Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Resumo

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Resumo

A geração de cardiomiócitos humanos (CMs), fibroblastos cardíacos (CFs) e células endoteliais (CE) de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) proporcionou uma oportunidade única para estudar a interação complexa entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsionam o desenvolvimento de tecidos e doenças. Na área de modelos de tecido cardíaco, várias abordagens tridimensionais sofisticadas (3D) usam cardiomiócitos pluripotentes induzidos derivados de células-tronco (iPSC-CMs) para imitar relevância fisiológica e ambiente de tecido nativo com uma combinação de matrizes extracelulares e crosslinkers. No entanto, esses sistemas são complexos para fabricar sem experiência em microfabização e requerem várias semanas para se auto-montar. Mais importante, muitos desses sistemas não possuem células vasculares e fibroblastos cardíacos que compõem mais de 60% dos não-miócitos no coração humano. Aqui descrevemos a derivação de todos os três tipos de células cardíacas de iPSCs para fabricar microtissues cardíacas. Esta técnica de moldagem de réplica fácil permite a cultura de microtissue cardíaco em placas de cultura celular multi-bem padrão por várias semanas. A plataforma permite o controle definido pelo usuário sobre tamanhos de microtissue com base na densidade inicial de semeadura e requer menos de 3 dias para que a automontagem atinja contrações microtissuas cardíacas observáveis. Além disso, as microtissues cardíacas podem ser facilmente digeridas, mantendo alta viabilidade celular para interrogatório unicelular com o uso de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Imaginamos que este modelo in vitro de microtissues cardíacas ajudará a acelerar os estudos de validação na descoberta de medicamentos e modelagem de doenças.

Introdução

A descoberta de medicamentos e a modelagem de doenças no campo da pesquisa cardiovascular enfrentam diversos desafios devido à falta de amostras clinicamente relevantes e ferramentas translacionais ^inadequadas1. Modelos pré-clínicos altamente complexos ou supersimplificados em modelos de célula única in vitro não apresentam condições fisiocessiológicas de forma reprodutível. Portanto, várias plataformas miniaturizadas projetadas em tecido evoluíram para ajudar a preencher a lacuna, com o objetivo de alcançar um equilíbrio entre a facilidade de aplicação de forma de alta produtividade e a recapitulação fiel da função ^tecidual2,3. Com o advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), as ferramentas de engenharia de tecidos podem ser aplicadas a células específicas do paciente com ou sem estado de doenças cardiovasculares subjacentes para responder a perguntas de ^{pesquisa4,5,6}. Tais modelos de tecido projetado com composição celular semelhante ao tecido cardíaco poderiam ser utilizados em esforços de desenvolvimento de medicamentos para testar para cardiotoxicidade e disfunção induzida por alterações patológicas no comportamento de um ou vários tipos de células.

Microtissues auto-montados ou organoides derivados de iPSCs humanos são estruturas tridimensionais (3D) que são conjuntos em miniatura semelhantes a tecidos que exibem semelhanças funcionais com suas contrapartes in vivo. Existem várias abordagens diferentes que permitem a formação de organoides in situ via diferenciação direcionada de iPSCs ou através da formação de corpos embrióides4. Os organoides resultantes são uma ferramenta indispensável para estudar processos morfogenéticos que impulsionam a organogênese. No entanto, a presença de uma variedade de populações celulares e diferenças na auto-organização podem levar à variabilidade nos desfechos entre diferentes ^organoides5. Alternativamente, células pré-diferenciadas que são auto-montadas em microtissues com tipos de células específicas do tecido para estudar interações células locais são excelentes modelos, onde é viável isolar os componentes auto-montados. Particularmente em pesquisas cardíacas humanas, o desenvolvimento de microtissues cardíacas 3D com componentes multicelulares provou ser desafiador quando as células são derivadas de diferentes linhas de pacientes ou fontes comerciais.

