Diseño y desarrollo de un adaptador de alineación de máscara de microscopio impreso tridimensionalmente para la fabricación de dispositivos microfluídicos multicapa

Resumen

Este proyecto permite a los pequeños laboratorios desarrollar una plataforma fácil de usar para la fabricación de dispositivos microfluídicos multicapa precisos. La plataforma consiste en un adaptador de alineación de máscara de microscopio impreso tridimensionalmente con el que se lograron dispositivos microfluídicos multicapa con errores de alineación de <10 μm.

Resumen

Este proyecto tiene como objetivo desarrollar una plataforma fácil de usar y rentable para la fabricación de dispositivos microfluídicos precisos y multicapa, que generalmente solo se pueden lograr utilizando equipos costosos en un entorno de sala limpia. La parte clave de la plataforma es un adaptador de alineación de máscara de microscopio (MMAA) impreso tridimensionalmente (3D) compatible con microscopios ópticos regulares y sistemas de exposición a la luz ultravioleta (UV). El proceso general de creación del dispositivo se ha simplificado enormemente debido al trabajo realizado para optimizar el diseño del dispositivo. El proceso implica encontrar las dimensiones adecuadas para los equipos disponibles en el laboratorio e imprimir en 3D el MMAA con las especificaciones optimizadas. Los resultados experimentales muestran que el MMAA optimizado diseñado y fabricado por impresión 3D funciona bien con un microscopio común y un sistema de exposición a la luz. Utilizando un molde maestro preparado por el MMAA impreso en 3D, los dispositivos microfluídicos resultantes con estructuras de múltiples capas contienen errores de alineación de <10 μm, que es suficiente para microchips comunes. Aunque el error humano a través del transporte del dispositivo al sistema de exposición a la luz UV puede causar errores de fabricación más grandes, los errores mínimos logrados en este estudio son alcanzables con práctica y cuidado. Además, el MMAA se puede personalizar para adaptarse a cualquier microscopio y sistema de exposición a los rayos UV realizando cambios en el archivo de modelado en el sistema de impresión 3D. Este proyecto proporciona a los laboratorios más pequeños una herramienta de investigación útil, ya que solo requiere el uso de equipos que normalmente ya están disponibles para los laboratorios que producen y utilizan dispositivos microfluídicos. El siguiente protocolo detallado describe el diseño y el proceso de impresión 3D para el MMAA. Además, los pasos para adquirir un molde maestro multicapa utilizando el MMAA y producir chips microfluídicos de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) también se describen aquí.

Introducción

Un campo bien desarrollado y prometedor en la investigación de ingeniería es la microfabricación debido a la vasta extensión de aplicaciones que emplean plataformas microfluídicas. La microfabricación es un proceso en el que las estructuras se producen con características de tamaño μm o menor utilizando diferentes compuestos químicos. A medida que la investigación microfluídica se ha desarrollado en los últimos 30 años, la litografía blanda se ha convertido en la técnica de microfabricación más popular con la que producir microchips hechos de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) o sustancias similares. Estos microchips se han utilizado ampliamente para la miniaturización de prácticas de laboratorio comunes^1,2,3,4 y se han convertido en poderosas herramientas de investigación para que los ingenieros imiten los procesos de reacción^5,6,7,estudien los mecanismos de reacción e imiten los órganos que se encuentran en el cuerpo humano in vitro (por ejemplo, órgano en un chip)^8,9,10. Sin embargo, a medida que aumenta la complejidad de la aplicación, es típico que un diseño de dispositivo microfluídico más complejo permita una mejor replicación del sistema de la vida real que se pretende imitar.

El procedimiento básico de litografía blanda consiste en recubrir un sustrato con una sustancia fotorresistia y colocar una fotomáscara sobre el sustrato recubierto antes de someter el sustrato a la luz UV¹¹. La fotomáscara tiene regiones transparentes que imitan el patrón deseado de los canales del dispositivo microfluídico. Al someter el sustrato recubierto a la luz UV, las regiones transparentes permiten que la luz UV penetre a través de la fotomáscara, haciendo que la fotorresistente se ticulte. Después del paso de exposición, la fotorresistente no reticulada se lava con un revelador, dejando estructuras sólidas con el patrón deseado. A medida que la complejidad de los dispositivos microfluídicos se hace mayor, requieren una construcción de múltiples capas con dimensiones extremadamente precisas. El proceso de microfabricación multicapa es mucho más difícil en comparación con la microfabricación de una sola capa.

