Проектирование и разработка адаптера выравнивания масок трехмерно-печатного микроскопа для изготовления многослойных микрофлюидных устройств

Резюме

Этот проект позволяет небольшим лабораториям разработать простую в использовании платформу для изготовления точных многослойных микрофлюидных устройств. Платформа состоит из трехмерно напечатанного адаптера выравнивания маски микроскопа, с помощью которого были достигнуты многослойные микрофлюидные устройства с погрешностью выравнивания <10 мкм.

Аннотация

Этот проект направлен на разработку простой в использовании и экономически эффективной платформы для изготовления точных, многослойных микрофлюидных устройств, что, как правило, может быть достигнуто только с использованием дорогостоящего оборудования в условиях чистой комнаты. Ключевой частью платформы является трехмерный (3D) печатный адаптер выравнивания масок микроскопа (MMAA), совместимый с обычными оптическими микроскопами и системами воздействия ультрафиолетового (УФ) света. Общий процесс создания устройства был значительно упрощен из-за работы, проделанной для оптимизации конструкции устройства. Процесс включает в себя поиск подходящих размеров для оборудования, доступного в лаборатории, и 3D-печать MMAA с оптимизированными спецификациями. Экспериментальные результаты показывают, что оптимизированная MMAA, разработанная и изготовленная с помощью 3D-печати, хорошо работает с обычным микроскопом и системой воздействия света. Используя мастер-форму, подготовленную 3D-печатной MMAA, полученные микрофлюидные устройства с многослойными структурами содержат ошибки выравнивания <10 мкм, что достаточно для обычных микрочипов. Хотя человеческая ошибка при транспортировке устройства в систему воздействия ультрафиолетового света может привести к большим ошибкам изготовления, минимальные ошибки, достигнутые в этом исследовании, достижимы с практикой и осторожностью. Кроме того, MMAA может быть настроен для любого микроскопа и системы воздействия ультрафиолета путем внесения изменений в файл моделирования в системе 3D-печати. Этот проект предоставляет небольшим лабораториям полезный исследовательский инструмент, поскольку он требует только использования оборудования, которое обычно уже доступно для лабораторий, производящего и использующего микрофлюидные устройства. Следующий подробный протокол описывает процесс проектирования и 3D-печати для MMAA. Кроме того, в настоящем описаны этапы получения многослойной мастер-формы с использованием MMAA и получения микрофлюидных чипов из поли(диметилсилоксана) (PDMS).

Введение

Хорошо развитой и перспективной областью инженерных исследований является микропроизводствование из-за огромного пространства приложений, использующих микрофлюидные платформы. Микрофабрикация - это процесс, в котором структуры производятся с мкм- или меньшими размерами с использованием различных химических соединений. Поскольку микрофлюидные исследования развивались в течение последних 30 лет, мягкая литография стала наиболее популярным методом микропроизводство, с помощью которого можно производить микрочипы из поли(диметилсилоксана) (PDMS) или аналогичных веществ. Эти микрочипы широко использовались для миниатюризации распространенных лабораторных практик^{1,2,3, 4} и стали мощными исследовательскими инструментами для инженеров для имитации реакционных процессов^5,6,7,изучения механизмов реакций и мимических органов, обнаруженных в организме человека in vitro (например, орган-на-чипе)^8,9,10. Однако по мере увеличения сложности приложения характерно, что более сложная конструкция микрофлюидного устройства позволяет лучше тиражировать реальную систему, которую оно призвано имитировать.

Основная процедура мягкой литографии включает в себя покрытие подложки фоторезистентным веществом и размещение фотомаски над покрытой подложкой перед подвергнутием подложку ультрафиолетовому излучению^11. Фотомада имеет прозрачные области, которые имитируют желаемый рисунок каналов микрофлюидного устройства. При воздействии на подложку с покрытием ультрафиолетового света прозрачные области позволяют ультрафиолетовому свету проникать через фотомаску, в результате чего фоторезист сшивается. После этапа экспозиции несшитый фоторезист смывается с помощью разработчика, оставляя твердые структуры с предполагаемым рисунком. По мере того, как сложность микрофлюидных устройств становится все больше, они требуют многослойной конструкции с чрезвычайно точными размерами. Процесс многослойного микрофабрикации намного сложнее по сравнению с однослойным микропроизводствием.