Para melhorar nossa compreensão mecanicista dos comportamentos celulares em um modelo fisiologicamente relevante, personalizado e in vitro, idealmente todos os tipos de células componentes devem ser derivados da mesma linha de pacientes. No contexto de um coração humano, um modelo in vitro cardíaco verdadeiramente representativo capturaria o crosstalk entre tipos de células predominantes, ou seja, cardiomócitos (CMs), células endoteliais (CE) e fibroblastos cardíacos (CFs)^6,7. A recapitulação fiel de um miocárdio não requer apenas alongamento biofísico e estimulação eletrofisiológica, mas também sinalização celular-célula que surge de tipos celulares de suporte como ECs e CFs8. Os CFs estão envolvidos na síntese da matriz extracelular e na manutenção da estrutura tecidual; e em estado patológico, os CFs podem induzir a fibrose e alterar a condução elétrica nos ^CMs9. Da mesma forma, as CE podem regular propriedades contratuais de CMs através de sinalização paracrina e fornecimento de demandas metabólicas ^vitais10. Portanto, há a necessidade de microtissues cardíacas humanas compostas por todos os três principais tipos de células para permitir que experimentos fisiologicamente relevantes de alta produtividade sejam realizados.

Aqui, descrevemos uma abordagem inferior na fabricação de microtissues cardíacas por derivação de cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs), células endoteliais derivadas do iPSC (iPSC-ECs) e fibroblastos cardíacos derivados do iPSC (iPSC-CFs) e sua cultura 3D em microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de gerar microtissues cardíacas espontaneamente pode ser utilizado para modelagem de doenças e testes rápidos de drogas para compreensão funcional e mecanicista da fisiologia cardíaca. Além disso, tais plataformas multicelulares de microtissue cardíacas poderiam ser exploradas com técnicas de edição de genomas para emular a progressão de doenças cardíacas ao longo do tempo sob condições crônicas ou agudas de cultura.