La microfabricación multicapa requiere una alineación precisa de las características de la primera capa con los diseños de la segunda máscara. Normalmente, este proceso se realiza utilizando un alineador de máscara comercial, que es costoso y requiere capacitación para operar la maquinaria. Por lo tanto, el proceso de microfabricación multicapa es típicamente inalcanzable para los laboratorios más pequeños que carecen de los fondos o el tiempo para tales esfuerzos. Si bien se han desarrollado varios otros alineadores de máscaras personalizados, estos sistemas a menudo requieren la compra y el ensamblaje de muchas piezas diferentes y aún pueden ser bastante complejos^12,13,14. Esto no solo es costoso para los laboratorios más pequeños, sino que también requiere tiempo y capacitación para construir, comprender y usar el sistema. El alineador de máscaras detallado en este documento buscó aliviar estos problemas, ya que no hay necesidad de comprar equipos adicionales, solo requieren equipos que generalmente ya están presentes en los laboratorios que producen y usan dispositivos microfluídicos. Además, el alineador de máscaras se fabrica mediante impresión 3D, que con el reciente avance de la tecnología de impresión 3D, se ha vuelto fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios y universidades a un costo asequible.

El protocolo detallado en este documento tiene como objetivo crear un alineador de máscara alternativo rentable y de fácil operación. El alineador de máscaras que se detalla aquí puede hacer que la microfabricación multicapa sea factible para laboratorios de investigación sin instalaciones de fabricación convencionales. Usando el adaptador de alineación de máscara de microscopio (MMAA), se pueden lograr microchips funcionales con características complejas utilizando una fuente de luz UV regular, microscopio óptico y equipo de laboratorio común. Los resultados muestran que el MMAA funciona bien con un sistema de ejemplo que utiliza un microscopio vertical y una caja de exposición a la luz UV. El MMAA producido utilizando el proceso de impresión 3D se utilizó para adquirir un molde maestro bicapa de un dispositivo microfluídico de espiga con errores de alineación mínimos. Utilizando el molde maestro fabricado con un MMAA impreso en 3D, se prepararon dispositivos microfluídicos con estructuras de múltiples capas que contenían errores de alineación de <10 μm. El error de alineación de <10 μm es lo suficientemente mínimo como para no dificultar la aplicación del dispositivo microfluídico.

Además, se confirmó la alineación exitosa de un molde maestro de cuatro capas producido con el MMAA, y se determinó que los errores de alineación eran de < 10 μm. La funcionalidad del dispositivo microfluídico y los errores de alineación mínimos validan la aplicación exitosa del MMAA en la creación de dispositivos microfluídicos multicapa. El MMAA se puede personalizar para adaptarse a cualquier microscopio y sistema de exposición a los rayos UV realizando cambios menores en el archivo de la impresora 3D. El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para ajustar el MMAA para que se ajuste al equipo disponible en cada laboratorio e imprimir en 3D el MMAA con las especificaciones requeridas. Además, el protocolo detalla cómo desarrollar un molde maestro multicapa utilizando el sistema y posteriormente producir dispositivos microfluídicos PDMS utilizando el molde maestro. La generación del molde maestro y los chips microfluídicos permite al usuario probar la efectividad del sistema.

Protocolo

1. Diseño del MMAA

1. Obtener las dimensiones de la bandeja del sistema de emisión de luz UV disponible para que sea el límite superior para las dimensiones del soporte de oblea (o unidad de exposición UV) que se muestra en la Figura 1. Como se muestra en la Figura 2A,mida el diámetro (d) del borde circular interior, la altura interna (h) de la bandeja del sistema de emisión de luz UV, el ancho total (w) y la longitud (l) de la bandeja.
   NOTA: Como ejemplo, el sistema de exposición a la luz UV disponible tenía dimensiones de bandeja interior de 5 pulgadas (") x 5" x 0.25" con un recorte circular de 4". Las dimensiones del MMAA se diseñaron para que no fueran mayores que las dimensiones de la bandeja interior para ajustarse correctamente y sentarse planas dentro de la bandeja del sistema, como se muestra en la Figura 2B. Vea la Figura 3 para las piezas impresas en 3D del MMAA: oblea de silicio recubierta de fotorresistente y un sujetador para fijar la configuración al microscopio.
2. Mida la longitud entre los tornillos en la etapa de microscopio vertical disponible que mantiene el soporte deslizante en su lugar. Además, mida el ancho de los tornillos. Aplique estas dimensiones para personalizar el soporte magnético (Figura 1) para que se ajuste al microscopio disponible para permitir una fijación fácil y precisa del MMAA al microscopio (Figura 4A).
3. Utilizando una aplicación de diseño por computadora disponible, personalice el soporte de la oblea y el sujetador del microscopio magnético para que se ajusten a las dimensiones medidas. Diseñe la altura, el ancho y la longitud del soporte de la oblea para que no sean mayores que la altura (h), el ancho (w) y la longitud (l) de la bandeja del sistema de emisión de luz UV. Además, incluya el recorte circular en la parte inferior del soporte de la oblea con el mismo diámetro (d) que la bandeja del sistema de emisión de luz UV. Generar archivos STL o CAD para las dos piezas del MMAA que se utilizarán para la impresión 3D del dispositivo (ver Material suplementario).

