Análisis linfático y de redes sanguíneas durante la obesidad

Resumen

La obesidad es un problema de salud pública mundial cada vez mayor. Se ha asociado previamente con la disfunción linfática, lo que sugiere una diafonía vital entre el tejido adiposo y el sistema linfático. En este trabajo, proponemos una metodología accesible que permite el marcaje distinto de las vasculaturas sanguíneas y linfáticas dentro del tejido adiposo subcutáneo.

Resumen

Los vasos colectores linfáticos y los ganglios linfáticos están inevitablemente incrustados en el tejido adiposo. El significado fisiológico de esta observación aún no se ha dilucidado. Sin embargo, la obesidad se caracteriza por un deterioro de la función linfática y un aumento de la permeabilidad de los vasos. Por el contrario, la disfunción linfática induce obesidad en ratones, lo que sugiere una interacción significativa entre los vasos linfáticos y el tejido adiposo. Por lo tanto, la comprensión de los factores que conducen a la disfunción linfática podría abrir nuevas ventanas terapéuticas para prevenir la obesidad y las comorbilidades asociadas. El primer paso en este proceso requiere una visualización precisa y detallada de la red linfática en el tejido adiposo sano e inflamado. Aquí, describimos un método rápido, económico y eficiente que permite etiquetar y analizar vasos linfáticos y sanguíneos. Este enfoque aprovecha la localización de los ganglios linfáticos braquiales que drenan la piel dentro del tejido adiposo subcutáneo. La arborización linfática de este tejido puede revelarse mediante la inyección subcutánea de lectinas conjugadas con fluorocromo. Además, el enfoque de marcaje in vivo proporciona una forma de evaluar la densidad y las funciones de los vasos linfáticos. Junto con la tinción de vasos sanguíneos, adipocitos y células inmunitarias, el protocolo permite el mapeo de alta resolución del tejido adiposo subcutáneo mediante imágenes 3D.

Introducción

El sistema circulatorio linfático desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos y en la inducción de respuestas inmunitarias eficientes. Los vasos linfáticos corren paralelos a los vasos sanguíneos y transportan líquido intersticial, metabolitos y células inmunitarias al ganglio linfático de drenaje local (LN) y, finalmente, hacia la circulación venosa¹. Se ha observado drenaje linfático disfuncional durante infección, inflamación y enfermedades metabólicas 2,3,4,5. La vasculatura linfática está compuesta por vasos de pequeño tamaño llamados capilares linfáticos. Los capilares linfáticos están formados por una sola capa de células endoteliales linfáticas delgadas (LECs) caracterizadas por uniones abiertas (uniones "en forma de botón") que facilitan la entrada del líquido intersticial, los metabolitos y las células inmunitarias, principalmente las células dendríticas (CD) y las células T, en la luz capilar linfática⁵. Los capilares linfáticos se fusionan en vasos más grandes llamados vasos colectores linfáticos. Los colectores linfáticos se caracterizan por una capa de LECs rodeada por una capa muscular que proporciona un tono contráctil autónomo y mantiene el flujo de líquidos⁵. Además, los vasos colectores poseen válvulas que aseguran un flujo linfático unidireccional.

Las LEC de colectores y capilares expresan un conjunto específico de marcadores que las distinguen de las células endoteliales sanguíneas (BEC). Entre esos factores, Prox1 es un factor de transcripción que guía la generación de LECs y se expresa en gran medida en las LECs mientras que está ausente en las BECs. La participación crítica de Prox1 en la biología de las LECs fue ilustrada por la generación y el análisis de ratones deficientes en Prox1⁶. Los ratones heterocigotos Prox1 tienen un desarrollo defectuoso de la vasculatura linfática caracterizado por una reducción de la densidad de los vasos linfáticos y un aumento de la permeabilidad vascular⁶. Las LECs expresan altamente VEGFR3, Podoplanin y CCL21⁵. Estos marcadores no se encuentran en las BEC y permiten analizar por separado la red de vasos linfáticos y sanguíneos. Lyve1 se expresa selectivamente por los capilares linfáticos mientras está ausente en los vasos colectores⁵.

Se han descrito tres tipos de tejido adiposo en función de su contenido mitocondrial y su posterior color. El tejido adiposo marrón termogénico rico en mitocondrias desempeña un papel clave durante la exposición al frío y se localiza en la región interescapular en ratones ^7,8. Los adipocitos blancos y beige tienen una menor densidad mitocondrial y participan principalmente en el almacenamiento de energía en forma de gotas de lípidos. Los adipocitos blancos y beige se localizan en depósitos viscerales y subcutáneos⁹.

