Analyse des réseaux lymphatiques et sanguins pendant l’obésité

Résumé

L’obésité est un problème de santé publique mondial croissant. Il a déjà été associé à un dysfonctionnement lymphatique, suggérant une diaphonie vitale entre le tissu adipeux et le système lymphatique. Ici, nous proposons une méthodologie accessible permettant le marquage distinct des vaisseaux sanguins et lymphatiques au sein du tissu adipeux sous-cutané.

Résumé

Les vaisseaux collecteurs lymphatiques et les ganglions lymphatiques sont inévitablement intégrés dans le tissu adipeux. La signification physiologique de cette observation n’a pas encore été élucidée. Cependant, l’obésité se caractérise par une altération de la fonction lymphatique et une perméabilité accrue des vaisseaux. À l’inverse, le dysfonctionnement lymphatique induit l’obésité chez la souris, suggérant une interaction significative entre les vaisseaux lymphatiques et le tissu adipeux. Par conséquent, la compréhension des facteurs conduisant à la dysfonction lymphatique pourrait ouvrir de nouvelles fenêtres thérapeutiques pour prévenir l’obésité et les comorbidités associées. La première étape de ce processus nécessite une visualisation précise et détaillée du réseau lymphatique dans le tissu adipeux sain et enflammé. Nous décrivons ici une méthode rapide, peu coûteuse et efficace qui permet de marquer et d’analyser les vaisseaux lymphatiques et sanguins. Cette approche tire parti de la localisation des ganglions lymphatiques brachiaux drainants dans le tissu adipeux sous-cutané. L’arborisation lymphatique de ce tissu peut être révélée par l’injection sous-cutanée de lectines conjuguées au fluorochrome. De plus, l’approche de marquage in vivo permet d’évaluer la densité et les fonctions des vaisseaux lymphatiques. Couplé à la coloration des vaisseaux sanguins, des adipocytes et des cellules immunitaires, le protocole permet une cartographie à haute résolution du tissu adipeux sous-cutané par imagerie 3D.

Introduction

Le système circulatoire lymphatique joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie tissulaire et l’induction de réponses immunitaires efficaces. Les vaisseaux lymphatiques sont parallèles aux vaisseaux sanguins et transportent le liquide interstitiel, les métabolites et les cellules immunitaires vers le ganglion lymphatique drainant local (LN) et enfin vers la circulation veineuse¹. Un drainage lymphatique dysfonctionnel a été observé lors d’infections, d’inflammations et de maladies métaboliques 2,3,4,5. Le système vasculaire lymphatique est composé de vaisseaux de petite taille appelés capillaires lymphatiques. Les capillaires lymphatiques sont formés d’une seule couche de cellules endothéliales lymphatiques minces (LEC) caractérisées par des jonctions ouvertes (jonctions en forme de bouton) facilitant l’entrée du liquide interstitiel, des métabolites et des cellules immunitaires, principalement des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T, dans la lumière capillaire lymphatique⁵. Les capillaires lymphatiques fusionnent en vaisseaux plus gros appelés vaisseaux collecteurs lymphatiques. Les collecteurs lymphatiques sont caractérisés par une couche de LEC entourée d’une couche musculaire fournissant un tonus contractile autonome et maintenant le flux de fluide⁵. De plus, les vaisseaux collecteurs possèdent des valves assurant un flux lymphatique unidirectionnel.

Les LEC des collecteurs et des capillaires expriment un ensemble spécifique de marqueurs qui les distinguent des cellules endothéliales sanguines (BEC). Parmi ces facteurs, Prox1 est un facteur de transcription guidant la génération des LEC et est fortement exprimé dans les LEC alors qu’il est absent dans les BEC. L’implication critique de Prox1 dans la biologie des LEC a été illustrée par la génération et l’analyse de souris déficientes en Prox1⁶. Les souris hétérozygotes Prox1 ont un développement vasculaire lymphatique défectueux caractérisé par une densité réduite des vaisseaux lymphatiques et une perméabilité vasculaire accrue⁶. Les LEC expriment fortement VEGFR3, Podoplanin et CCL21⁵. Ces marqueurs ne se trouvent pas sur les BEC et permettent d’analyser séparément le réseau des vaisseaux lymphatiques et sanguins. Lyve1 est exprimé sélectivement par les capillaires lymphatiques alors qu’il est absent sur les vaisseaux collecteurs⁵.

Trois types de tissu adipeux ont été décrits en fonction de leur contenu mitochondrial et de leur couleur ultérieure. Le tissu adipeux brun thermogénique riche en mitochondries joue un rôle clé lors de l’exposition au froid et est situé dans la région interscapulaire chez les souris ^7,8. Les adipocytes blancs et beiges ont une densité mitochondriale plus faible et sont principalement impliqués dans le stockage de l’énergie sous forme de gouttelettes lipidiques. Les adipocytes blancs et beiges sont localisés dans les dépôts viscéraux et sous-cutanés⁹.

