Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Resumen

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Resumen

La generación de cardiomiocitos humanos (CM), fibroblastos cardíacos (CF) y células endoteliales (CE) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha brindado una oportunidad única para estudiar la compleja interacción entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsa el desarrollo de tejidos y la enfermedad. En el área de los modelos de tejido cardíaco, varios enfoques tridimensionales sofisticados (3D) utilizan cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) para imitar la relevancia fisiológica y el entorno del tejido nativo con una combinación de matrices extracelulares y reticulantes. Sin embargo, estos sistemas son complejos de fabricar sin experiencia en microfabricación y requieren varias semanas para autoensamblarse. Lo más importante es que muchos de estos sistemas carecen de células vasculares y fibroblastos cardíacos que constituyen más del 60% de los no miocitos en el corazón humano. Aquí describimos la derivación de los tres tipos de células cardíacas a partir de iPSC para fabricar microtejidos cardíacos. Esta técnica de moldeo de réplica fácil permite el cultivo de microtinue cardíaco en placas de cultivo celular estándar de múltiples pocillos durante varias semanas. La plataforma permite el control definido por el usuario sobre los tamaños de microtejidos en función de la densidad de siembra inicial y requiere menos de 3 días para que el autoensamblaje logre contracciones observables de microtejidos cardíacos. Además, los microtejidos cardíacos se pueden digerir fácilmente mientras se mantiene una alta viabilidad celular para el interrogatorio de una sola célula con el uso de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Prevemos que este modelo in vitro de microtejidos cardíacos ayudará a acelerar los estudios de validación en el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades.

Introducción

El descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades en el campo de la investigación cardiovascular se enfrentan a varios desafíos debido a la falta de muestras clínicamente relevantes y a herramientas traslacionales ^inadecuadas1. Los modelos preclínicos altamente complejos o los modelos unicelulares in vitro demasiado simplificados no presentan condiciones fisiopatológicas de manera reproducible. Por lo tanto, varias plataformas miniaturizadas de ingeniería tisular han evolucionado para ayudar a cerrar la brecha, con el objetivo de lograr un equilibrio entre la facilidad de aplicación de una manera de alto rendimiento y la recapitulación fiel de la función ^tisular2,3. Con el advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las herramientas de ingeniería de tejidos se pueden aplicar a células específicas del paciente con o sin estado de enfermedad cardiovascular subyacente para responder a las preguntas de ^{investigación4,5,6}. Tales modelos de ingeniería tisular con composición celular similar al tejido cardíaco podrían utilizarse en los esfuerzos de desarrollo de fármacos para probar la cardiotoxicidad y la disfunción inducidas por cambios patológicos en el comportamiento de uno o varios tipos de células.

Los microtejidos u organoides autoensamblados derivados de iPSCs humanas son estructuras tridimensionales (3D) que son ensamblajes en miniatura similares a tejidos que exhiben similitudes funcionales con sus contrapartes in vivo . Existen varios enfoques diferentes que permiten la formación de organoides in situ a través de la diferenciación dirigida de iPSCs o a través de la formación de cuerpos ^{embrionarios4}. Los organoides resultantes son una herramienta indispensable para estudiar los procesos morfogenéticos que impulsan la organogénesis. Sin embargo, la presencia de una variedad de poblaciones celulares y las diferencias en la autoorganización pueden conducir a la variabilidad en los resultados entre diferentes ^organoides5. Alternativamente, las células prediferenciadas que se autoensamblan en microtisajes con tipos de células específicas de tejidos para estudiar las interacciones célula-célula locales son excelentes modelos, donde es factible aislar los componentes autoensamblados. Particularmente en la investigación cardíaca humana, el desarrollo de microtejidos cardíacos 3D con componentes multicelulares ha demostrado ser un desafío cuando las células se derivan de diferentes líneas de pacientes o fuentes comerciales.