Многослойное микрофабрикация требует точного выравнивания признаков первого слоя с рисунками на второй маске. Как правило, этот процесс выполняется с использованием коммерческого элайнера для масок, который является дорогостоящим и требует обучения для работы с оборудованием. Таким образом, процесс многослойного микропроизводства, как правило, недостижим для небольших лабораторий, которым не хватает средств или времени для таких усилий. В то время как было разработано несколько других изготовленных на заказ элайнеров для масок, эти системы часто требуют покупки и сборки множества различных деталей и все еще могут быть довольно^{сложными 12,13,14.} Это не только дорого для небольших лабораторий, но и требует времени и обучения для создания, понимания и использования системы. Элайнер для масок, подробно описанный в этой статье, стремился смягчить эти проблемы, поскольку нет необходимости в покупке дополнительного оборудования, требуется только оборудование, которое обычно уже присутствует в лабораториях, производящих и использующих микрофлюидные устройства. Кроме того, выравниватель масок изготавливается с помощью 3D-печати, которая с недавним развитием технологии 3D-печати стала легко доступной для большинства лабораторий и университетов по доступной цене.

Протокол, подробно описанный в этой статье, направлен на создание экономически эффективного и простого в эксплуатации альтернативного элайнера масок. Маскировочный элайнер, описанный в настоящем описании, может сделать многослойное микропроизводственное производство возможным для исследовательских лабораторий без обычных производственных средств. Используя адаптер выравнивания масок микроскопа (MMAA), функциональные микрочипы со сложными функциями могут быть достигнуты с использованием обычного источника ультрафиолетового света, оптического микроскопа и общего лабораторного оборудования. Результаты показывают, что MMAA хорошо работает с примером системы, использующего вертикальный микроскоп и блок воздействия ультрафиолетового света. MMAA, изготовленный с использованием процесса 3D-печати, был использован для получения двухслойной главной формы микрофлюидного устройства елочкой с минимальными ошибками выравнивания. С помощью мастер-формы, изготовленной с помощью 3D-печатной MMAA, микрофлюидные устройства были подготовлены с многослойными структурами, содержащими ошибки выравнивания <10 мкм. Погрешность выравнивания <10 мкм достаточно минимальна, чтобы не препятствовать применению микрофлюидного устройства.

Кроме того, было подтверждено успешное выравнивание четырехслойной мастер-формы, изготовленной с использованием MMAA, и были определены ошибки выравнивания <10 мкм. Функциональность микрофлюидного устройства и минимальные ошибки выравнивания подтверждают успешное применение MMAA при создании многослойных микрофлюидных устройств. MMAA может быть настроен для любого микроскопа и системы воздействия ультрафиолета, внеся незначительные изменения в файл на 3D-принтере. В следующем протоколе описываются шаги, необходимые для тонкой настройки MMAA в соответствии с оборудованием, доступным в каждой лаборатории, и 3D-печати MMAA с требуемыми спецификациями. Кроме того, в протоколе подробно описывается, как разработать многослойную мастер-форму с использованием системы и впоследствии производить микрофлюидные устройства PDMS с использованием мастер-формы. Генерация мастер-формы и микрофлюидных чипов затем позволяет пользователю проверить эффективность системы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Проектирование MMAA