Las observaciones clínicas establecieron un vínculo entre la obesidad y la disfunción linfática¹⁰. La obesidad induce cambios morfológicos en la vasculatura linfática del tejido adiposo y conduce a una alteración del transporte linfático¹¹. Los datos obtenidos en modelos preclínicos revelaron que la dieta alta en grasas (HFD) induce una remodelación linfática y los ratones obesos tienen ganglios linfáticos más pequeños y menor número de vasos linfáticos¹². Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que gobiernan este fenotipo aún no se han dilucidado. La participación de las LEC durante la obesidad está respaldada por observaciones en modelos genéticos con deterioro del desarrollo de los vasos linfáticos. Como se discutió anteriormente, los ratones heterocigotos Prox1 (Prox1^+/-) presentan un sistema linfático defectuoso y, coincidentemente, desarrollan una acumulación excesiva de tejido adiposo visceral en comparación con los animales suficientes de Prox1⁶. Curiosamente, este fenotipo de tejido adiposo es rescatado por la restauración de la función linfática¹³. En conjunto, estos resultados han sacado a la luz fuertes interconexiones entre los vasos linfáticos y el tejido adiposo, que necesitan más investigación.

En el contexto de la inflamación, característica de la obesidad, la expresión alterada de los marcadores LEC y BEC compromete el análisis de estas células a través de la tinción clásica de anticuerpos^14,15. Se han desarrollado modelos genéticos para etiquetar específicamente LECs y BECs que permiten paliar este problema 16,17,18,19. Sin embargo, el uso de líneas reporteras genéticas requiere múltiples pasos de mejoramiento y aumenta considerablemente la duración y el costo de un proyecto. Por lo tanto, proponemos utilizar inyecciones de lectina conjugada con fluorocromo para investigar los sistemas circulatorios sanguíneo y linfático en el tejido adiposo subcutáneo, un enfoque simple y relativamente poco costoso. La lectina conjugada con varios fluorocromos está disponible comercialmente y se puede inyectar por vía intravenosa para marcar los vasos sanguíneos, o por vía subcutánea para marcar los vasos linfáticos que drenan la piel incrustados en el tejido adiposo subcutáneo. Este enfoque se basa en el uso de conjugados de fluorocromo-lectina separados para cada inyección y permite el marcaje distinto de cada vasculatura. Este método también es compatible con el uso de modelos genéticos para etiquetar la red linfática o de vasculatura sanguínea. Es importante destacar que proporciona múltiples lecturas para analizar el estado de salud general del tejido adiposo subcutáneo y las vasculaturas sanguíneas y linfáticas que lo perfunden. Este procedimiento podría aplicarse fácilmente para analizar las redes linfáticas y de vasculatura sanguínea durante enfermedades agudas y crónicas de la piel, incluida la psoriasis y las infecciones.

Protocolo

Toda la experimentación animal se realizó de acuerdo con los comités éticos locales.

NOTA: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) y Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) se obtuvieron del Laboratorio Jackson y se cruzaron para obtener la línea de ratón linfático inducible Prox1-cre-ERT2::tdTomato. Los ratones se retrocruzaron con el fondo C57BL/6 durante 10 generaciones. Los ratones macho Prox1-cre-ERT2::tdTomato de seis semanas de edad recibieron dieta de tamoxifeno durante 3 semanas. Dieta de tamoxifeno de Envigo Teklad (dieta no. TD.130857; 500 mg/kg). Los experimentos se realizaron en ratones de 12 a 14 semanas de edad. Este protocolo es aplicable a ratones de cualquier edad, sexo o cepa.

1. Preparación del material

1. Esterilice las tijeras, las pinzas y los alfileres de disección con etanol al 70%.
2. Prepare dos jeringas de 1 mL con agujas de calibre 25 a 27. Para la inyección subcutánea recomendamos utilizar una microjeringa para inyectar 10 μL en la almohadilla superior del pie.
3. En un tubo de plástico de 1,5 mL, prepare 200 μL de lectina conjugada DyLight 488 diluida en PBS estéril a una concentración final de 100 μg/mL.
4. En otro tubo de plástico de 1,5 mL, prepare 100 μL de lectina conjugada DyLight 649 diluida en PBS estéril a una concentración final de 100 μg/mL.
5. Prepare un plato de 6 pocillos que contenga PBS y manténgalo en hielo.
6. Prepare una solución de 4% de paraformaldehído y 30% de sacarosa.