Para mejorar nuestra comprensión mecanicista de los comportamientos celulares en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, personalizado, idealmente todos los tipos de células componentes deben derivarse de la misma línea de pacientes. En el contexto de un corazón humano, un modelo cardíaco in vitro verdaderamente representativo capturaría la diafonía entre los tipos de células predominantes, a saber, cardiomiocitos (CM), células endoteliales (CE) y fibroblastos cardíacos (CEF)^6,7. La recapitulación fiel de un miocardio no solo requiere estiramiento biofísico y estimulación electrofisiológica, sino también señalización célula-célula que surge del soporte de tipos celulares como las CE y las ^CEF8. Los CF están involucrados en la síntesis de la matriz extracelular y el mantenimiento de la estructura del tejido; y en estado patológico, los CF pueden inducir fibrosis y alterar la conducción eléctrica en los ^CM9. Del mismo modo, las CE pueden regular las propiedades contráctiles de los CM a través de la señalización paracrina y el suministro de demandas metabólicas ^vitales10. Por lo tanto, existe la necesidad de microtejidos cardíacos humanos compuestos por los tres tipos principales de células para permitir que se realicen experimentos de alto rendimiento fisiológicamente relevantes.

Aquí, describimos un enfoque de abajo hacia arriba en la fabricación de microtejidos cardíacos mediante la derivación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (iPSC-CM), células endoteliales derivadas de iPSC (iPSC-EC) y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC (iPSC-CFs) y su cultivo 3D en matrices de microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de generar microtejidos cardíacos que laten espontáneamente se puede utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas rápidas de medicamentos para la comprensión funcional y mecanicista de la fisiología del corazón. Además, tales plataformas de microtejidos cardíacos multicelulares podrían explotarse con técnicas de edición del genoma para emular la progresión de la enfermedad cardíaca a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo crónicas o agudas.

Protocolo

1. Medio, reactivo, preparación de placas de cultivo

1. Solución de lavado celular para cultivo celular: Use solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio ni magnesio.
2. Medios de diferenciación cardiomiocitaria
   1. Prepare el medio de diferenciación # 1 agregando un suplemento de 10 ml (50x B27 más insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640).
   2. Prepare el medio de diferenciación # 2 agregando un suplemento de 10 ml (50x B27 menos insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640).
   3. Prepare el medio de purificación # 3 agregando suplemento (50x B27 más insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640) menos glucosa.
3. Medios de crecimiento endotelial y reactivos de clasificación celular activados magnéticamente (MACS)
   1. Prepare el medio de crecimiento endotelial (EGM) con el kit de suplemento de medio de crecimiento de células endoteliales disponible comercialmente.
   2. Prepare la solución tampón de clasificación por separación celular diluyendo la solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) a 1:20 con solución de enjuague.
4. Medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos: Prepare el medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos con medio basal de fibroblastos (DMEM-glucosa alta) y el kit de factores de vida de fibroblastos sin suero.
5. Medio de fabricación y mantenimiento de microtintas cardíacas: Preparar medio filtrado con medio basal cardiomiocítico (RPMI 1640) con suplemento (50x B27 más insulina) y EGM en proporción 70/30 v/v%.
6. Soluciones de stock de moléculas pequeñas y factores de crecimiento
   1. Para la diferenciación de los tres tipos de células, preparar 200 μL de alícuotas de inhibidor de GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinacarbonitrilo); Inhibidor de Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinil-benzamida; e inhibidor del factor de crecimiento transformador beta (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) a una concentración de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).
   2. Para la diferenciación iPSC-EC humana, preparar alícuotas de 100 μL de factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) (20 μg/mL), factor de crecimiento endotelial vascular _{165 (VEGF165}; 50 μg/mL) y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4; 20 μg/mL) en BSA al 0,1% (p/v) en agua destilada ultrapura. Conservar las alícuotas a -20 °C; para el almacenamiento a largo plazo, las alícuotas se pueden almacenar a -80 °C durante un máximo de 1 año.
7. Placas de pre-recubrimiento para el mantenimiento de iPSC-CMs, iPSC-ECs e iPSC-CFs.
   1. Prepare placas de 6 pocillos recubiertas de medio de matriz de membrana basal para el rechapado de iPSC-CM diluyendo el medio de matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido (GFR) en DMEM / F12 en una proporción de 1: 200. Agregue 2 ml de medio de matriz de membrana basal diluida a cada pocillo de la placa de 6 pocillos y déjelo reposar durante al menos 2 a 4 h.
   2. Cubra previamente el plato de 6 pocillos o el plato de 10 cm con gelatina. Licuar la solución de gelatina al 2% en un baño de agua a 37 °C y preparar gelatina filtrada al 0,2% (v/v) en PBS en un volumen apropiado según sea necesario. Cubra la placa de cultivo con 10 ml de gelatina al 0,2% durante al menos 30 min a 37 °C antes de su uso.
      NOTA: Las placas de gelatina se pueden utilizar tanto para iPSC-CFs como para iPSC-ECs después de MACS.
8. Fabricación de moldes microtisulares: Preparar solución de agarosa de baja fusión al 2% en PBS en una botella de vidrio seca de 100 ml. Esterilizar la agarosa a 121 °C, 15 psi durante 20 min antes de su uso. Autoclave los micromoldes de silicona de fundición a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
9. Soluciones para digestión, inmunotinción y citometría de flujo
   1. Para la digestión microtejicosa, prepare un tampón de digestión enzimática de Dispasa I (1 U/mL) y Liberase (3 U/mL) en PBS. Mantenga esta solución en hielo.
   2. Para la fijación celular y microtisular, utilice un reactivo de fijación disponible comercialmente en frío que contenga 4,2% de paraformaldehído (PFA).
   3. Preparar 0.25% Triton X-100 en PBS para permeabilización y 0.1% Tween-20 para lavados. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente.
   4. Para los análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), prepare el tampón FACS [PBS o HBSS con suero bovino fetal (FBS)] al 2%] y guárdelo a 4 °C.
   5. Para la inmunotinción, prepare un 2% de suero normal de cabra / burro / conejo en PBS. Elija la especie de suero en función del huésped en el que se criaron los anticuerpos.

