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요약

비만은 전 세계적으로 증가하고 있는 공중 보건 문제입니다. 이전에는 림프 기능 장애와 관련이 있었으며, 지방 조직과 림프계 사이의 중요한 혼선을 시사합니다. 여기서, 우리는 피하 지방 조직 내에서 혈액과 림프 혈관 구조를 구별할 수 있는 접근 가능한 방법론을 제안합니다.

초록

림프관과 림프절은 필연적으로 지방 조직에 박혀 있습니다. 이 관찰의 생리학적 중요성은 아직 밝혀지지 않았습니다. 그러나 비만은 림프 기능이 손상되고 혈관 투과성이 증가하는 것이 특징입니다. 반대로, 림프 기능 장애는 마우스의 비만을 유발하며, 이는 림프관과 지방 조직 사이에 상당한 상호 작용이 있음을 시사합니다. 따라서 림프 기능 장애를 유발하는 요인을 이해하는 것은 비만 및 관련 동반 질환을 예방할 수 있는 새로운 치료 창을 열 수 있습니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 건강하고 염증이 있는 지방 조직의 림프망을 정확하고 상세하게 시각화해야 합니다. 여기에서는 림프관과 혈관을 라벨링하고 분석할 수 있는 빠르고 저렴하며 효율적인 방법에 대해 설명합니다. 이 접근법은 피하 지방 조직 내에서 피부를 배출하는 상완 림프절 국소화를 활용합니다. 이 조직의 림프 가지화는 형광 색소 접합 렉틴을 피하로 주입함으로써 드러날 수 있습니다. 또한, in vivo 라벨링 접근법은 림프관 밀도와 기능을 평가하는 방법을 제공합니다. 혈관, 지방세포 및 면역 세포 염색과 결합된 이 프로토콜은 3D 이미징을 통해 피하 지방 조직의 고해상도 매핑을 가능하게 합니다.

서문

림프 순환계는 조직의 항상성을 유지하고 효율적인 면역 반응을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다. 림프관은 혈관과 평행하게 흐르며 간질액, 대사산물 및 면역 세포를 국소 배출 림프절(LN)로 운반하고 최종적으로 정맥 순환으로 운반합니다1. 림프 배출 기능 장애는 감염, 염증 및 대사 질환 동안 관찰되었습니다 2,3,4,5. 림프 혈관 구조는 림프 모세혈관(lymphatic capillaries)이라고 하는 작은 크기의 혈관으로 구성되어 있습니다. 림프 모세혈관은 얇은 림프 내피 세포(LEC)의 단일 층으로 형성되며, 간질액, 대사 산물 및 면역 세포(주로 수지상 세포(DC)와 T 세포)가 림프 모세관 내강으로 진입하는 것을 촉진하는 개방 연접("단추 모양" 접합부)을 특징으로 합니다5. 림프 모세혈관은 림프 수집 혈관(lymphatic collecting vessel)이라는 더 큰 혈관으로 합쳐집니다. 림프 수집기는 근육층으로 둘러싸인 LEC 층을 특징으로 하며, 이는 자율적인 수축 긴장도를 제공하고 유체 흐름을 유지합니다5. 또한, 수집 용기에는 단방향 림프 흐름을 보장하는 밸브가 있습니다.

수집기 및 모세혈관의 LEC는 혈액 내피 세포(BEC)와 구별되는 특정 마커 세트를 발현합니다. 이러한 요인 중 Prox1은 LEC 생성을 안내하는 전사 인자이며 LEC에서는 많이 발현되지만 BEC에는 없습니다. LEC 생물학에서 Prox1의 중요한 관여는 Prox1 결핍 마우스6의 생성 및 분석에 의해 설명되었습니다. Prox1 이형접합 마우스는 림프관 밀도가 감소하고 혈관 투과성이 증가하는 것을 특징으로 하는 림프 혈관 발달에 결함이 있습니다6. LEC는 VEGFR3, Podoplanin 및 CCL21을 고도로 표현합니다5. 이러한 마커는 BEC에서 찾을 수 없으며 림프관과 혈관의 네트워크를 별도로 분석할 수 있습니다. Lyve1은 수집 혈관에 없는 동안 림프 모세혈관에 의해 선택적으로 발현됩니다5.

세 가지 유형의 지방 조직이 미토콘드리아 함량과 그에 따른 색상을 기준으로 설명되었습니다. 미토콘드리아가 풍부한 발열성 갈색 지방 조직은 추위에 노출되는 동안 중요한 역할을 하며 마우스의 견갑골 영역에 위치합니다 7,8. 흰색과 베이지색 지방세포는 미토콘드리아 밀도가 낮고 주로 지질 방울 형태로 에너지를 저장하는 데 관여합니다. 흰색과 베이지색의 지방세포는 내장과 피하층에 위치한다9.

