肥満時のリンパ管・血液回路網解析

要約

肥満は、世界的に増大する公衆衛生問題です。これは以前、リンパ機能障害と関連付けられており、脂肪組織とリンパ系との間の重要なクロストークを示唆しています。ここでは、皮下脂肪組織内の血液とリンパ管の血管系の明確な標識を可能にするアクセス可能な方法論を提案します。

要約

リンパ管の収集血管とリンパ節は、必然的に脂肪組織に埋め込まれます。この観察の生理学的意義は、まだ解明されていません。しかし、肥満はリンパ機能の障害と血管透過性の増加を特徴としています。逆に、リンパ機能障害はマウスの肥満を誘発し、リンパ管と脂肪組織との間に有意な相互作用があることが示唆されています。したがって、リンパ機能障害につながる要因を理解することで、肥満やそれに伴う併存疾患を予防するための新たな治療の窓が開かれるかもしれません。このプロセスの最初のステップでは、健康で炎症を起こした脂肪組織のリンパ管網を正確かつ詳細に視覚化する必要があります。ここでは、リンパ管と血管の標識と分析を可能にする、迅速で安価、かつ効率的な方法について説明します。このアプローチは、皮下脂肪組織内の皮膚を排出する上腕リンパ節の局在を利用します。この組織のリンパ節分化は、蛍光色素結合レクチンを皮下に注入することで明らかにすることができます。さらに、in vivo標識アプローチは、リンパ管の密度と機能を評価する方法を提供します。血管、脂肪細胞、免疫細胞の染色と組み合わせることで、このプロトコルは3Dイメージングによる皮下脂肪組織の高解像度マッピングを可能にします。

概要

リンパ循環系は、組織の恒常性の維持と効率的な免疫応答の誘導に重要な役割を果たします。リンパ管は血管と平行に走り、間質液、代謝物、免疫細胞を局所のドレナージリンパ節(LN)に運び、最終的には静脈循環に運びます¹。リンパドレナージの機能不全は、感染、炎症、代謝性疾患2,3,4,5の間に観察されています。リンパ管系は、リンパ管と呼ばれる小さなサイズの血管で構成されています。リンパ管は、間質液、代謝産物、および免疫細胞(主に樹状細胞(DC)とT細胞)がリンパ管腔5に入るのを容易にする開いた接合部(「ボタン状」接合部)を特徴とする薄いリンパ管内皮細胞(LEC)の単層によって形成^{されます。}リンパ管は、リンパ集結血管と呼ばれるより大きな血管に合流します。リンパコレクターは、自律的な収縮性緊張を提供し、体液の流れを維持する筋肉層に囲まれたLECの層によって特徴付けられます⁵。さらに、収集血管は、一方向のリンパの流れを保証する弁を持っています。

コレクターとキャピラリーのLECは、それらを血液内皮細胞(BEC)と区別する特定のマーカーセットを発現します。その中でも、Prox1はLECの生成を導く転写因子であり、BECには存在しない一方でLECでは高発現しています。Prox1がLECの生物学に重要な関与をしていることは、Prox1欠損マウスの作製と解析によって示されました⁶。Prox1ヘテロ接合マウスは、リンパ管密度の低下と血管透過性の増加を特徴とするリンパ管系の発達に欠陥があります⁶。LECはVEGFR3、ポドプラニン、CCL21を高発現します⁵.これらのマーカーはBECには見られず、リンパ管と血管のネットワークを別々に分析することができます。Lyve1はリンパ管によって選択的に発現されますが、採取血管⁵には存在しません。

3種類の脂肪組織は、それらのミトコンドリア含有量とその後の色に基づいて説明されています。ミトコンドリアに富む熱発生褐色脂肪組織は、寒冷曝露時に重要な役割を果たし、マウスの肩甲骨間領域に位置しています^7,8。白とベージュの脂肪細胞はミトコンドリア密度が低く、主に脂肪滴の形でエネルギー貯蔵に関与しています。白とベージュの脂肪細胞は、内臓および皮下のデポ^{に位置しています9}。