2. Diferenciación y purificación cardíaca

NOTA: Todas las iPSC deben mantenerse en ~ 75% a 80% de confluencia antes de la diferenciación de cardiomiocitos. Las iPSC utilizadas para este protocolo se derivaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando la reprogramación del virus de Sendai realizada en el Biobanco del Instituto Cardiovascular de Stanford (SCVI).

1. Antes de la diferenciación, el cultivo de iPSC colonias hasta el paso (P20).
2. Retire el medio de cultivo iPSC de la placa de 6 pocillos y lave las células una vez con 2 ml de PBS.
3. El día 0, comience la inducción del mesendodermo agregando 2 ml de diferenciación Medio # 1 con CHIR (6 μM final) en cada pozo. La concentración final puede variar entre 6 y 9 μM para diferentes líneas iPSC. Por lo tanto, se recomienda probar diferentes concentraciones de CHIR en una placa de 6 pocillos para identificar la inducción óptima del mesodermo cardíaco.
4. El día 2, recupere las células reemplazando con 2 ml de medium # 1 fresco en cada pozo.
5. En el día 3, reemplace el medio en cada pozo con el medio de diferenciación de 2 ml # 1 con el inhibidor de Wnt IWR-1-endo (5 μM) para inducir la especificación de linaje cardíaco.
6. El día 5, recupere las células reemplazando el medio con el medio fresco de 2 ml # 1 en cada pozo.
7. En el día 7, reemplace el medio con 2 ml de medio # 2 en cada pozo. El latido espontáneo de los cardiomiocitos se puede observar ya en el día 8-9. Para algunas líneas, las células que golpean pueden aparecer tan tarde como el día 11.
8. Para la purificación del cultivo de diferenciación, reemplace con 2 ml menos glucosa Media # 3 en cada pozo el día 10.
9. El día 13, recupere las células cambiando el medio con 2 ml más glucosa media # 2 en cada pozo.
10. El día 16, realizar segunda ronda de purificación con 2 mL de Medio #3 en cada pozo.
11. Recupere las células en el día 19 con 2 ml más glucosa Media # 2.
12. El día 20, lave los pocillos una vez con 1 ml de PBS y disocie las células con 1 ml de tripsina 10x durante 6 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las células se levantan de la superficie del pozo en células individuales durante menos de 15 s y se agregan a un tubo cónico de 15 ml con el mismo volumen de Medio # 2 para neutralizar la enzima. Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 270 x g.
13. Resuspend el pellet celular en 3 mL Medium #3. Cuente las células y agregue el volumen apropiado del Medio # 3 para platear un total de ~ 3 millones de células en cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos recubierta de medio de matriz de membrana basal. En el segundo día después de volver a emplatar, reemplace el medio con 2 mL Medium # 2 fresco y reponga con 2 mL Medium # 2 cada dos días hasta la tripsinización de cardiomiocitos para congelación o experimentos futuros.