임상적 관찰을 통해 비만과 림프 기능 장애 사이의 연관성이 확인되었다10. 비만은 지방 조직 림프 혈관 구조의 형태학적 변화를 유발하고 림프 수송 장애를 초래한다11. 전임상 모델에서 얻은 데이터에 따르면 고지방 다이어트(HFD)는 림프 리모델링을 유도하고 비만 마우스는 림프절이 작고 림프관 수가 적다12. 그럼에도 불구하고, 이 표현형을 지배하는 정확한 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 비만 기간 동안 LEC의 관여는 림프관 발달 장애가 있는 유전자 모델의 관찰에 의해 더욱 뒷받침됩니다. 앞서 논의한 바와 같이, Prox1 이형접합 마우스(Prox1+/-)는 림프계가 제대로 작동하지 않는 것으로 나타나며, Prox1 충분한 동물에 비해 우연히도 과도한 내장 지방 조직 축적을 보이고 있습니다6. 흥미롭게도, 이 지방 조직 표현형은 림프 기능의 회복에 의해 구제됩니다13. 이러한 결과는 림프관과 지방 조직 사이의 강력한 상호 연관성을 밝혀냈으며, 이는 추가 조사가 필요합니다.

비만의 특징인 염증의 맥락에서, LEC 및 BEC 마커의 변형된 발현은 고전적인 항체 염색을 통한 이러한 세포의 분석을 손상시킵니다14,15. LEC와 BEC를 구체적으로 분류하는 유전자 모델이 개발되어 이 문제를 완화할 수 있게 되었습니다 16,17,18,19. 그러나 유전자 리포터 라인을 사용하려면 여러 단계의 육종이 필요하며 프로젝트의 길이와 비용이 상당히 증가합니다. 따라서, 우리는 피하 지방 조직의 혈액 및 림프 순환계를 조사하기 위해 형광 색소 접합 렉틴 주사를 사용할 것을 제안하며, 이는 간단하고 상대적으로 비용이 많이 들지 않는 접근 방식입니다. 다양한 형광 색소에 접합된 렉틴은 시판되고 있으며 정맥 주사하여 혈관을 표시하거나 피하 지방 조직에 박혀 있는 피부 배출 림프관을 표시하기 위해 피하 주사할 수 있습니다. 이 접근법은 각 주사에 대해 별도의 형광색소-렉틴 접합체를 사용하는 데 의존하며 각 혈관 구조를 구별하여 표지할 수 있습니다. 이 방법은 또한 림프 또는 혈액 혈관 구조 네트워크를 라벨링하기 위해 유전자 모델을 사용하는 것과 호환됩니다. 중요한 것은 피하 지방 조직과 이를 관류하는 혈액 및 림프관 혈관 조직의 전반적인 건강 상태를 분석하기 위한 여러 판독값을 제공한다는 것입니다. 이 절차는 건선 및 감염을 포함한 급성 및 만성 피부 질환 동안 림프 및 혈액 혈관 구조 네트워크를 분석하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 지역 윤리 위원회에 따라 수행되었습니다.

참고: Prox1-cre-ERT2(Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) 및 Rosa26-LSL-tdTomato(B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914)을 Jackson Laboratory에서 얻어 교배하여 유도성 림프 리포터 마우스 라인 Prox1-cre-ERT2::tdTomato를 얻었습니다. 마우스는 10 세대 동안 C57BL / 6 배경으로 역 교배되었습니다. 생후 6주 된 Prox1-cre-ERT2::tdTomato 수컷 마우스는 3주 동안 타목시펜 식단을 투여받았습니다. Envigo Teklad의 타목시펜 다이어트(다이어트 번호. TD.130857; 500 mg/kg)을 사용하였다. 실험은 12-14주 된 쥐에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 모든 연령, 성별 또는 균주의 마우스에 적용할 수 있습니다.

1. 재료 준비

  1. 가위, 집게 및 해부 핀은 70% 에탄올을 사용하여 살균합니다.
  2. 25-27 게이지 바늘이 있는 1mL 주사기 2개를 준비합니다. 피하 주사의 경우 마이크로 주사기를 사용하여 상부 발판에 10μL를 주입하는 것이 좋습니다.
  3. 플라스틱 1.5mL 튜브에 멸균 PBS에 희석된 DyLight 488 복합 렉틴 200μL를 최종 농도 100μg/mL로 준비합니다.
  4. 다른 플라스틱에서 1.5mL 튜브를 사용하여 멸균 PBS에 희석된 100μL의 DyLight 649 복합 렉틴을 최종 농도 100μg/mL로 준비합니다.
  5. PBS가 들어있는 6웰 플레이트를 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
  6. 4 % 파라 포름 알데히드와 30 % 자당의 용액을 준비합니다.

2. 피하 지방이 많은 조직, 혈액 및 림프관의 라벨링.

  1. 5% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 시술 중에 동물이 다치지 않도록 동물의 발을 단단히 꼬집어 마취 깊이를 평가합니다. 마취는 렉틴 주입 단계가 끝날 때까지 또는 안락사까지 유지되어야 합니다.
  2. 100μL의 DyLight 488 복합 렉틴을 꼬리 정맥에 정맥 주사하여 혈액 혈관 구조를 표시합니다. 조직 채취를 진행하기 전에 15분 정도 기다립니다.
  3. 다른 주사기를 사용하여 10μL의 DyLight 649 복합 렉틴을 동물의 상부 발판에 피하주사하여 배출되는 림프관을 표시합니다. 조직 채취를 진행하기 전에 15분 정도 기다립니다.
  4. 주사 후 15분 동안 자궁경부 탈구 또는 CO2 에 노출되어 마우스를 안락사시킵니다.

