yaklaşım, analistlerin kromatogramların yorumlanması ve detaylandırılmasına bakış açısını tamamen değiştirir. Kromatograflar tarafından anlaşıldıktan ve güvenle kullanıldığında atılan bu ilk adım, daha fazla işlemede yeni bir bakış açısı açıyor.

Veri işlemenin bir diğer temel yönü, her biri tek bir dedektör olayına karşılık gelen tüm örnek noktalar için tam veri matrisine (ms spektral verileri ve yanıtları) erişilebilirliktir. Bu açıdan ²D entegrasyonu zirveye çıkar, böylece tek bir analyte karşılık gelen dedektör olaylarının toplanması kritik bir adımı temsil eder. Mevcut protokolde, ²D tepe algılama, kısmi birlikte hareket eden bileşikler durumunda algılama hassasiyetini artırmak için bazı uyarlamalarla birlikte havza algoritması^18'e dayanmaktadır. Bu işlemi daha spesifik hale getirmek için, dekonvolüzyon yapılmalı ve daha karmaşık prosedürler benimsenmelidir. Bu, MS verileri için bir iyon tepe algılaması gerçekleştirerek mümkündür; algoritma veri dizisini işler ve spektral profiller^19,31'e dayanarak yanıtı tek analitlerden izole eder.

Protokolün ve herhangi bir GC×GC-MS veri yorumlama işleminin önemli ama kritik bir adımı, analiz tanımlaması ile ilgilidir. 8. ve 9. adımlarda önerilen bu prosedür, özgün standartlara sahip doğrulayıcı bir analiz olmadığında, analist tarafından dikkatle yapılmalıdır. Otomatik eylemler herhangi bir ticari yazılımda mevcuttur; toplanan referans spektrumlarına (yani spektral kütüphanelere) karşı MS spektral imza benzerliği değerlendirmesini ve niteleyici/nicelik belirteci iyonları arasındaki karakteristik oranların değerlendirilmesini içerir. Bununla birlikte, izomerlerin tanımlanmasını netlaştırmak için ek doğrulayıcı kriterler gereklidir. Protokol, aday listesine öncelik vermek için doğrusal bekletme dizinlerinin benimsenmesini önerir; buradaki sınır, saklama verilerinin kullanılabilirliği ve tutarlılığı ile ilgilidir.

Bu yaklaşımı benzersiz kılan temel^{özellik, 12 , 13,15,29}ile eşleşen şablondur. Şablon eşleştirme, ²B desen tanımayı çok etkili, spesifik ve sezgisel bir şekilde sağlar. Analist dönüştürme işlevi parametreleriyle etkin bir şekilde etkileşim kurarak yordamı denetleyebilirken, özelleştirilmiş eşik değerleri ve/veya kısıtlama işlevleri uygulanarak duyarlılık ve özgüllük açısından ayarlanabilir. Bu işlemin özelliği, hedefli ve hedefsiz tepe bilgilerini tek tip bir partinin örnekleri arasında, aynı zamanda orta ila şiddetli yanlış hizalamaya rağmen aynı nominal koşullarla elde edilen numuneler arasında çapraz hizalama olasılığına dayanır. Bu işlemin avantajları, analist için zaman alıcı bir görev olan tüm hedeflenen analit tanımlamalarını ve önceki detaylandırma oturumlarından hedeflenen ve hedeflenmemiş zirveler için kaydedilen tüm meta verileri koruma olasılığıyla ilgilidir.

Şablon eşleştirme, hesaplama süresi açısından da çok etkilidir; düşük çözünürlüklü MS veri dosyaları yaklaşık 1-2 Gb paketlenmiş veriden oluşurken, yüksek çözünürlüklü MS analizleri tek analitik çalıştırma başına 10-15 Gb'a ulaşabilir. Şablon eşleştirme her seferinde tam veri matrisini işlemez, ancak ilk başta şablon tepelerini kullanarak kromatogramlar arasında saklama süresi hizalaması gerçekleştirir, benzerlikleri için arama penceresindeki aday zirveleri şablondaki referansla eşleştirir. En zorlu durum olan ciddi yanlış hizalama durumunda, küresel ikinci sıra polinom dönüşümleri, hesaplama süresini azaltırken yerel yöntemlerden daha iyi performans gösterir¹³.

GC×GC tekniğinin akademi ve araştırma laboratuvarlarının ötesine yayılması için, veri işleme araçlarının görselleştirme ve kromatogram muayenesi için temel işlemleri kolaylaştırması gerekir; analitlerin tanımlanması, standart algoritmaları ve prosedürleri (örneğin, NIST arama algoritması ve I^T kalibrasyonu) benimseme imkanı sunmalıdır; ve karşılaştırmalı analiz sezgisel, etkili ve etkileşimli araçlarla desteklenmelidir. Önerilen yaklaşım, analizler birlikte verme, çoklu analiz kalibrasyonu, grup tipi analiz ve paralel algılama hizalaması gibi karmaşık durumlarla başa çıkmak için gelişmiş seçenekler ve araçlar sunarken bu gereksinimleri karşılar.

Referansta bulunulan literatür, GC×GC ve daha genel olarak kapsamlı iki boyutlu kromatografinin tek çalıştırmalı analizde ¹D kromatografi ile elde edilemeyecek benzersiz çözümler ve güvenilir sonuçlar sunduğu birçok olası senaryoyu kapsamaktadır. ^5,32,33 GC×GC ayırma kapasitesini ve hassasiyetini artıran en güçlü araç olmasına rağmen, ayırma gücü, hassasiyet ve diğer sistemik kapasitelerde her zaman sınırlamalar vardır. Bu sistemik sınırlara yaklaşıldıkça, veri analizi giderek zorlaşır. Bu nedenle, araştırma ve geliştirme elimizdeki analitik araçları geliştirmeye devam etmelidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min.
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from .	Mega, Legnano, Milan, Italy	PN MEGA-1701
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy	Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14
Gas chromatograph: Model 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC×GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Image processing software	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Mass spectrometer: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, UK
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Modulator controller: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy
Modulator: KT 2004 loop type	Zoex Corporation Houston, TX, USA
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkanes C8-C40 for retention indexing	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Solid Phase Microextraction fiber	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-thujone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314