Protocolo

1. Meio, reagente, preparação de placas de cultura

1. Solução de lavagem celular para cultura celular: Use 1x salina tamponada de fosfato (PBS) ou solução de sal balanceada Hanks (HBSS) sem cálcio ou magnésio.
2. Mídia de diferenciação de cardiomiocócito
   1. Prepare a diferenciação Média #1 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 mais insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
   2. Prepare a diferenciação Média #2 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 menos insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
   3. Prepare a purificação Média #3 adicionando suplemento (50x B27 mais insulina) a 500 mL cardiomiocócito meio basal (RPMI 1640) menos glicose.
3. Os reagentes de classificação celular ativados por endoteliais e a triagem celular ativada por magnético (MACS)
   1. Prepare o meio de crescimento endotelial (EGM) com kit de suplemento de crescimento celular endotelial disponível comercialmente.
   2. Prepare a solução de tampão de separação celular diluindo a solução de estoque de gândia bovina (BSA) para 1:20 com solução de lavagem.
4. Meio de diferenciação de fibroblasto cardíaco: Prepare o meio de diferenciação do fibroblasto cardíaco com meio basal fibroblasto (glicose dMEM-alta) e kit fatores de vida fibroblasto sem soro.
5. Meio de fabricação e manutenção de microtissue cardíaca: Prepare o meio filtrado com meio basal cardiomiócito (RPMI 1640) com suplemento (50x B27 mais insulina) e EGM na proporção 70/30 v/v%.
6. Pequenas moléculas e soluções de estoque de fatores de crescimento
   1. Para diferenciação dos três tipos de células, preparar 200 alíquotas μL do inibidor GSK3-beta CHIR 99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrila); Inibidor Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamida; e transformador fator de crescimento beta (TGF-β) inibidor SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) a 10 mM de concentração em sulfóxido de dimetila (DMSO).
   2. Para diferenciação iPSC-CE humana, prepare 100 μL aliquots de fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) (20 μg/mL), fator de crescimento endotelial vascular 165 (_VEGF165; 50 μg/mL), e proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 20 μg/mL) em 0,1% (w/v) BSA em água ultrapurada. Armazene as alíquotas a -20 °C; para armazenamento a longo prazo, as alíquotas podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 ano.
7. Placas de pré-revestimento para manutenção de iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs.
   1. Prepare a matriz de membrana do porão com placas de 6 poços revestidas de 6 poços para replacamento iPSC-CM diluindo o meio da matriz da membrana do porão (GFR) em DMEM/F12 em uma proporção de 1:200. Adicione 2 mL de matriz de membrana diluída ao meio de cada poço da placa de 6 poços e deixe-a definida por pelo menos 2 a 4 horas.
   2. Pré-reveste placa de 6-bem ou 10 cm prato com gelatina. Liquefate 2% solução de gelatina em um banho de água a 37 °C e prepare gelatina filtrada de 0,2% (v/v) em PBS em um volume apropriado, conforme necessário. Cubra a placa de cultura com 10 mL de gelatina de 0,2% por pelo menos 30 min a 37 °C antes de usar.
      NOTA: As placas de gelatina podem ser usadas tanto para iPSC-CFs quanto para iPSC-CEs após MACS.
8. Fabricação de moldes microtissue: Prepare a solução de agarose de fusão 2% baixa em PBS em uma garrafa de vidro seca de 100 mL. Esterilize a agarose a 121 °C, 15 psi por 20 minutos antes de ser usada. Autoclave os micro-moldes de silicone de fundição a 121 °C, 15 psi por 15 min.
9. Soluções para digestão, imunostaining e citometria de fluxo
   1. Para digestão de microtissue, prepare um tampão de digestão enzimática de Dispase I (1 U/mL) e Liberase (3 U/mL) em PBS. Mantenha esta solução no gelo.
   2. Para fixação celular e microtissue, use reagente de fixação comercialmente disponível no gelo contendo 4,2% de paraformaldeído (PFA).
   3. Prepare 0,25% Triton X-100 em PBS para permeabilização e 0,1% Tween-20 para lavagens. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente.
   4. Para análises de triagem celular ativada por fluorescência (FACS), prepare o tampão FACS [PBS ou HBSS com 2% de soro bovino fetal (FBS)] e armazene a 4 °C.
   5. Para imunostaining, prepare 2% de soro normal de cabra/burro/coelho na PBS. Escolha as espécies de soro com base no hospedeiro em que os anticorpos foram criados.

2. Diferenciação cardíaca e purificação

NOTA: Todos os iPSCs devem ser mantidos em ~75% a 80% de confluência antes da diferenciação do cardiomiócito. Os iPSCs utilizados para este protocolo foram derivados de células mononucleares periféricas (PBMCs) utilizando reprogramação do vírus Sendai realizada no Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