Les observations cliniques ont établi un lien entre l’obésité et le dysfonctionnement lymphatique¹⁰. L’obésité induit des modifications morphologiques du tissu adipeux, du système vasculaire lymphatique et entraîne une altération du transport lymphatique¹¹. Les données obtenues dans les modèles précliniques ont révélé que le régime riche en graisses (HFD) induit un remodelage lymphatique et que les souris obèses ont des ganglions lymphatiques plus petits et moins de vaisseaux lymphatiques¹². Néanmoins, les mécanismes moléculaires précis régissant ce phénotype restent à élucider. L’implication des LEC au cours de l’obésité est également étayée par des observations dans des modèles génétiques présentant un développement altéré des vaisseaux lymphatiques. Comme nous l’avons vu précédemment, les souris hétérozygotes Prox1 (Prox1^+/-) présentent un système lymphatique défectueux et développent par coïncidence une accumulation excessive de tissu adipeux viscéral par rapport^{aux animaux} Prox1 6. Il est intéressant de noter que ce phénotype du tissu adipeux est sauvé par la restauration de la fonction lymphatique¹³. L’ensemble de ces résultats a mis en lumière de fortes interconnexions entre les vaisseaux lymphatiques et le tissu adipeux, qui nécessitent des recherches plus approfondies.

Dans le contexte de l’inflammation, caractéristique de l’obésité, l’expression altérée des marqueurs LEC et BEC compromet l’analyse de ces cellules via la coloration classique des anticorps^14,15. Des modèles génétiques permettant d’étiqueter spécifiquement les LEC et les BEC ont été développés et permettent de pallier ce problème 16,17,18,19. Cependant, l’utilisation de lignées rapporteures génétiques nécessite plusieurs étapes de sélection et augmente considérablement la durée et le coût d’un projet. Ainsi, nous proposons d’utiliser des injections de lectine conjuguées au fluorochrome pour étudier les systèmes circulatoires sanguins et lymphatiques dans le tissu adipeux sous-cutané, une approche simple et relativement peu coûteuse. La lectine conjuguée à divers fluorochromes est disponible dans le commerce et peut être injectée par voie intraveineuse pour marquer les vaisseaux sanguins, ou par voie sous-cutanée pour marquer les vaisseaux lymphatiques drainants cutanés intégrés dans le tissu adipeux sous-cutané. Cette approche repose sur l’utilisation de conjugués fluorochrome-lectine distincts pour chaque injection et permet le marquage distinct de chaque système vasculaire. Cette méthode est également compatible avec l’utilisation de modèles génétiques pour marquer le réseau vasculaire lymphatique ou sanguin. Il est important de noter qu’il fournit de multiples lectures pour analyser l’état de santé général du tissu adipeux sous-cutané et des vaisseaux sanguins et lymphatiques qui le perffont. Cette procédure pourrait être facilement appliquée pour analyser les réseaux vasculaires lymphatiques et sanguins au cours des maladies cutanées aiguës et chroniques, y compris le psoriasis et les infections.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en accord avec les comités d’éthique locaux.

REMARQUE : Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) et Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) ont été obtenus du Jackson Laboratory et croisés pour obtenir la lignée de souris rapporteure lymphatique inductible Prox1-cre-ERT2 ::tdTomato. Les souris ont été rétrocroisées sur le fond C57BL/6 pendant 10 générations. Des souris mâles Prox1-cre-ERT2 ::tdTomato âgées de six semaines ont reçu un régime à base de tamoxifène pendant 3 semaines. Régime tamoxifène d’Envigo Teklad (régime no. TD.130857 ; 500 mg/kg) a été utilisé. Des expériences ont été réalisées sur des souris âgées de 12 à 14 semaines. Ce protocole s’applique aux souris de tout âge, sexe ou souche.

1. Préparation du matériel

1. Stérilisez les ciseaux, les pinces et les broches de dissection avec de l’éthanol à 70 %.
2. Préparez deux seringues de 1 mL avec des aiguilles de calibre 25 à 27. Pour l’injection sous-cutanée, nous recommandons d’utiliser une micro-seringue pour injecter 10 μL dans le coussinet plantaire supérieur.
3. Dans un tube en plastique de 1,5 ml, préparer 200 μL de lectine conjuguée DyLight 488 diluée dans du PBS stérile à une concentration finale de 100 μg/mL.
4. Dans un autre tube en plastique, un tube de 1,5 mL prépare 100 μL de lectine conjuguée DyLight 649 diluée dans du PBS stérile à une concentration finale de 100 μg/mL.
5. Préparez une plaque à 6 puits contenant du PBS et conservez-la sur de la glace.
6. Préparez une solution de 4 % de paraformaldéhyde et de 30 % de saccharose.