3. Diferenciación de células endoteliales y MACS

1. Con una confluencia de iPSC del 75% al 80%, lave la placa con PBS, 2 ml por pocillo.
2. Comience la diferenciación en el día 0 reemplazando con 2 mL de diferenciación el Medio #1 con 6 μM CHIR.
3. En el día 2, reemplace el medio con 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 2 μM CHIR.
4. El día 4, reemplace el medio con 2 ml de EGM suplementado con 20 ng bFGF-2, 50 ng _VEGF165 y 20 ng BMP4.
5. Cambie el medio con 2 ml de EGM suplementado con factores de crecimiento cada 2 días desde el día 6 hasta el día 10. La adición de inhibidor de TGFβ (SB431542) a una concentración de 8 μM es opcional para promover la expansión endotelial y suprimir la diferenciación de otros tipos de células de origen mesenquimal.
6. El día 12, comience los pasos para MACS enjuagando cada pozo con 1 ml de PBS seguido de disociación celular con 1 ml de 10x tripsina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos durante 8 minutos a 37 ° C.
7. Preparar un volumen igual de medio EGM en un tubo cónico de 50 ml para neutralizar la enzima de disociación. Coloque un colador de células de 40 μm en el tubo cónico de 50 ml y pase la suspensión de células disociadas a través del colador. Cambie el filtro por cada 2 a 3 pozos disociados.
8. Enumere el total de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
9. Pellet la suspensión celular a 300 x g durante 5 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en el volumen apropiado de tampón de clasificación basado en el recuento total en el paso 3.8.
    NOTA: Agregue 80 μL de tampón de clasificación por cada ¹⁰⁷ celdas totales.
11. Para el etiquetado magnético de perlas, agregue 20 μL de reactivo de bloqueo de FcR por cada ¹⁰⁷ células e incube durante 5 min.
12. Añadir 20 μL de microperlas CD144 o CD31 por cada ¹⁰⁷ células y mezclar bien. Incubar la suspensión celular en la oscuridad a 4 °C durante 15 min.
13. Añadir 20 ml de tampón de clasificación para lavar las celdas marcadas y granular las células 300 x g durante 5 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
14. Vuelva a suspender el pellet celular en 3 ml de tampón de clasificación y déjelo en hielo.
15. Prepare una columna de separación magnética colocando la columna en la muesca del separador.
16. Equilibre la columna enjuagando con 3 ml de tampón de clasificación y recoja el flujo en un tubo cónico de desechos.
17. Una vez que el tampón de enjuague fluya a través de él, vuelva a suspender la suspensión celular a fondo para romper cualquier grupo y aplique la suspensión celular sobre la columna.
18. Después de que la suspensión celular haya fluido, lave la columna con 3 ml de tampón de clasificación tres veces para eliminar las celdas sin etiquetar.
19. Retire la columna del separador y colóquela en un tubo cónico de 15 ml para la elución ^de celdas CD144⁺/CD31+.
20. Agregue 5 ml de búfer de clasificación a la columna e inmediatamente enjuague las celdas marcadas magnéticamente con el émbolo.
21. Determine el número de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
22. Centrifugar la suspensión celular en una centrífuga preenfriada a 300 x g durante 3 min.
23. Resuspend el pellet celular en volumen apropiado de EGM con 5-8 μM de inhibidor de TGFβ (SB431542) basado en el recuento total en el paso 3.21.
24. Placa este pasaje 0 (P0) células a una densidad celular apropiada (4 x ¹⁰⁴ células/^cm2) en una placa de gelatina pre-recubierta al 0,2%.
25. Para P0 y P1, continúe reponiendo el medio con EGM fresco cada 2 días con inhibidor de TGFβ. A partir de P2, las células se pueden cultivar en medio de crecimiento endotelial sin inhibidor de TGFβ.

