Análisis y especificación de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento para determinaciones reproducibles y estadísticamente válidas de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón y para especificar las distribuciones de tamaño lognormal de gránulo determinada mediante un formulario multiplicativo de dos parámetros. Es aplicable a todos los análisis de tamaño de gránulos de muestras de almidón a escala de gram para la investigación de la ciencia vegetal y alimentaria.

Resumen

El almidón de todas las fuentes vegetales se compone de gránulos en una gama de tamaños y formas que tienen diferentes frecuencias de ocurrencia, es decir, exhibiendo un tamaño y una distribución de laforma. Los datos de tamaño de gránulo de almidón determinados utilizando varios tipos de técnicas de dimensionamiento de partículas a menudo son problemáticos debido a la mala reproducibilidad o la falta de significación estadística resultante de algunos errores sistemáticos insuperables, incluyendo sensibilidad a las formas de gránulos y límites de tamaños de muestras de gránulos. Delineamos un procedimiento para determinaciones reproducibles y estadísticamente válidas de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón utilizando la técnica de zona de detección eléctrica, y para especificar las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas utilizando una forma multiplicativa de dos parámetros adoptada con mayor precisión y comparabilidad. Es aplicable a todos los análisis de tamaño de gránulos de muestras de almidón a escala de gram, y, por lo tanto, podría facilitar estudios sobre cómo los tamaños de gránulos de almidón son moldeados por el aparato y mecanismos de biosíntesis de almidón; y cómo afectan a las propiedades y funcionalidades de los almidones para usos alimentarios e industriales. Los resultados representativos se presentan a partir de análisis de réplicas de distribuciones de tamaño de gránulo de muestras de almidón de camote utilizando el procedimiento descrito. Además, discutimos varios aspectos técnicos clave del procedimiento, especialmente, la especificación multiplicativa de las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos y algunos medios técnicos para superar el bloqueo frecuente de apertura por agregados de gránulos.

Introducción

Los gránulos de almidón son la estructura física en la que dos polímeros homoglucanos de reserva principal en la fotosíntesis vegetal y los tejidos de almacenamiento, la amilosa lineal o escasamente ramificada y la amiloidpectina altamente ramificada, están embalados ordenadamente junto con algunos componentes menores, incluyendo lípidos y proteínas. Los gránulos de almidón de varias especies vegetales exhiben muchas formas tridimensionales (3D) (revisadas en los puntos^1,2),incluyendo esferas, elipsoides, poliedro, plaquetas, cubos, cuboides y túbulos irregulares. Incluso aquellos del mismo tejido o diferentes tejidos de la misma especie vegetal podrían tener un conjunto de formas con diferentes frecuencias de ocurrencia. En otras palabras, los gránulos de almidón de una especie vegetal pueden tener una distribución característica de la forma estadística, en lugar de una forma específica. Las formas de gránulos no uniformes y no esféricos hacen que sea difícil medir y definir correctamente los tamaños de gránulos de almidón. Además, los gránulos de almidón de los mismos tejidos de una especie vegetal son de una gama de tamaños con diferentes proporciones, es decir, exhibiendo una distribución de tamaño característica. Esta distribución del tamaño complica aún más el análisis y la descripción de los tamaños de gránulos de almidón.