1. Получите размеры лотка доступной системы излучения ультрафиолетового излучения в верхней границе для размеров держателя пластины (или блока воздействия ультрафиолета), показанного на рисунке 1. Как показано на рисунке 2A,измерьте диаметр (d) внутреннего круглого обода, внутреннюю высоту (h) лотка системы излучения ультрафиолетового излучения, общую ширину (w) и длину (l) лотка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, доступная система воздействия ультрафиолетового света имела внутренние размеры лотка 5 дюймов (") x 5" x 0,25" с 4-дюймовым круглым вырезом. Затем размеры MMAA были спроектированы так, чтобы быть не превышали размеры внутреннего лотка, чтобы правильно вписаться и расположиться в лотке системы, как показано на рисунке 2B. См. рисунок 3 для 3D-печатных частей MMAA: кремниевая пластина с фоторезистовым покрытием и застежка для фиксации установки на микроскопе.
2. Измерьте длину между винтами на доступной вертикальной ступени микроскопа, которые удерживают держатель слайда на месте. Дополнительно измерьте ширину винтов. Примените эти размеры для настройки магнитного держателя(рисунок 1)в соответствии с имеющимся микроскопом, чтобы обеспечить легкую и точную фиксацию MMAA на микроскопе(рисунок 4A).
3. Используя доступное приложение для проектирования компьютеров, настройте держатель пластины и крепеж магнитного микроскопа в соответствии с измеренными размерами. Спроектируйте высоту, ширину и длину держателя пластины не более высоты (h), ширины (w) и длины (l) лотка системы излучения ультрафиолетового излучения. Кроме того, включите круглый вырез в нижней части держателя пластины с тем же диаметром (d), что и лоток системы излучения ультрафиолетового излучения. Создайте файлы STL или CAD для двух частей MMAA, которые будут использоваться для 3D-печати устройства (см. Дополнительные материалы).

2.3D Печать MMAA

1. Загрузите сгенерированные файлы STL или CAD в доступное программное обеспечение для 3D-печати. 3D-Печать двух частей MMAA, следуя соответствующей процедуре для 3D-процесса и используемого принтера. Заполните детали, выполнив все необходимые этапы после печати (например, удаление опорного материала, удаление неотверждающейся смолы, дополнительные этапы промывки или отверждения). В качестве альтернативы, используйте доступную возможность 3D-печати, чтобы напечатать и завершить разработанные части в другом месте.
2. Убедитесь, что держатель пластины хорошо сидит и сидит ровно внутри лотка доступной системы воздействия ультрафиолетового света(рисунок 2B). Кроме того, убедитесь, что крепление микроскопа прикреплено к ступени микроскопа и может легко перемещаться с помощью ручек, которые контролируют x- и y- положения ступени микроскопа(рисунок 4A).
3. После того, как детали были завершены, вставьте и закрепите магниты в держателе пластины и крепеж микроскопа(рисунок 3A),используя суперклей или любое другое фиксирующие вещества. Дайте клею высохнуть перед тестированием системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании протип может быть сначала напечатан с помощью 3D-принтера Fused Deposition Modeling (FDM) для экономии ресурсов и денег^15. Затем этот протип может быть оценен на соответствие имеющееся оборудованию, а затем конструкция может быть изменена, если это необходимо. Затем конечное устройство может быть напечатано с использованием более точного процесса (например, стереолитографии) для большей точности. Конечное устройство также может быть напечатано с полупрозрачным покрытием для оптимального использования под микроскопом.