2.3D Impresión del MMAA

1. Cargue los archivos STL o CAD generados en el software de impresión 3D disponible. 3D-Imprimir las dos piezas del MMAA siguiendo el procedimiento adecuado para el proceso 3D y la impresora utilizada. Complete las piezas siguiendo los pasos posteriores a la impresión requeridos (por ejemplo, eliminación del material de soporte, eliminación de resina sin curar, pasos adicionales de lavado o curado). Alternativamente, utilice una instalación de impresión 3D disponible para imprimir y completar las piezas diseñadas en otro lugar.
2. Asegúrese de que el soporte de la oblea se ajuste bien y se asiente plano dentro de la bandeja del sistema de exposición a la luz UV disponible(Figura 2B). Además, asegúrese de que el sujetador del microscopio esté conectado a la etapa del microscopio y se pueda mover fácilmente utilizando las perillas que controlan las posiciones x e y de la etapa del microscopio(Figura 4A).
3. Una vez finalizadas las piezas, inserte y fije los imanes en el soporte de la oblea y el sujetador del microscopio(Figura 3A),utilizando súper pegamento o cualquier otra sustancia fijadora. Deje que el pegamento se seque antes de probar el sistema.
   NOTA: Si se desea, primero se puede imprimir una pieza protype utilizando una impresora 3D de modelado por deposición fundida (FDM) para ahorrar recursos y dinero¹⁵. Este protipo se puede evaluar para un ajuste preciso al equipo disponible, y el diseño se puede modificar, si es necesario. El dispositivo final se puede imprimir utilizando un proceso más preciso (por ejemplo, estereolitografía) para una mejor precisión. El dispositivo final también se puede imprimir con un acabado translúcido para un uso óptimo bajo el microscopio.