Los tamaños de gránulos de almidón se han analizado utilizando varias categorías de técnicas de dimensionamiento de partículas (revisadas en la referencia^3),incluyendo microscopía, sedimentación/fraccionamiento de flujo de campo estetérico (Sd/StFFF), difracción láser y zona de detección eléctrica (ESZ). Sin embargo, estas técnicas no son igualmente adecuadas para la determinación de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una forma de gránulo y una distribución de tamaño. La microscopía, incluyendo microscopía electrónica ligera, confocal y de barrido, es excelente para los estudios de morfología^4,5,6,7,estructura^8,9 y desarrollo^10,11 de gránulos de almidón, pero difícilmente adecuado para definir sus distribuciones de tamaño debido a algunas deficiencias inherentes. Mediciones directas de imágenes microscópicas de gránulos o análisis de imágenes asistidas por software de datos de microscopía óptica (IAOM), que se han utilizado para la determinación de tamaños de gránulos de almidones de varias especies, incluyendo maíz^12,trigo^13,14,papa¹⁵ y cebada^16,puede medir sólo 1D (generalmente longitud máxima) o 2D (superficie) tamaños de números muy limitados (decenas a unos pocos miles) de imágenes de gránulos de almidón. Los pequeños tamaños de muestreo de gránulos que están inherentemente limitados por las técnicas rara vez podrían ser estadísticamente representativos, teniendo en cuenta los enormes números de gránulos por unidad de peso de almidón (~ 120 x 10⁶ por gramo, asumiendo todas las esferas de 10 μm a 1,5 g/cm³ de densidad), y, por lo tanto, podría conducir a la mala reproducibilidad de los resultados. La técnica Sd/StFFF puede tener alta velocidad y resolución, y fracciones de tamaño estrecho de gránulos de almidón^17,pero rara vez se ha utilizado probablemente porque su precisión podría verse gravemente afectada por daños, diferentes formas y densidad de gránulos de almidón. La técnica de difracción láser es la más utilizada, y se ha aplicado para análisis del tamaño del gránulo de almidón para todas las especies de cultivos principales^3,14,16. Aunque la técnica tiene muchas ventajas, en realidad no es adecuada para determinaciones de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una distribución de forma de gránulo. La mayoría de los instrumentos de difracción láser concurrentes se basan en la teoría de dispersión de luz Mie¹⁸ para partículas esféricas uniformes y la teoría mie modificada¹⁸ para algunas otras formas de uniformidad. La técnica es, por lo tanto, inherentemente muy sensible a las formas de partículas, y no es del todo adecuada incluso para ciertas formas de uniformidad^19,y mucho menos para los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas de diferentes proporciones. La técnica ESZ mide la perturbación del campo eléctrico proporcional al volumen de la partícula que pasa a través de una abertura. Proporciona tamaños de volumen de gránulos, así como la información de distribución de número y volumen, etc., a altas resoluciones. Dado que la técnica ESZ es independiente de cualquier propiedad óptica de partículas como el color, la forma, la composición o el índice refractario, y los resultados son muy reproducibles, es particularmente adecuado para determinar las distribuciones de tamaño de los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas.

Los tamaños de gránulo de almidón también se han definido mediante el uso de muchos parámetros. A menudo fueron descritos simplistamente por diámetros medios, que en algunos casos eran los medios aritméticos de las longitudes máximas microscópicamente medidas de imágenes 2D^12,20, o promedios de diámetros de esfera equivalentes³. En otros casos, las distribuciones de tamaño de gránulo se especificaron utilizando rangos de tamaño^21,22, el volumen medio de distribución o diámetro medio (equivalente a esfera, ponderado por número, volumen o superficie) suponiendo una distribución normal^{14,23,24,25,26}. Estos descriptores de tamaños de gránulos de almidón de varios análisis son de una naturaleza muy diferente, y no estrictamente comparables. Podría ser muy engañoso si estos "tamaños" de gránulos de almidón de diferentes especies o incluso los mismos tejidos de la misma especie fueran comparados directamente. Además, el parámetro de dispersión (o forma) de las distribuciones normales asumidas, es decir, la desviación estándar σ (o desviación estándar gráfica σ_g)que mide el ancho de la distribución (es decir, la dispersión de los tamaños), se ha ignorado en la mayoría de los estudios.