2. Marquage du tissu adipeux sous-cutané, du sang et des vaisseaux lymphatiques.

1. Anesthésier la souris par inhalation de 5 % d’isoflurane. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en pinçant fermement la patte de l’animal pour vous assurer que l’animal n’est pas blessé pendant la procédure. L’anesthésie doit être maintenue jusqu’à la fin des étapes d’injection de lectine ou jusqu’à l’euthanasie.
2. Injectez 100 μL de lectine conjuguée à DyLight 488 par voie intraveineuse dans la veine de la queue pour marquer le système vasculaire sanguin. Attendez 15 minutes avant de procéder au prélèvement des tissus.
3. À l’aide d’une autre seringue, injectez 10 μL de lectine conjuguée à DyLight 649 par voie sous-cutanée sur le coussinet supérieur du pied de l’animal pour marquer les vaisseaux lymphatiques drainants. Attendez 15 minutes avant de procéder au prélèvement des tissus.
4. Euthanasier la souris par luxation cervicale ou exposition au CO₂ 15 minutes après l’injection.

3. Prélèvement de tissu adipeux sous-cutané

1. Posez la souris sur le dos sur une planche de dissection.
2. Stérilisez la fourrure de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
3. Soulevez la peau du flanc à l’aide d’une pince et faites une incision transversale pour exposer le coussinet adipeux brachial.
4. Tirez doucement sur la peau pour la dissocier du dépôt de tissu adipeux brachial, révélant ainsi l’ensemble du tissu adipeux brachial sous-cutané contenant le ganglion lymphatique et le vaisseau collecteur lymphatique.
5. À l’aide de pinces et de ciseaux, retirez délicatement les dépôts de graisse sous-cutanés et transférez-les dans une boîte contenant du PBS froid. Pour de meilleurs résultats, nous vous recommandons d’éliminer les dépôts de graisse en un seul morceau.
6. À partir de maintenant, protégez le tissu de la lumière.

4. Fixation des tissus

1. Immergez le tissu récolté dans une solution contenant 4 % de paraformaldéhyde et 30 % de saccharose.
2. Incuber le tissu dans cette solution au moins une nuit avant de le préparer pour l’imagerie.

5. Coloration et imagerie

1. Pour des résultats optimaux, effectuez un nettoyage des tissus et une acquisition confocale 3D comme décrit par Gilleron et ses collègues²⁰. Nous recommandons l’utilisation d’un microscope à feuillet de lumière pour l’analyse de grands tissus. Des colorations supplémentaires peuvent être effectuées pendant le processus de nettoyage.
2. Pour obtenir la meilleure cartographie tissulaire, utilisez les anticorps suivants :
   Pour les adipocytes : Perilipin
   Pour les macrophages : coloration CD68 et CD11b.
   Pour les cellules dendritiques : CMH II et CD11b.
   Pour les lymphocytes B : coloration B220 (CD45R).
   Pour les lymphocytes T : coloration CD3.
   REMARQUE : Cette méthode est compatible avec l’utilisation de modèles génétiques pour marquer les cellules immunitaires.
3. Pour l’analyse du vaisseau collecteur lymphatique par microscopie intravitale à 2 photons, injectez la lectine par voie sous-cutanée dans le coussinet inférieur du pied et visualisez le vaisseau collecteur lymphatique poplitéal.

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Résultats

Pour effectuer une analyse topologique du tissu adipeux brachial, du sang et des réseaux de vaisseaux lymphatiques, nous avons injecté par voie sous-cutanée de la lectine conjuguée à Alexa Fluor 649 et par voie intraveineuse de la lectine conjuguée à Alexa Fluor 488. Le tissu adipeux brachial a été soigneusement excisé, fixé, soumis au protocole de clarification et analysé par coloration sur l’ensemble du support. Une représentation schématique de la procédure est prése...

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Discussion

Cette approche permet un marquage efficace et robuste des vascularisations sanguines et lymphatiques du tissu adipeux sous-cutané. L’analyse séparée des réseaux endothéliales sanguins et lymphatiques pourrait démêler les mécanismes pathologiques affectant l’un ou les deux systèmes circulatoires pendant l’obésité ou d’autres conditions pathologiques. Ce protocole vise à analyser l’architecture des systèmes vasculaires, leur interaction avec les cellules stromales et...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin DyLight 649	Vector Labs	DL-1178-1	Described in protocol
Lectin DyLight 488	Vector Labs	DL-1174	Described in protocol
Paraformaldehyde	VWR Chemicals	9713.1000
Sucrose	Euromedex	CAS Number 57-50-1
Anti-Podoplanin	AngioBio	11-033	Dilution : 1/50
Lectin DyLight 594	Vector Labs	DL-1177	Described in protocol
Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2)	Biolegend	107618	Dilution : 1/100
Anti-CD11b (Clone M1/70)	Biolegend	101218	Dilution : 1/100
Anti-CD68 (Clone FA.11)	Biolegend	137004	Dilution : 1/100
Anti-B220 (Clone RA3-6B2)	Biolegend	103225	Dilution : 1/100
Anti-Perilipin (Clone PERI 112.17)	Progen	651156	Dilution : 1/50
Anti-CD3 (Clone 17A2)	Biolegend	100210	Dilution : 1/100