3. 피하 지방이 많은 조직의 수확

  1. 해부판에 마우스를 등을 대고 놓습니다.
  2. 70% 에탄올을 사용하여 마우스의 털을 살균합니다.
  3. 겸자를 사용하여 옆구리의 피부를 들어 올리고 횡단 절개를 하여 상완 지방 패드를 노출시킵니다.
  4. 피부를 부드럽게 당겨 상완 지방 조직 저장소에서 분리하여 림프절과 림프 수집기 혈관을 포함하는 전체 피하 상완 지방 조직을 드러냅니다.
  5. 집게와 가위를 사용하여 피하 지방 저장소를 부드럽게 제거하고 차가운 PBS가 들어 있는 접시에 옮깁니다. 최상의 결과를 얻으려면 지방 저장소를 하나의 단일 조각으로 제거하는 것이 좋습니다.
  6. 여기서부터 빛을 차단하여 조직을 보호하십시오.

4. 조직 정착

  1. 수확된 조직을 4%의 파라포름알데히드와 30%의 자당을 함유한 용액에 담급니다.
  2. 이미징을 준비하기 전에 적어도 하룻밤 동안 이 용액에서 조직을 배양합니다.

5. 염색 및 이미징

  1. 최적의 결과를 얻으려면 Gilleron과 동료들이 설명한 대로 조직 투명화 및 3D 컨포칼 획득을 수행합니다20. 큰 조직을 분석하기 위해 광시트 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 투명화 과정에서 추가 염색을 수행할 수 있습니다.
  2. 최상의 조직 매핑을 달성하려면 다음 항체를 사용하십시오.
    지방세포의 경우: 페리리핀
    대식세포의 경우: CD68 및 CD11b 염색.
    수지상 세포의 경우: MHC II 및 CD11b.
    B 세포의 경우: B220 (CD45R) 염색.
    T 세포의 경우: CD3 염색.
    참고: 이 방법은 면역 세포를 라벨링하기 위해 유전자 모델을 사용하는 것과 호환됩니다.
  3. 생체 내 2-광자 현미경 검사에 의한 림프 수집기 혈관을 분석하기 위해 하부 발판에 렉틴을 피하로 주입하고 슬와파 림프 수집 혈관을 시각화합니다.

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결과

상완 지방 조직, 혈액 및 림프관 네트워크의 토폴로지 분석을 수행하기 위해 Alexa Fluor 649 복합 렉틴을 피하 주사하고 Alexa Fluor 488 복합 렉틴을 정맥 주사했습니다. 상완 지방 조직을 조심스럽게 절제하고, 고정하고, 투명화 프로토콜에 제출하고, 전체 마운트 염색으로 분석했습니다. 이 절차의 개략도는 그림 1A에 포함되어 있습니다. 혈관은 녹색으로...

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토론

이 접근법은 피하 지방 조직의 혈액 및 림프 혈관 조직에 대한 효율적이고 강력한 라벨링을 제공합니다. 혈액 및 림프 내피 네트워크에 대한 별도의 분석은 비만 또는 기타 병리학적 상태 동안 순환계 중 하나 또는 둘 다에 영향을 미치는 병리학적 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 이 프로토콜은 혈관 시스템의 구조, 기질 세포 및 면역 세포와의 상호 작용, 건강 및 질병 중 ?...

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공개

저자는 선언할 공개 및 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

SI는 INSERM(Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) 및 Agence Nationale de la Recherche(ANR-17-CE14-0017-01 및 ANR-19-ECVD-0005-01)의 지원을 받습니다. AG는 ANR(National Research Agency)이 관리하는 UCAJedi Investments in the Future 프로젝트를 통해 프랑스 정부의 지원을 받고 있으며, 참조 번호는 ANR-15-IDEX-01입니다. RSC는 Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund의 FA-2020-01-IBD-1의 지원을 받습니다."

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Lectin DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Described in protocol
Lectin DyLight 488Vector LabsDL-1174Described in protocol
ParaformaldehydeVWR Chemicals9713.1000
SucroseEuromedexCAS Number 57-50-1
Anti-PodoplaninAngioBio11-033Dilution : 1/50
Lectin DyLight 594Vector LabsDL-1177Described in protocol
Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2)Biolegend107618Dilution : 1/100
Anti-CD11b (Clone M1/70)Biolegend101218Dilution : 1/100
Anti-CD68 (Clone FA.11)Biolegend137004Dilution : 1/100
Anti-B220 (Clone RA3-6B2)Biolegend103225Dilution : 1/100
Anti-Perilipin (Clone PERI 112.17)Progen651156Dilution : 1/50
Anti-CD3 (Clone 17A2)Biolegend100210Dilution : 1/100

참고문헌

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