4. Diferenciación de fibroblastos cardíacos

1. Permitir que las iPSC se vuelvan 90% a 95% confluentes; lavar cada pozo con 1 ml de PBS.
2. Comience la diferenciación en el día 0 agregando 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 11 μM CHIR. Para líneas iPSC sensibles, la concentración puede variar entre 9-10 μM.
3. El día 1, observa el plato. Es normal observar una muerte celular significativa con ~ 30% a 40% de células adheridas a la placa.
4. En el día 3, agregue 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 5 μM IWR-1-endo para promover la expansión de los progenitores cardíacos.
5. El día 4, reemplace el medio con 2 ml de medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos. Reemplace con medio fresco cada 2 días hasta el día 16.
6. El día 18, separe las células usando 1 ml de 10x tripsina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos durante 10 minutos a 37 ° C.
7. Interrumpa la capa celular a fondo y pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml que contiene el mismo volumen de medio DMEM / F12 complementado con 5% FBS.
8. Determine el número de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
9. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min para obtener un pellet.
10. Para el primer re-recubrimiento, resuspender el pellet celular en un volumen apropiado de medio de diferenciación y placa a una densidad celular (6 x ¹⁰⁴ celdas/^cm2) en una placa recubierta de gelatina al 0,2% hasta una confluencia del 90%.
11. Divida la placa y mantenga los fibroblastos cardíacos en DMEM / F12 regular con suero al 10% en placas recubiertas de gelatina.

5. Fundición de moldes microtisulares cardíacos y siembra celular

1. Derretir la agarosa en un microondas en una botella de vidrio de 100 ml hasta que hierva. Rocíe la botella de agarosa y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Deje que la agarosa se enfríe durante ~ 3 min.
2. Pipeta 700 μL de agarosa fundida en un micromolde de silicona de 9 x 9 matriz. Evite generar burbujas durante el pipeteo.
3. Coloque cuidadosamente el molde en un bloque de hielo preenfriado para acelerar la gelificación de la agarosa.
4. Asegúrese de que una vez que la agarosa se gelifica, se vuelve translúcida. Doble cuidadosamente alrededor de los bordes del micromolde para aflojar la réplica de agarosa. Luego, pele suavemente la réplica por todos lados para separar la réplica de agarosa del micromolde de silicona.
5. Transfiera la bandeja de microtejido de agarosa que contiene 81 huecos circulares (800 μm de diámetro; 800 μm de profundidad) a una placa estéril de 12 pocillos.
6. Agregue 2 ml de PBS a la bandeja de microtejido de agarosa e inspeccione bajo el microscopio si hay burbujas atrapadas o pozos de forma irregular.
7. Sumergir la bandeja de agarosa en 2 ml de etanol al 70% durante la noche, seguido de un tratamiento UV en el gabinete de bioseguridad durante 1 h.
8. Antes de su uso, retire el etanol al 70% y lave dos veces con agua destilada y un lavado final con 2 ml de PBS.
9. Tripsinizar, neutralizar y contar iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CFs y colocar las suspensiones celulares en hielo.
10. Retire el PBS del pozo y de la cámara de siembra celular con cuidado sin tocar los huecos.
11. En un nuevo tubo, mezcle iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CFs en una proporción de 7:2:1, respectivamente, para lograr una densidad celular final de ¹⁰⁶ células/ml. Las densidades celulares más altas darán como resultado microtisones más grandes.
    NOTA: No exceda de 2 x ¹⁰⁶ celdas/ml.
12. Agregue cuidadosamente los 200 μL de la suspensión celular en forma de gota en la cámara de siembra.
13. Deje que las células se asienten a 37 °C en una incubadora de _CO2 durante 2 h.
14. Agregue un medio de fabricación de microtinua que rodea el molde de agarosa para cubrir la superficie de la cámara interior.
15. Después de 24 h, las células se autoensamblan y compactan significativamente en los huecos circulares. Reemplace con medio fresco cada 2 días para mantenimiento.