Para resolver los problemas críticos antes mencionados que enfrentan los análisis de tamaño de gránulos de almidón, delineamos un procedimiento para determinar reproducibles y estadísticamente válidos las distribuciones de tamaño de gránulo de muestras de almidón utilizando la técnica ESZ, y para especificar correctamente las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas utilizando una forma multiplicativa de dos parámetros adoptada²⁷ con mayor precisión y comparabilidad. Para la validación y demostración, realizamos análisis de tamaño de gránulo de réplica de muestras de almidón de camote utilizando el procedimiento, y especificamos las distribuciones de volumen diferencial lognormal de volumen-volumen equivalente-esfera de diámetro utilizando sus medios geométricos gráficos y desviaciones estándar multiplicativas s* en una forma ^x/ (multiplicar y dividir).

Protocolo

1. Preparación de muestras de almidón

1. Preparar dos (o tres) muestras de almidón de réplica a escala de gramo de tejidos acumulados por almidón de diversas especies vegetales siguiendo los procedimientos establecidos (por ejemplo, patatas^15,camotes^28,granos de trigo^13,29y granos de maíz^30,etc.).
2. Lave bien las muestras de almidón con acetona o tolueno 3-4x para minimizar los agregados de gránulos y secarlos por completo.
   NOTA: Utilice procedimientos de extracción que produzcan más de 1 g de almidón por preparación. Uno o dos coartadas de 0,5 g de cada uno de los tres o dos extractos de réplica, respectivamente, se muestrean para el análisis de tamaño de gránulos de un extracto de almidón.

2. Preparación de electrolitos

1. Prepare 500 ml de cloruro de litio de 50 g/L en metanol para cuatro tiradas de tamaño para muestras de almidón de replicación (100 ml por carrera más 100 ml adicionales). Preferiblemente, hacer el electrolito en lotes de gran volumen, por ejemplo, de 4 a 8 L a la vez, para minimizar la variación de concentración.
2. Enfríe el recipiente sobre hielo o en un armario de 4 °C para acelerar la disolución del cloruro de litio.

3. Configuración del analizador

1. Elija un tubo de apertura con un rango de diámetro de partículas que cubra el rango de tamaño de gránulo conocido (en la literatura o a través de ejecuciones de ensayo) de muestras de almidón que se analizarán, por ejemplo, una apertura de 100 μm para almidones de camote. Para muestras de almidón de rango de tamaño de gránulo desconocido, seleccione una apertura adecuada a través de ejecuciones de prueba utilizando varios tubos de apertura con rangos de diámetro de partículas superpuestos.
   NOTA: El rango de diámetro de partículas de un tubo de apertura es su rango de tamaño preciso entre el 2 y el 60% de, y con un rango de tamaño extendido al 80% de su diámetro de orificio. En la Tabla 1 se enumeran las propiedades de tres tubos de apertura más útiles para dimensionar gránulos de almidones de cultivos principales. Si el rango de tamaño de gránulo de una muestra de almidón es más amplio que el rango de tamaño de un solo tubo de apertura, realice un análisis de superposición multitubo que combina hasta cinco distribuciones de tamaño de partícula medidas con aberturas de diferentes tamaños. Cada abertura es identificable por su diámetro y número de pieza etiquetados en el tubo. Su diámetro y número de serie contenidos en un código de barras del tubo se pueden escanear en el software del analizador utilizando el Lector de código de barras en el Panel de control del analizador.
2. Eligió un vaso de precipitados analítico de 100 o 200 ml (sobre cubetas) para la determinación de tamaños de gránulos de almidón, y configure la agitación automática (abajo) para mantener una buena suspensión de gránulos durante la medición.
3. Cree un método operativo estándar (SOM) para especificar la configuración de ejecución y un archivo de preferencias para analizar, ver e imprimir los resultados. Combine el archivo SOM y preferences en un procedimiento operativo estándar (SOP) según sea necesario.
   NOTA: Para análisis no estandarizables, utilice SOM para ejecutar los análisis y ajuste la configuración de SOM entre las ejecuciones a través de la ventana Editar SOM (véase más adelante) según sea necesario. Después de la finalización de la ejecución, analice, vea e imprima los resultados de la ejecución cambiando las Preferencias como desee. Para análisis de tamaño de gránulos estandarizables, utilice un SOP para ejecutar los análisis.
   1. Inicie el software del analizador. En el Manu principal, haga clic en SOP | Cree som Wizard o edite el SOM, o en el panel de estado, haga clic en Editar SOM. Utilice el asistente o la ventana Editar SOM para seleccionar la configuración de un SOM. Los ajustes utilizados normalmente para dimensionar gránulos de muestras de almidón de camote se resumen en la Tabla 2.
   2. Guarde el SOM creado en un archivo en la ventana Som Wizard-Summary of Settings, o en la ventana Edit the SOM.
   3. En el Manu principal, haga clic en SOP | Crear asistente de preferencias o Editar preferencias. Utilice el asistente o las pestañas de la ventana de edición Preferencias para seleccionar la configuración de preferencias como las de la Tabla 3 u otras como desee.
   4. Guarde las Preferencias seleccionadas en un archivo en la ventana Crear resumen de configuración del Asistente para preferencias o en la ventana Editar preferencias.
   5. En el menú principal, haga clic en SOP | Crear asistente SOP. Siguiendo la guía paso a paso del asistente, escriba una descripción, seleccione el archivo SOM y Preferencias para crear y guardar unSOP.