3. Экспериментальные испытания MMAA

1. Проектирование и печать фотошаг микрофлюидного устройства с маркерами выравнивания
   1. Используйте приложение для компьютерного проектирования для проектирования фотомаск для желаемого двухслойного микрофлюидного устройства.
   2. Включите дополнительные структуры на стороне микрофлюидного устройства канальных структур, которые будут действовать как маркеры выравнивания (ближе к краю фотомаски / главной формы), как показано на рисунке 5A,B. Убедитесь, что на каждой стороне микрофлюидного устройства есть один маркер выравнивания (в общей сложности не менее четырех). Кроме того, убедитесь, что фотомаза содержит прямой край, который может идеально совпадать с прямым краем кремниевой пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая тонкость структуры маркера выравнивания позволит повысить точность выравнивания дополнительных слоев. По крайней мере, следует использовать простую поперечно-поперечно-поперечное сооружение с размерами 1 мм х 1 мм(рисунок 6А). Пример маркеров выравнивания можно увидеть в углах и нижнем среднем крае рисунка 5A,B,которые изображают фотомаска первого и второго слоя, используемые для создания двухслойной мастер-формы.
   3. Печать фотомашек либо через коммерческого поставщика, либо через другие доступные средства
2. Создание двухслойной мастер-формы с использованием MMAA (фотолитография)
   1. Используя стандартные методы фотолитографии и инструкции производителя фоторезиста, создайте первый слой мастер-формы, используя первый слой фотомаски^16. Используйте 4" кремниевую пластину с соответствующим фоторезистом (т.е. SU-8) для создания желаемой толщины слоя. Убедитесь, что толщина первого слоя больше, чем у последующих слоев, для легкой идентификации маркеров выравнивания.
   2. Используйте светлую маркерную ручку (например, золотую), чтобы окрасить маркеры выравнивания первого слоя со всех четырех сторон.
   3. Используя инструкции производителя фоторезиста, инициируйте второй слой мастер-формы, раскручивая фоторезист на пластину и выполняя мягкую выпечку^16. Вставьте пластину с покрытием в держатель пластин MMAA(рисунок 3B)и закрепите пластину с покрытием на MMAA с помощью ленты.
   4. Прикрепите держатель пластины к имеющейся вертикальной микроскопии с помощью магнитного крепежа микроскопа(рисунок 4А). Перемещайте положение MMAA с помощью ручек x- и Y-направления ступени микроскопа до тех пор, пока один из цветных маркеров выравнивания на пластине не будет виден через линзу микроскопа.
   5. Вставьте фотомаску второго слоя в держатель пластины поверх пластины с покрытием(рисунок 3C). Убедитесь, что цветные маркеры выравнивания первого слоя частично видны через маркеры выравнивания на фотомаске.
   6. Прикрепите фотомаску к ножничному подъемнику (также известному как опорный домкрат) через один из боковых вырезов(рисунок 4B)с помощью ленты. Используйте ножничный подъемник, чтобы отрегулировать положение фотомаски в направлении z, пока она не ляжет прямо над пластиной с покрытием(рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ножничный подъемник позволяет точно регулировать z-положение фотомаски, так как ножничный подъемник можно использовать для перемещения положения прикрепленной фотомаски в z-направлении.
   7. Сохраняя фотомаску неподвижной, посмотрите через объектив микроскопа и определите цветные маркеры выравнивания первого слоя под маркерами выравнивания фотомаски. Используйте ручки x- и Y-направления ступени микроскопа для перемещения положения MMAA(рисунок 4D). Отрегулируйте положение MMAA до тех пор, пока маркер выравнивания на фотомаске не будет наложен цветным маркером выравнивания на первом слое(рисунок 6A,B),наблюдая за положением маркеров выравнивания через объектив микроскопа.
   8. Осторожно приложите небольшое усилие к фотомаске и используйте ленту, чтобы закрепить фотомаску на месте поверх пластины с покрытием. Отсоедите фотомаску от ножничного подъемника. Убедитесь, что все четыре маркера выравнивания на фотомаске находятся в выравнивании с четырьмя маркерами выравнивания на первом слое.
   9. Как только выравнивание будет достигнуто, тщательно отсоегите держатель пластины от ступени микроскопа. Вставьте стеклянную верхнюю пластину поверх пластины и фотомаски, чтобы уменьшить зазор между двумя частями(рисунок 1). Поместите весь держатель пластины в доступную систему воздействия ультрафиолетового света, как показано на рисунке 4E. Обнажите второй слой на соответствующее время и интенсивность света, как описано в инструкции¹⁶производителя фоторезиста.