臨床観察により、肥満とリンパ機能障害との関連が確立されました¹⁰。肥満は、脂肪組織リンパ管系の形態学的変化を誘発し、リンパ輸送の障害を引き起こします¹¹。前臨床モデルで得られたデータによると、高脂肪食(HFD)はリンパ管リモデリングを誘発し、肥満マウスはリンパ節が小さく、リンパ管の数が少ないことが明らかになりました¹²。しかし、この表現型を支配する正確な分子メカニズムは、まだ解明されていません。肥満時のLECの関与は、リンパ管の発達が障害のある遺伝モデルでの観察によってさらに裏付けられています。前に述べたように、Prox1ヘテロ接合マウス(Prox1^+/-)は、機能不全のリンパ系を示し、偶然にもProx1の^{十分な動物と比較して}過剰な内臓脂肪組織の蓄積を発症する6。興味深いことに、この脂肪組織の表現型は、リンパ機能の回復によって救われます¹³。これらの結果により、リンパ管と脂肪組織との間の強い相互関係が明らかになりましたが、これはさらなる調査が必要です。

肥満の特徴である炎症の状況では、LECおよびBECマーカーの発現の変化は、古典的な抗体染色^14,15を介したこれらの細胞の分析を損ないます。特にLECおよびBECを標識する遺伝子モデルが開発されており、この問題を軽減することができます^16,17,18,19。しかし、遺伝子レポーター系統の使用には複数の育種ステップが必要であり、プロジェクトの長さとコストが大幅に増加します。したがって、蛍光色素標識レクチン注射を使用して、皮下脂肪組織の血液およびリンパ循環系を調査することを提案します。各種蛍光色素に結合したレクチンは市販されており、血管を標識するために静脈内注射したり、皮下脂肪組織に埋め込まれた皮膚を排出するリンパ管を標識するために皮下注射することができます。このアプローチは、注入ごとに別々の蛍光色素-レクチンコンジュゲートを使用することに依存しており、各血管系の明確な標識を可能にします。この方法は、リンパ管または血液血管系ネットワークを標識するための遺伝子モデルの使用とも互換性があります。重要なのは、皮下脂肪組織とそれを灌流する血液およびリンパ管系の全体的な健康状態を分析するための複数の読み出しを提供することです。この手順は、乾癬や感染症などの急性および慢性皮膚疾患の際のリンパ管および血液血管系ネットワークの解析に容易に適用できます。

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プロトコル

すべての動物実験は、地元の倫理委員会に従って行われました。

注:Prox1-cre-ERT2(Prox1tm3(cre / ERT2)Gco / J、Jax #022075)およびRosa26-LSL-tdTomato(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914)をThe Jackson Laboratoryから入手し、交配して誘導性リンパレポーターマウス系統Prox1-cre-ERT2::tdTomatoを得た。マウスをC57BL/6バックグラウンドに10世代にわたって戻し交配しました。生後6週間のProx1-cre-ERT2::tdTomato雄マウスは、タモキシフェン食を3週間受けました。Envigo Tekladのタモキシフェンダイエット(ダイエット番号。TD.130857;500 mg/kg)を用いた。実験は12-14週齢のマウスで行った。このプロトコルは、あらゆる年齢、性別、系統のマウスに適用できます。

1. 材料の準備

1. はさみ、鉗子、解剖ピンを70%エタノールを使用して滅菌します。
2. 25〜27ゲージの針が付いた1mLシリンジを2本準備します。皮下注射の場合は、マイクロシリンジを使用して上部フットパッドに10μLを注入することをお勧めします。
3. プラスチック製の1.5 mLチューブに、滅菌PBSで希釈した200 μLのDyLight 488標識レクチンを最終濃度100 μg/mLで調製します。
4. 別のプラスチックに、1.5 mLチューブで、滅菌PBSで希釈したDyLight 649標識レクチン100 μLを最終濃度100 μg/mLで調製します。
5. PBSが入った6ウェルプレートを調製し、氷上に置いておきます。
6. 4%パラホルムアルデヒドと30%スクロースの溶液を調製します。