4. Análisis de tamaño de gránulos de las muestras de almidón

1. Preparar el analizador
   1. Encienda el analizador, abra el software en el equipo y verifique el estado Listo en la parte superior del Panel de estado después de su conexión automática al analizador.
   2. Llene el frasco de electrolitos con electrolito, vacíe el frasco de residuos si es necesario.
   3. Instale y asegure correctamente el tubo de apertura elegido siguiendo la guía del manual del usuario. Para un tubo de apertura nuevo no calibrado, calibrarlo siguiendo la guía paso a paso en Calibración | Calibrar apertura en el menú principal. Para un tubo de apertura calibrado, verifique la calibración siguiendo la guía paso a paso del Asistente para cambiar tubo de apertura en el | Ejecutar o Calibración| Verifique la calibración de apertura en el menú principal.
   4. Desbloquee la plataforma de ensayo empujando el clip de liberación de bloqueo (en la parte frontal central de la pared del compartimiento de muestra izquierdo) y baje manualmente la plataforma hasta la parte inferior. Coloque un vaso de precipitados analítico que contenga 100 ml de electrolito en la plataforma, mueva el agitador a la posición de agitación y levante manualmente la plataforma hasta la posición superior autobloqueante para sumergir el tubo de apertura y el agitador en el electrolito.
   5. Haga clic en Rellenar en la barra de herramientas del instrumento inferior para que el analizador llene automáticamente el sistema con el electrolito y haga clic en Vaciar para que el analizador vacíe automáticamente el sistema.
   6. Cargue el SOM haciendo clic en SOP | Cargue un SOM en elmenú principal y utilice el SOM para ejecutar un análisis sin un archivo de preferencias. Alternativamente, cargue un SOP haciendo clic en SOP | Cargue un SOP en el menú principal o cargue el SOP en el panel de estado, y utilice el SOP para ejecutar un análisis.
   7. Si utiliza un SOP, haga clic en SOP | información de SOM o información de preferencias en el menú principal para verificar la configuración de SOM y preferencia. Haga clic en | de ejemplo Introduzca Información de ejemplo en el menú principal o Editar información en el panel de estado para introducir la información de ejemplo de la ejecución.
2. Preparar la muestra de almidón-metanol y las suspensiones de tamaño
   1. Pesar dos o uno muestra de 0,5 g de cada uno de los dos o tres extractos de almidón de réplica, respectivamente.
   2. Agregue cada uno de los alíquesas de almidón de 0,5 g a 5 ml de metanol en un tubo centrífugo cónico de 50 ml y disperse completamente los gránulos de almidón utilizando varios pulsos de ultrasonido de baja intensidad (12-24 W/cm²⁾de un procesador ultrasónico.
   3. Con una pipeta de transferencia desechable, aplique una pequeña gota de la suspensión de almidón-metanol (~0,2 ml) al electrolito de metanol de 100 ml de 50 g/L licl bajo agitación constante en el vaso de precipitados. Cierre la puerta del compartimiento de muestras.
3. Realizar una carrera de tamaño
   1. Haga clic en Vista previa en la barra de herramientas inferior del instrumento para iniciar una ejecución de vista previa. En el Panel de estado, compruebe que la barra de concentración mostrada dinámicamente está en verde y muestra un rango de concentración nominal del 5 al 8 % para la suspensión.
   2. Haga clic en Detener en la barra de herramientas inferior para detener la ejecución de vista previa. Si es necesario, diluya la suspensión de almidón y electrolito reemplazando una alícuota de la suspensión por el electrolito y, a continuación, repita una ejecución de previsualización.
      NOTA: El rango de concentración nominal del 5% al 8% de la suspensión es crítico para completar una carrera sin interrupción debido al bloqueo de apertura por gránulos agregados. Si es necesario, ajuste el tamaño de la muestra de caída y/o la concentración de la suspensión de almidón-metanol para realizar una nueva suspensión de almidón-electrolito que tenga la concentración nominal en el rango óptimo.