3. Pruebas experimentales de la MMAA

1. Diseño e impresión de las fotomáscaras de dispositivos microfluídicos con marcadores de alineación
   1. Utilice una aplicación de diseño informático para diseñar fotomáscaras para el dispositivo microfluídico bicapa deseado.
   2. Incluya estructuras adicionales en el lado de las estructuras del canal del dispositivo microfluídico que actuarán como marcadores de alineación (más cerca del borde de la fotomáscara / molde maestro) como se muestra en la Figura 5A,B. Asegúrese de que haya un marcador de alineación a cada lado del dispositivo microfluídico (para un total de al menos cuatro). Además, asegúrese de que la fotomáscara contenga un borde recto que pueda alinearse perfectamente con el borde recto de la oblea de silicio.
      NOTA: La mayor complejidad de la estructura del marcador de alineación permitirá una mayor precisión de alineación de las capas adicionales. Como mínimo, se debe utilizar una estructura cruzada simple con medidas de 1 mm x 1 mm (Figura 6A). Un ejemplo de los marcadores de alineación se puede ver en las esquinas y el borde medio inferior de la Figura 5A,B,que representan las fotomáscaras de primera y segunda capa utilizadas para generar un molde maestro de doble capa.
   3. Imprima las fotomáscaras a través de un proveedor comercial o a través de otras instalaciones accesibles
2. Creación del molde maestro bicapa utilizando el MMAA (fotolitografía)
   1. Utilizando técnicas de fotolitografía estándar e instrucciones del fabricante de la fotorresistción, cree la primera capa del molde maestro utilizando la fotomáscara de la primera capa¹⁶. Use una oblea de silicio de 4"con la fotorresistente adecuada (es decir, SU-8) para crear el espesor de capa deseado. Asegúrese de que el grosor de la primera capa sea mayor que el de las capas posteriores para facilitar la identificación de los marcadores de alineación.
   2. Use un rotulador de color claro (por ejemplo, dorado) para colorear los marcadores de alineación de la primera capa en los cuatro lados.
   3. Siguiendo las instrucciones del fabricante de la fotorresistente, inicie la segunda capa del molde maestro mediante el recubrimiento de la fotorresistente sobre la oblea y realice el horneado suave¹⁶. Inserte la oblea recubierta en el soporte de la oblea del MMAA(Figura 3B)y fije la oblea recubierta al MMAA con cinta adhesiva.
   4. Conecte el soporte de la oblea al microscopio vertical disponible utilizando el sujetador del microscopio magnético (Figura 4A). Mueva la posición del MMAA usando las perillas de dirección X e Y de la etapa del microscopio hasta que uno de los marcadores de alineación de color en la oblea esté a la vista a través de la lente del microscopio.
   5. Inserte la fotomáscara de segunda capa en el soporte de la oblea, en la parte superior de la oblea recubierta (Figura 3C). Asegúrese de que los marcadores de alineación de color de la primera capa se puedan ver parcialmente a través de los marcadores de alineación en la fotomáscara.
   6. Conecte la fotomáscara a un elevador de tijera (también conocido como gato de soporte) a través de uno de los recortes laterales(Figura 4B)con cinta adhesiva. Utilice el elevador de tijera para ajustar la posición en dirección Z de la fotomáscara hasta que se encuentre justo encima de la oblea recubierta(Figura 3C).
      NOTA: El elevador de tijera permite un ajuste fino de la posición z de la fotomáscara, ya que el elevador de tijera se puede utilizar para mover la posición de la fotomáscara adjunta en la dirección z.
   7. Mientras mantiene la fotomáscara quieta, mire a través de la lente del microscopio e identifique los marcadores de alineación de color de la primera capa debajo de los marcadores de alineación de la fotomáscara. Utilice las perillas de dirección X e Y de la etapa del microscopio para mover la posición del MMAA(Figura 4D). Ajuste la posición del MMAA hasta que el marcador de alineación en la fotomáscara se superponga con el marcador de alineación de color en la primera capa(Figura 6A,B)observando la posición de los marcadores de alineación a través de la lente del microscopio.
   8. Aplique con cuidado una ligera fuerza a la fotomáscara y use cinta adhesiva para asegurar la fotomáscara en su lugar en la parte superior de la oblea recubierta. Separe la fotomáscara del elevador de tijera. Asegúrese de que los cuatro marcadores de alineación de la fotomáscara estén alineados con los cuatro marcadores de alineación de la primera capa.
   9. Una vez que se logre la alineación, separe cuidadosamente el soporte de la oblea de la etapa del microscopio. Inserte la placa superior de vidrio en la parte superior de la oblea y la fotomáscara para disminuir el espacio entre las dos piezas (Figura 1). Coloque todo el soporte de la oblea en el sistema de exposición a la luz UV disponible como se muestra en la Figura 4E. Exponga la segunda capa durante el tiempo y la intensidad de luz adecuados, tal como se describe en las instrucciones del fabricante de la fotorresistción¹⁶.
   10. Retire el soporte de la oblea del sistema de exposición a la luz UV. Retire la oblea recubierta del soporte de la oblea y desmonte la fotomáscara de la oblea. Completar el procesamiento de la segunda capa (por ejemplo, después de hornear, desarrollar y enjuagar y secar) según las instrucciones del fabricante de la fotorresistción¹⁶.
       NOTA: El recubrimiento de centrifugado exacto, la cocción suave, la exposición, la post-cocción y las condiciones de desarrollo (tiempo, temperatura) variarán según la fotorresistción que se utilice y el espesor de la capa deseado. Las condiciones reales y el procedimiento exacto de fotolitografía deben basarse en las instrucciones del fabricante de la fotorresistción.
3. Preparación de un dispositivo microfluídico utilizando el molde maestro (litografía blanda)
   1. Recupere el molde maestro y asegúrelo en medio de una placa de Petri de plástico de 150 mm x 15 mm con cinta.
   2. Prepare ~ 15-20 g de PDMS según las instrucciones del fabricante. Coloque el PDMS en una cámara de vacío o déjelo reposar hasta que esté libre de burbujas. Vierta el PDMS en la placa de Petri que contiene el molde maestro.
   3. Deje que la placa de Petri con el molde maestro descanse en la encimera hasta que el PDMS esté libre de burbujas. Coloque la placa de Petri en un horno a 65 °C hasta que el PDMS esté completamente curado (al menos 3 h).
   4. Recorte el PDMS para revelar las estructuras de microcanales. Corte el PDMS alrededor de las estructuras de microcanales en microchips separados y cree los orificios de entrada y salida para el dispositivo microfluídico. Use cinta adhesiva para eliminar suavemente cualquier partícula pequeña que pueda estar en la superficie del PDMS.
   5. Complete la fabricación del microchip uniendo el chip PDMS al PDMS o un portaobjetos de microscopio tratando con plasma el chip PDMS y el sustrato adicional.
4. Determinación del error de alineación
   1. Recupere el molde maestro y use el microscopio vertical para determinar la distancia de espacio (error de alineación) entre la primera capa y la segunda capa. Haga esto simplemente midiendo la distancia por la cual la segunda capa se desplaza y desalinea de la primera capa en las estructuras de microcanales (consulte la Figura 5D para ver un ejemplo de una distancia de brecha medida).
   2. Utilice el microscopio vertical para determinar si el chip PDMS contiene paredes de canal rectas con bordes de dispositivo claros. Además, verifique el chip PDMS para detectar posibles defectos que puedan obstaculizar la funcionalidad del dispositivo.
      NOTA: Es posible que sea necesario repetir la fabricación del molde maestro (secciones 3.2 y 3.3) para lograr un menor error de alineación. Se ha demostrado que la práctica repetida con el MMAA mejora la capacidad del usuario para crear un molde maestro bien alineado. Además, las imágenes se pueden obtener mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)(Figura 7)para confirmar el error de alineación.