2.皮下脂肪組織、血液、リンパ管のラベリング。

1. 5%イソフルランを吸入してマウスに麻酔をかけます。動物の足をしっかりとつまんで麻酔の深さを評価し、処置中に動物が傷つけられないようにします。麻酔は、レクチン注射ステップが終了するまで、または安楽死するまで維持する必要があります。
2. DyLight 488-conjugated lectinを100 μLの尾静脈に静脈内注入し、血液血管系を標識します。15分待ってから、組織の採取に進みます。
3. 別のシリンジを使用して、10 μLのDyLight 649標識レクチンを動物の上部フットパッドに皮下注射し、排液リンパ管を標識します。15分待ってから、組織の採取に進みます。
4. 注射後15分で子宮頸部脱臼またはCO₂ への曝露によりマウスを安楽死させます。

3. 皮下脂肪組織の採取

1. マウスを仰向けに解剖ボードの上に置きます。
2. マウスの毛皮を70%エタノールを使用して滅菌します。
3. 鉗子を使用して脇腹の皮膚を持ち上げ、横切開を行って上腕脂肪パッドを露出させます。
4. 皮膚をそっと引っ張って上腕脂肪組織デポーから解離させ、リンパ節とリンパ集電器を含む皮下上腕脂肪組織全体が現れます。
5. 鉗子やハサミを使って、皮下脂肪貯蔵庫をやさしく取り除き、冷たいPBSが入った皿に移します。最良の結果を得るには、脂肪貯蔵庫を1つのピースとして取り外すことをお勧めします。
6. ここからは、組織を光から保護します。

4. 組織固定

1. 採取した組織を4%のパラホルムアルデヒドと30%のスクロースを含む溶液に浸します。
2. イメージング用に準備する前に、この溶液で組織を少なくとも一晩インキュベートします。

5. 染色とイメージング

1. 最適な結果を得るには、Gilleroon ら²⁰ で説明されているように、組織の透明化と 3D 共焦点取得を行います。大きな組織の分析には、ライトシート顕微鏡の使用をお勧めします。透明化プロセス中に追加の染色を行うことができます。
2. 最適な組織マッピングを実現するには、以下の抗体を使用します。
   脂肪細胞の場合:ペリリピン
   マクロファージの場合:CD68およびCD11b染色。
   樹状細胞の場合:MHC IIおよびCD11b。
   B細胞の場合:B220(CD45R)染色。
   T細胞の場合:CD3染色。
   注:この方法は、免疫細胞を標識するための遺伝子モデルの使用と互換性があります。
3. 生体内2光子顕微鏡によるリンパ集塊血管の解析には、下部フットパッドにレクチンを皮下注入し、膝窩リンパ管を可視化します。

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結果

上腕脂肪組織の血液とリンパ管ネットワークのトポロジカル解析を行うため、Alexa Fluor 649標識レクチンを皮下注射し、Alexa Fluor 488標識レクチンを静脈注射しました。上腕脂肪組織を慎重に切除し、固定し、クリアリングプロトコルに提出し、ホールマウント染色によって分析しました。この手順の概略図を 図 1A に示します。血管は緑で、リン?...

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ディスカッション

このアプローチにより、皮下脂肪組織の血液およびリンパ管系の効率的で堅牢な標識が可能になります。血液とリンパ管の内皮ネットワークを別々に解析することで、肥満やその他の病的状態の際に循環器系の一方または両方に影響を与える病理学的メカニズムが解明される可能性があります。このプロトコルは、血管系の構造、間質細胞や免疫細胞との相互作用、...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin DyLight 649	Vector Labs	DL-1178-1	Described in protocol
Lectin DyLight 488	Vector Labs	DL-1174	Described in protocol
Paraformaldehyde	VWR Chemicals	9713.1000
Sucrose	Euromedex	CAS Number 57-50-1
Anti-Podoplanin	AngioBio	11-033	Dilution : 1/50
Lectin DyLight 594	Vector Labs	DL-1177	Described in protocol
Anti-MHCII (Clone M5/114.15.2)	Biolegend	107618	Dilution : 1/100
Anti-CD11b (Clone M1/70)	Biolegend	101218	Dilution : 1/100
Anti-CD68 (Clone FA.11)	Biolegend	137004	Dilution : 1/100
Anti-B220 (Clone RA3-6B2)	Biolegend	103225	Dilution : 1/100
Anti-Perilipin (Clone PERI 112.17)	Progen	651156	Dilution : 1/50
Anti-CD3 (Clone 17A2)	Biolegend	100210	Dilution : 1/100