   3. Después de la verificación, haga clic en Iniciar en la barra de herramientas inferior para iniciar la ejecución. El analizador completa automáticamente la ejecución una vez que el recuento total de gránulos de tamaño, que se muestra junto con el tiempo de ejecución en el Panel de estado en una ejecución, alcanza el recuento total establecido (125.000 o 250.000) por el modo de control del SOM. Dependiendo de la concentración de suspensión (dentro del rango del 5-8% o inferior), una sola carrera tarda de 2 a 5 minutos o más.
      NOTA: Cuando el analizador detecta automáticamente una obstrucción de apertura por configuración de detección de bloqueo del SOM, anulará la ejecución, se vaciará para desbloquear la apertura e iniciar una nueva ejecución. Esta acción de bloqueo se establece para repetirse al máximo durante cuatro veces antes de que el analizador cancele la operación de ejecución. Este problema de bloqueo de anulación de ejecución puede superarse mediante el uso de dos métodos técnicos, como se indica en el Cuadro 2 y detallado en el debate.
   4. Si es necesario, realice una ejecución de repetición técnica (consulte la Tabla 2 y se detalla en Discusión) utilizando la misma suspensión de electrolito de almidón simplemente haciendo clic en Iniciar o Repetir en la barra de herramientas inferior.
   5. Después de completar una carrera o repetir carreras, vacíe el vaso de precipitados, enjuáguelo con metanol y rellene con solución de electrolito fresco de 100 ml para la siguiente ejecución.
   6. Durante una ejecución, si aparece un cuadro de diálogo de notificación Rango de tamaño extendido cuando el recuento de gránulos de más de 60 μm supera el 0,1% del recuento total (según la configuración de SOM), haga clic en Ejecutar del 60% al 80% para ejecutar un rango de tamaño dinámico extendido al 80% del diámetro de apertura.
      NOTA: El ajuste Rango de tamaño extendido controla acciones para gránulos superiores al 60% del diámetro de apertura (100 μm, en este caso). La configuración del SOM especifica la inclusión de gránulos de almidón superiores a 60 μm cuando sus recuentos alcanzan más del 0,1% del recuento total. La finalización de la ejecución todavía está controlada por el recuento total, y puede tomar un poco menos de tiempo que de otra manera sin incluir los gránulos más grandes que suman menos del 0,1% (cantidad esticamente insignificante) del recuento total.
4. Analizar los resultados de la ejecución
   1. Si se utilizó un SOM para controlar las ejecuciones, seleccione Configuración de preferencias como desee para ver, imprimir y analizar estadísticamente los resultados mediante el Asistente para crear preferencias o el Asistente para editar preferencias en el SOP del menú principal.
   2. Superposición resulta de varias ejecuciones en un solo gráfico para la comparación.
      1. Haga clic en Superposición en la barra de herramientas principal o en | archivo Superposición en el menú principal para acceder a la ventana Superposición. Vaya a y seleccione varios archivos de resultado deseados en el cuadro Archivos, haga clic en Agregar para moverlos al cuadro Archivos seleccionados y haga clic en Aceptar para superponer los resultados seleccionados en un solo gráfico.
      2. Para agregar un archivo a una superposición abierta, haga clic en RunFile | Abra para Superposición en el menú Ejecutar para acceder a la ventana Superposición, vaya al archivo deseado y haga clic para agregar.
   3. Resultados medios de análisis de réplicas (2 extractos x 2 muestreo de almidón o 3 extractos x 1 muestreo de almidón), y ver o imprimir la distribución y estadísticas de tamaño medio de gránulos en una lista o gráfico.
      1. En el menú principal, haga clic en Archivo | FileTool | Promedio para abrir la ventana Promedio. Vaya a y seleccione varios archivos de resultado deseados en el cuadro Archivos, haga clic en Agregar para moverlos al cuadro Archivos seleccionados y haga clic en Aceptar para promediar los resultados seleccionados y mostrar el promedio en un solo gráfico.
      2. Para incluir un archivo de resultado adicional en una distribución media, en el menú Ejecutar, haga clic en Ejecutar | Abrir y Agregar a promedio para abrir la ventana Agregar a promedio, vaya a y agregue el archivo. El nuevo promedio aparece en el gráfico en la ventana Ejecutar (resultado) o en la lista.