Resultados

A través de la optimización y el uso del MMAA(Figura 1),se fabricaron moldes maestros multicapa con un error de alineación mínimo. El MMAA final se fabricó utilizando el proceso de impresión 3D de fabricación de filamentos fundidos (FFF)(Figura 2). El proceso FFF confiere una mayor precisión para las dimensiones deseadas del dispositivo. El MMAA consta de dos piezas principales(Figura 3):la pieza base y el cierre personaliz...

Discusión

El protocolo mencionado anteriormente describe el procedimiento para imprimir en 3D un MMAA y utilizar el sistema para crear un molde maestro de dispositivo microfluídico preciso y multicapa. Aunque el dispositivo es fácil de usar, hay pasos críticos dentro del protocolo que requieren práctica y cuidado para garantizar la alineación adecuada de las capas maestras del molde. El primer paso crítico es el diseño del MMAA. Es esencial al diseñar el MMAA determinar las medidas exactas para el dispositivo que permitir?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylonitrile Butadiene Styrene (ABS), 3D Printing Filament			Provided by the Texas Tech University 3D printing facility
BX53, Upright Microscope	Olympus
Form 2, Stereolithography 3D printer	Formlabs
Advanced Hot Plate Stirrer	VWR	97042-642
Isoproyl Alcohol, 70% (v/v)	VWR	BDH7999-4
Light Colored Marker	Sharpie
Magnets, 3 mm x 3 mm	WOTOY		ASIN #: B075PLVW8W
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	4019862
Petri Dish, 150 mm x 15 mm	VWR	25384-326
Printed Photomasks	CAD/Art Services, Inc.
Aluminum Support Jack - 8" x 8", Scissor Lift	VWR	12620-904
Silicon Wafer	University Wafer	452
Sodium Hydroxide	VWR
Sonication Bath	Branson	CPX3800H
Spin Coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPPB
STRATASYS SR-30	MakerBot Industries, LLC	SR-30	Dissolvable support material for 3D printing
Stratasys uPrint SE 3D Printer	Computer Aided Technology, LLC
SU-8 50	Kayaku	Y131269 0500L1GL
SU-8 100	Kayaku	Y131273 0500L1GL
SU-8 Developer	Kayaku	Y020100 4000L1PE
Super glue	Gorilla Glue
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tape	Scotch
Form Cure, UV Curing Chamber	Formlabs	FH-CU-01
UV-KUB2, UV Light-Exposure Box	Kloe	UV-KUB2