1. Antes da diferenciação, colônias de cultura iPSC até a passagem (P20).
2. Remova o meio de cultura iPSC da placa de 6 poços e lave as células uma vez com PBS de 2 mL.
3. No dia 0, inicie a indução de mesendoderm adicionando 2 mL de diferenciação Média #1 com CHIR (final de 6 μM) em cada poço. A concentração final pode variar entre 6 a 9 μM para diferentes linhas iPSC. Assim, recomenda-se testar diferentes concentrações de CHIR em uma placa de 6 poços para identificar a indução ideal de mesoderm cardíaco.
4. No dia 2, recupere as células substituindo por um novo 2 mL Médio #1 em cada poço.
5. No dia 3, substitua o meio em cada poço com 2 mL de diferenciação Média #1 com inibidor Wnt IWR-1-endo (5 μM) para induzir especificação de linhagem cardíaca.
6. No dia 5, recupere as células substituindo o meio por um meio fresco de 2 mL médio #1 em cada poço.
7. No dia 7, substitua o meio por 2 mL Médio #2 em cada poço. O espancamento espontâneo de cardiomiócitos pode ser observado já no dia 8-9. Para algumas linhas, as células de espancamento podem aparecer até o dia 11.
8. Para purificação da cultura de diferenciação, substitua por 2 mL menos glicose Média #3 em cada poço no dia 10.
9. No dia 13, recupere as células alterando o meio com 2 mL mais glicose Média #2 em cada poço.
10. No dia 16, realize a segunda rodada de purificação com 2 mL de Medium #3 em cada poço.
11. Recupere as células no dia 19 com 2 mL mais glicose Média #2.
12. No dia 20, lave os poços uma vez com 1 mL PBS e dissocia as células usando 1 mL 10x Trypsin por 6 min a 37 °C. Após a incubação, as células são retiradas da superfície do poço em células únicas por menos de 15 s e adicionadas a tubo cônico de 15 mL com igual volume de Medium #2 para neutralizar a enzima. Centrifugar a suspensão celular por 3 min a 270 x g.
13. Resuspense a pelota de célula em 3 mL Médio #3. Conte as células e adicione o volume apropriado de Medium #3 para emplacar um total de ~3 milhões de células em cada poço de uma nova matriz de membrana de porão com placa de 6 poços. No segundo dia após o replato, substitua o meio por um médio fresco de 2 mL médio #2 e reabasteça com 2 mL Médio #2 a cada dois dias até a experimentação de cardiomiócitos para congelamento ou experiências futuras.

3. Diferenciação celular endotelial e MACS

1. A 75% a 80% de confluência iPSC, lave a placa com PBS, 2 mL por poço.
2. Comece a diferenciação no dia 0 substituindo por 2 mL de diferenciação Médio #1 com 6 μM CHIR.
3. No dia 2, substitua o meio por 2 mL de diferenciação Média #1 por 2 μM CHIR.
4. No dia 4, substitua o médio por 2 mL de EGM complementado por 20 ng bFGF-2, 50 ng _VEGF165 e 20 ng BMP4.
5. Mude o médio com 2 mL de EGM complementado com fatores de crescimento a cada 2 dias do dia 6 ao dia 10. A adição do inibidor TGFβ (SB431542) na concentração de 8 μM é opcional para promover a expansão endotelial e suprimir a diferenciação de outros tipos de células de origem mesenquimal.
6. No dia 12, inicie etapas para MACS enxaguando cada poço com 1 mL de PBS seguido de dissociação celular usando 1 mL de 10x Trypsin em cada poço de uma placa de 6 poços por 8 min a 37 °C.
7. Prepare um volume igual de meio EGM em um tubo cônico de 50 mL para neutralizar a enzima de dissociação. Coloque um coador de células de 40 μm no tubo cônico de 50 mL e passe a suspensão celular dissociada através do coador. Troque o filtro para cada poço dissociado de 2 a 3.
8. Enumerar as células viáveis totais usando 0,4% azul Tripano usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
9. Pelota a suspensão da célula a 300 x g por 5 min em um conjunto de centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
10. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de célula em volume apropriado de tampão de classificação com base na contagem total da etapa 3.8.
    NOTA: Adicione 80 μL de tampão de classificação por ¹⁰⁷ células totais.
11. Para rotulagem de contas magnéticas, adicione 20 μL de reagente de bloqueio de FcR por ¹⁰⁷ células e incubar por 5 minutos.
12. Adicione 20 μL de Microesferas CD144 ou CD31 por ¹⁰⁷ células e misture bem. Incubar a suspensão da célula no escuro a 4 °C por 15 min.
13. Adicione 20 mL de tampão de classificação para lavar as células rotuladas e pelotar as células 300 x g por 5 min em um conjunto de centrífuga pré-resfriado a 4 °C.
14. Resuspenda a pelota de célula em 3 mL de tampão de classificação e deixe-a no gelo.
15. Prepare uma coluna de separação magnética colocando a coluna no entalhe separador.
16. Equilibre a coluna enxaguando com 3 mL de tampão de classificação e colete o fluxo através de um tubo cônico de resíduos.
17. Uma vez que o tampão de lavagem flua, resuspense a suspensão da célula completamente para quebrar qualquer aglomerado e aplicar a suspensão da célula na coluna.
18. Depois que a suspensão da célula fluir, lave a coluna com 3 mL de tampão de classificação três vezes para remover quaisquer células não rotuladas.
19. Remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo cônico de 15 mL para eluição ^celular CD144⁺/CD31+.
20. Adicione 5 mL de tampão de classificação na coluna e lave imediatamente as células magneticamente rotuladas com o êmbolo.
21. Determine o número de celular viável usando 0,4% azul Trypan usando um hemótmetro ou um contador de células automatizado.
22. Centrifugar a suspensão celular em uma centrífuga pré-resfriada a 300 x g por 3 min.
23. Resuspenja a pelota celular em volume apropriado de EGM com 5-8 μM de inibidor TGFβ (SB431542) com base na contagem total na etapa 3.21.
24. Abo chapa esta passagem 0 (P0) células em uma densidade celular apropriada (4 x ¹⁰⁴ células/^cm2) em uma placa de gelatina pré-revestida de 0,2%.
25. Para P0 e P1, continue reabastecendo o meio com EGM fresco a cada 2 dias com inibidor TGFβ. A partir de P2, as células podem ser cultivadas em meio de crescimento endotelial sem inibidor TGFβ.