5. Especificar la distribución media

1. En la ventana Menú de ejecución que muestra la distribución media, haga clic en Calcular | Estadísticas promediadas en el menú Ejecutar para abrir la ventana de resumen de estadísticas, que muestra las estadísticas promedio en las filas y las estadísticas de gráfico para la distribución media en las columnas.
2. Utilice la media geométrica gráfica ( ) y S.D. (s*) en la columna de estadísticas de gráficos para especificar la distribución media en el formulario ^x/ s*. Calcule las variaciones de medición de CV entre las distribuciones de réplica promediadas dividiendo la media (μ, la misma que la de la distribución media) de los medios geométricos de las distribuciones promediadas con el S.D. promedio (σ) enumerado en la fila de estadísticas promedio.
   NOTA: El S.D. promedio (para μ) que evalúa las variaciones entre los medios de las distribuciones de réplica es diferente de la S.D. geométrica gráfica (para) medir la propagación de la distribución media.

Resultados

Para validar el procedimiento y demostrar la reproducibilidad de la distribución determinada del tamaño del gránulo, realizamos análisis de tamaño de réplica de muestras de almidón de camote. Preparamos muestras de almidón de réplica (S1 y S2) de camotes cultivados en campo de una línea de cría SC1149-19 a una edad de desarrollo similar utilizando un procedimiento descrito previamente^28. De cada extracto de almidón, dos aliquots de 0,5 g (a y b) fueron muestreados, suspendidos en 5 ml ...

Discusión

El procedimiento descrito ha resuelto algunos problemas críticos en varios métodos existentes para los análisis del tamaño de gránulos de almidón, incluyendo el tamaño inadecuado 1D o 2D de gránulos 3D, la distorsión de las mediciones de tamaño debido a formas de gránulos no uniformes, mala reproducibilidad y dudosa validez estadística debido a tamaños limitados de muestras de gránulos, especificación inexacta o incorrecta (especialmente el uso del tamaño promedio) de tamaños de gránulos en presencia de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical beaker	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	For the MS4E
Disposable transfer pipettor,	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs.
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
Methanol	Fisher Chemical	A412-500	Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances	Mettler Toledo	30243412	Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H	Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.