2. Marcaje de tejido adiposo subcutáneo, vasos sanguíneos y linfáticos.

1. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano al 5%. Evalúe la profundidad de la anestesia pellizcando firmemente la pata del animal para asegurarse de que el animal no sufra daños durante el procedimiento. La anestesia debe mantenerse hasta el final de los pasos de inyección de lectina o hasta la eutanasia.
2. Inyecte 100 μL de lectina conjugada con DyLight 488 por vía intravenosa en la vena de la cola para marcar la vasculatura sanguínea. Espere 15 minutos antes de proceder a la extracción de tejidos.
3. Con una jeringa diferente, inyecte 10 μL de lectina conjugada con DyLight 649 por vía subcutánea en la almohadilla superior del pie del animal para etiquetar los vasos linfáticos que drenan. Espere 15 minutos antes de proceder a la extracción de tejidos.
4. Eutanasia del ratón por luxación cervical o exposición al CO₂ 15 minutos después de la inyección.

3. Recolección de tejido adiposo subcutáneo

1. Coloca al ratón boca arriba sobre una tabla de disección.
2. Esterilizar el pelaje del ratón con etanol al 70%.
3. Levanta la piel del flanco con pinzas y haz una incisión transversal para exponer la almohadilla de grasa braquial.
4. Tire suavemente de la piel para disociarla del depósito de tejido adiposo braquial, revelando así todo el tejido adiposo braquial subcutáneo que contiene el ganglio linfático y el vaso colector linfático.
5. Con fórceps y tijeras, retire suavemente los depósitos de grasa subcutánea y transfiéralos a un plato que contenga PBS frío. Para obtener los mejores resultados, recomendamos eliminar los depósitos de grasa como una sola pieza.
6. De aquí en adelante, proteja el tejido de la luz.

4. Fijación de tejidos

1. Sumerja el tejido recolectado en una solución que contenga un 4% de paraformaldehído y un 30% de sacarosa.
2. Incube el tejido en esta solución al menos durante la noche antes de prepararlo para la obtención de imágenes.

5. Tinción e imagen

1. Para obtener resultados óptimos, se debe realizar la limpieza de tejidos y la adquisición confocal en 3D como lo describen Gilleron y colaboradores²⁰. Recomendamos utilizar un microscopio de lámina óptica para el análisis de tejidos grandes. Se puede realizar una tinción adicional durante el proceso de limpieza.
2. Para lograr el mejor mapeo tisular, se utilizan los siguientes anticuerpos:
   Para los adipocitos: Perilipina
   Para macrófagos: tinción de CD68 y CD11b.
   Para células dendríticas: MHC II y CD11b.
   Para linfocitos B: tinción B220 (CD45R).
   Para linfocitos T: tinción de CD3.
   NOTA: Este método es compatible con el uso de modelos genéticos para etiquetar células inmunitarias.
3. Para el análisis del vaso colector linfático por microscopía intravital de 2 fotones, inyectar la lectina por vía subcutánea en la almohadilla inferior del pie y visualizar el vaso colector linfático poplíteo.

Resultados

Para realizar el análisis topológico de las redes de vasos sanguíneos y linfáticos del tejido adiposo braquial, inyectamos lectina conjugada con Alexa Fluor 649 por vía subcutánea e inyectamos lectina conjugada con Alexa Fluor 488. El tejido adiposo braquial se extirpó cuidadosamente, se fijó, se sometió al protocolo de limpieza y se analizó mediante tinción de montaje completo. En la Figura 1A se incluye una representación esquemática del proce...

Discusión

Este enfoque proporciona un marcaje eficiente y robusto de las vasculaturas sanguíneas y linfáticas del tejido adiposo subcutáneo. El análisis separado de las redes endoteliales sanguíneas y linfáticas podría desentrañar los mecanismos patológicos que afectan a uno o ambos sistemas circulatorios durante la obesidad u otras afecciones patológicas. Este protocolo tiene como objetivo analizar la arquitectura de los sistemas vasculares, su interacción con las células estromales e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin DyLight 649	Vector Labs	DL-1178-1	Described in protocol
Lectin DyLight 488	Vector Labs	DL-1174	Described in protocol
Paraformaldehyde	VWR Chemicals	9713.1000
Sucrose	Euromedex	CAS Number 57-50-1
Anti-Podoplanin	AngioBio	11-033	Dilution : 1/50
Lectin DyLight 594	Vector Labs	DL-1177	Described in protocol
Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2)	Biolegend	107618	Dilution : 1/100
Anti-CD11b (Clone M1/70)	Biolegend	101218	Dilution : 1/100
Anti-CD68 (Clone FA.11)	Biolegend	137004	Dilution : 1/100
Anti-B220 (Clone RA3-6B2)	Biolegend	103225	Dilution : 1/100
Anti-Perilipin (Clone PERI 112.17)	Progen	651156	Dilution : 1/50
Anti-CD3 (Clone 17A2)	Biolegend	100210	Dilution : 1/100