   10. Снимите держатель пластины с системы воздействия ультрафиолетового излучения. Снимите пластину с покрытием из держателя пластины и отсоедините фотомаску от пластины. Завершите обработку второго слоя (например, пост-выпечку, разработку, промывку и сушку) в соответствии с инструкциями производителя фоторезиста^16.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Точное спин-покрытие, мягкая выпечка, экспонирование, пост-выпечка и условия развития (время, температура) будут варьироваться в зависимости от используемого фоторезиста и желаемой толщины слоя. Фактические условия и точная процедура фотолитографии должны основываться на инструкциях производителя фоторезиста.
3. Приготовление микрофлюидного аппарата с использованием мастер-формы (мягкая литография)
   1. Извлеките мастер-форму и закрепите ее в середине пластиковой чашки Петри 150 мм x 15 мм с помощью ленты.
   2. Приготовьте ~15-20 г PDMS на основании инструкций производителя. Поместите PDMS в вакуумную камеру или дайте ей отдохнуть до тех пор, пока не будут свободны пузырьки. Налейте PDMS в чашку Петри, содержащую главную форму.
   3. Пусть чашка Петри с мастер-формой покоится на столешнице до тех пор, пока PDMS не освободится от пузырьков. Поместите чашку Петри в духовку при 65 °C до полного отверждения PDMS (не менее 3 ч).
   4. Вырежьте PDMS, чтобы выявить микроканальные структуры. Разрежьте PDMS вокруг микроканальных структур на отдельные микрочипы и создайте впускные и выпускные отверстия для микрофлюидного устройства. Используйте ленту, чтобы аккуратно удалить любые мелкие частицы, которые могут лежать на поверхности PDMS.
   5. Завершите изготовление микрочипа, прикрепив чип PDMS к PDMS или слайду микроскопа путем плазменной обработки чипа PDMS и дополнительной подложки.
4. Определение ошибки выравнивания
   1. Извлеките главную форму и используйте вертикальный микроскоп для определения расстояния зазора (ошибки выравнивания) между первым и вторым слоем. Сделайте это, просто измерив расстояние, на которое второй слой смещается и смещен от первого слоя на микроканальных структурах (см. Рисунок 5D для примера измеренного расстояния зазора).
   2. Используйте вертикальный микроскоп, чтобы определить, содержит ли чип PDMS стенки каналов, которые являются прямыми с четкими краями устройства. Кроме того, проверьте микросхему PDMS на наличие возможных дефектов, которые могут помешать функциональности устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения меньшей погрешности выравнивания может потребоваться повторить изготовление основной формы (разделы 3.2 и 3.3). Показано, что повторная практика использования MMAA повышает способность пользователя создавать хорошо выровненную мастер-форму. Кроме того, изображения могут быть получены с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM)(рисунок 7)для подтверждения ошибки выравнивания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Благодаря оптимизации и использованию MMAA(рисунок 1)были изготовлены многослойные мастер-формы с минимальной погрешностью выравнивания. Окончательная MMAA была изготовлена с использованием процесса 3D-печати с плавленой нитью (FFF)(рисунок 2). Процесс FFF пов?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Вышеупомянутый протокол описывает процедуру 3D-печати MMAA и использования системы для создания точной, многослойной, микрофлюидной формы устройства. Хотя устройство легко использовать, в протоколе есть критические шаги, которые требуют практики и ухода для обеспечения надлежащего выр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylonitrile Butadiene Styrene (ABS), 3D Printing Filament			Provided by the Texas Tech University 3D printing facility
BX53, Upright Microscope	Olympus
Form 2, Stereolithography 3D printer	Formlabs
Advanced Hot Plate Stirrer	VWR	97042-642
Isoproyl Alcohol, 70% (v/v)	VWR	BDH7999-4
Light Colored Marker	Sharpie
Magnets, 3 mm x 3 mm	WOTOY		ASIN #: B075PLVW8W
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	4019862
Petri Dish, 150 mm x 15 mm	VWR	25384-326
Printed Photomasks	CAD/Art Services, Inc.
Aluminum Support Jack - 8" x 8", Scissor Lift	VWR	12620-904
Silicon Wafer	University Wafer	452
Sodium Hydroxide	VWR
Sonication Bath	Branson	CPX3800H
Spin Coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPPB
STRATASYS SR-30	MakerBot Industries, LLC	SR-30	Dissolvable support material for 3D printing
Stratasys uPrint SE 3D Printer	Computer Aided Technology, LLC
SU-8 50	Kayaku	Y131269 0500L1GL
SU-8 100	Kayaku	Y131273 0500L1GL
SU-8 Developer	Kayaku	Y020100 4000L1PE
Super glue	Gorilla Glue
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tape	Scotch
Form Cure, UV Curing Chamber	Formlabs	FH-CU-01
UV-KUB2, UV Light-Exposure Box	Kloe	UV-KUB2