6. Fijación y permeabilización de células y microtisones cardíacos para inmunotinción

1. Para cada tipo de célula individual, cultive las células por separado en un medio de matriz de membrana basal o en portaobjetos de cámara recubiertos de gelatina (aproximadamente 2.5-3 x ¹⁰⁵ células / ml). Los microtejidos cardíacos se pueden recolectar en un tubo cónico de 15 ml enjuagándolos suavemente de los huecos circulares.
2. Aspire el medio y enjuague las células o microtejidos con 1 ml de PBS; a partir de entonces, fijar con el tampón de fijación que contiene 4,2% de PFA durante 20 min para los portaobjetos de la cámara y 1 h para microtemas a temperatura ambiente.
3. Aspire el PFA y agregue 1 ml de solución permeabilizante (0.25% Triton X-100 en PBS) durante 5 a 7 min para portaobjetos de cámara y 20 min para microtisones en tubo cónico de 15 mL.
   NOTA: A partir de este paso, las muestras se pueden mecer suavemente en una plataforma basculante de sobremesa.
4. Aspire la solución permeabilizante y enjuague una vez con 2 a 3 ml de PBS.
5. Incubar las células con 500-1.000 μL de solución bloqueadora (2% a 5% de suero normal de cabra o suero de burro) durante al menos 1 h para los portaobjetos de cámara y de 3 a 4 h para los microtejidos.
6. Incubar las células o microtejidos cardíacos con anticuerpos conjugados preparados en la solución bloqueante suficiente para cubrir la muestra. Incubar con troponina-T anticardíaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) y anti-DDR2/vimentina (1:50) durante 1 h para los portaobjetos de cámara y durante la noche a 4 °C para microtisones cardíacos.
7. Lave los portaobjetos de la cámara tres veces con 500 μL 0.1% Tween-20 durante 5 min entre cada lavado y un lavado final con PBS.
8. Para los microtejidos cardíacos, lavar con 2 mL 0.1% Tween-20 cinco veces con 20 min de duración entre cada lavado. Realice un paso de lavado final durante 20 minutos adicionales.
9. Incubar las células o microtejidos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) antes de la microscopía confocal.
10. Para microtejidos cardíacos, transfiera cuidadosamente a un plato con fondo de vidrio de 35 mm y agregue PBS para sumergir los microtejidos.
11. Para imágenes 3D, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 20x o 40x gana el foco central de la microtejiga y ajusta los parámetros de exposición para cada fluoróforo.
12. Para obtener una pila Z, establezca la primera y la última coordenadas en modo Live con una profundidad total de imagen de 100-200 μm con un intervalo de corte de 5-10 μm.

7. Digestión de microtejidos cardíacos y preparación de células para citometría de flujo

1. Para digerir los microtejidos, enjuague suavemente los microtesúmeros con Medium # 1 de los huecos circulares usando una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho en un tubo cónico de 15 ml.
2. Deje que los microtejidos se asienten y aspiren el medio con cuidado y enjuague las células o microtejidos con 1 ml de PBS y agregue 200-300 μL de tampón de digestión enzimática durante 20 min a 37 ° C. A los 10 min, mezclar los microtejidos suavemente durante 1 min e incubar de nuevo a 37 °C durante el resto del tiempo.
3. Después de la incubación, use una punta de pipeta regular de 1 ml para mezclar los microtejidos vigorosamente para obtener una suspensión de células turbias.
4. Una vez que los microtejidos estén suficientemente digeridos en células individuales, neutralice inmediatamente la suspensión celular con 5 ml de medio que contenga un 5% de FBS y cuele la suspensión celular a través de un colador celular de 40 μm. Cuente el número total de células y centrífique la suspensión de una sola célula a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspire el sobrenadante y resuspenda 1 x ^105-1 x ¹⁰⁶ células en tampón de unión a anexinas de 100 μL con FITC Annexin V y 100 μg/mL de yoduro de propidio (PI) o tinte de exclusión de células muertas To-Pro3 durante 10 min en hielo.
6. Después de la incubación, agregue 300 μL del tampón de unión a la anexina a la suspensión celular y transfiéralo a un tubo FACS de fondo redondo para el análisis de citometría de flujo. Utilice los láseres y filtros de emisión correctos para los fluoróforos seleccionados.
7. Para la cuantificación de marcadores de superficie celular utilizando células fijas, realice la fijación y permeabilización del pellet celular como se describe en los pasos 6.2 y 6.3.
8. Después de la permeabilización, enjuague el pellet celular e incube las células con los respectivos anticuerpos conjugados durante 1 h. Lave el pellet celular en tampón FACS de 4 ml (2% FBS en PBS) y centrífuga a 300 x g durante 3 min. Repita el paso de lavado dos veces.
9. Resuspend las células en tampón FACS de 200-300 μL para el análisis de citometría de flujo.
10. Ajuste las propiedades de dispersión hacia adelante y hacia el lado con una muestra no teñida y considere el uso de un control de isotipo para cada fluoróforo para ajustar los voltajes del láser. Recopile un mínimo de 20.000 eventos para el análisis de datos.

8. Realización de análisis de contracción de microtisones cardíacos que laten espontáneamente

1. Grabe videos de microtisones cardíacos para capturar al menos tres latidos. Establezca la resolución de grabación en al menos 1280 x 720 píxeles a una velocidad de fotogramas >30 fotogramas por segundo y guarde el vídeo en . Formato AVI.
2. Ejecute el script ^MotionGUI11 en un entorno de MATLAB para iniciar la interfaz de usuario.
3. Busque el archivo . Ubicación del archivo AVI en su carpeta para cargar el video. Luego, ingrese la velocidad de fotogramas a la que se capturó el video en el panel Entrada.
4. En el panel de entrada avanzada, se puede especificar un tamaño de píxel basado en la resolución y la ampliación de captura.
5. Se puede especificar un tamaño de píxel de macrobloque adecuado (predeterminado 16) y un movimiento de píxel detectable dependiendo de la fuerza de contracción del microtejido.
6. Después de ajustar los parámetros, haga clic en Obtener vectores de movimiento para comenzar el análisis.
7. Seleccione una región de interés con el botón de opción Elegir AOI para excluir las áreas que rodean la microtinua única en el hueco circular.
8. Utilice la función Map Time Ave para generar un mapa de calor de contracción media basado en el movimiento detectado en los ejes X e Y.
9. Para obtener datos de seguimiento de picos, utilice la función Obtener datos de contracción para medir automáticamente los picos de contracción y relajación.
10. En el caso de una baja relación señal-ruido, aplique un umbral de altura y distancia máxima para anotar correctamente la velocidad máxima de contracción (punto azul) y la velocidad máxima de relajación (triángulo rojo).
11. Después de establecer los umbrales correctos, seleccione Analizar picos para obtener los valores de contracción y relajación con la velocidad de latido y el intervalo de latido.
12. Obtener mediciones de un mínimo de 25 microtejidos individuales para análisis estadísticos.

Resultados

Caracterización de inmunotinción y citometría de flujo de CM, CE y CG derivados de iPSC
Para generar microtejidos cardíacos compuestos de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CEF, los tres tipos de células se diferencian y caracterizan individualmente. La diferenciación in vitro de iPSCs a iPSC-CMs ha mejorado en los últimos años. Sin embargo, el rendimiento y la pureza de los iPSC-CM difieren de una línea a otra. El protocolo actual produce más del 75% de iPSC-CM puros que espontáneamente comi...

Discusión

Para generar microtejidos cardíacos a partir de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CC prediferenciados, es esencial obtener un cultivo altamente puro para un mejor control del número de células después de la compactación celular inhibida por contacto dentro de los microtejidos cardíacos. Recientemente, Giacomelli et. ^al.18 han demostrado la fabricación de microtejidos cardíacos utilizando iPSC-CMs, iPSC-ECs y iPSC-CFs. Los microtejidos cardíacos generados utilizando el método descrito consisten en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Fisher Scientific	08-772-29
3D micro-molds	Microtissues	12-81 format
6-well plates	Fisher Scientific	08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution	Thermo Fisher Scientific	NC9104697
B27 Supplement minus Insulin	Life Technologies	A1895601
B27 Supplement plus Insulin	Life Technologies	17504-044
BD Cytofix	BD Biosciences	554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix	BD Biosciences	354277
Cardiac Troponin T Antibody	Miltenyi	130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads	Miltenyi	130-097-857
CD31 Antibody	Miltenyi	130-110-670
CD31 Microbeads	Miltenyi	130-091-935
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DDR2	Santa Cruz Biotechnology	sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI	Thermo Fisher Scientific	V13242
Dispase I	Millipore Sigma	4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium		11960044
DMEM/F-12 basal medium	Gibco	11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-136
EGM2 BulletKit	Lonza	CC-3124
Fetal bovine serum	Life Technologies	10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit	LifeLIne Cell Technology	LS-1010
Glucose free RPMI medium	Life Technologies	11879-020
Goat serum	Life Technologies	16210-064
Human FGF-basic	Thermo Fisher Scientific	13256029
Human VEGF-165	PeproTech	100-20
IWR-1-endo	Selleckchem	S7086
Liberase TL	Millipore Sigma	5401020001
LS Sorting Columns	Miltenyi	130-042-401
MACS BSA Stock solution	Miltenyi	130-091-376
MACS Rinsing Buffer	Miltenyi	130-091-222
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302
RPMI medium	Life Technologies	11835055
SB431542	Selleckchem	S1067
TO-PRO 3	Thermo Fisher Scientific	R37170
Triton X-100	Millipore Sigma	X100-100ML
TrypLE Select 10X	Thermo Fisher Scientific	red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody	R&D Systems	IC2105G