4. Diferenciação do fibroblasto cardíaco

1. Permitir que os iPSCs se tornem 90% a 95% confluentes; lavar cada poço com 1 mL PBS.
2. Comece a diferenciação no dia 0 adicionando 2 mL de diferenciação Média #1 com 11 μM CHIR. Para linhas sensíveis do iPSC, a concentração pode variar entre 9-10 μM.
3. No primeiro dia, observe a placa. É normal observar morte celular significativa com ~30% a 40% de células aderidas à placa.
4. No dia 3, adicione 2 mL de diferenciação Médio #1 com 5 μM IWR-1-endo para promover a expansão de progenitores cardíacos.
5. No dia 4, substitua o meio por 2 mL de meio de diferenciação de fibroblasto cardíaco. Substitua por meio fresco a cada 2 dias até o dia 16.
6. No dia 18, desprendem as células usando 1 mL de 10x Trypsin em cada poço de uma placa de 6 poços por 10 min a 37 °C.
7. Interrompa completamente a camada celular e passe a suspensão da célula através de um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL contendo igual volume de médio DMEM/F12 complementado com 5% de FBS.
8. Determine o número de celular viável usando 0,4% azul Trypan usando um hemótmetro ou um contador de células automatizado.
9. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g por 5 min para obter uma pelota.
10. Para o primeiro replato, resuspenque a pelota celular em um volume apropriado de meio de diferenciação e placa em uma densidade celular (6 x ¹⁰⁴ células/^cm2) em uma placa revestida de gelatina de 0,2% até 90% de confluência.
11. Divida a placa e mantenha os fibroblastos cardíacos em DMEM/F12 regulares com 10% de soro em placas revestidas de gelatina.

5. Fundição de moldes de microtissue cardíacos e semeadura celular

1. Derreta a agarose em um micro-ondas em uma garrafa de vidro de 100 mL até ferver. Pulverize a garrafa de agarose e coloque-a no armário de biossegurança. Deixe a agarose esfriar por ~3 min.
2. Pipeta 700 μL de agarose derretida em um micro-molde de silicone de 9 x 9 matriz. Evite gerar bolhas durante a pipetação.
3. Coloque cuidadosamente o molde em um bloco de gelo pré-resfriado para acelerar a gárose.
4. Certifique-se de que uma vez que a agarose é gelada, ela se torna translúcida. Dobre cuidadosamente as bordas do microfoto para soltar a réplica da ágarose. Em seguida, descasque suavemente a réplica de todos os lados para separar a réplica da ágarose do micro-molde de silicone.
5. Transfira a bandeja de microtissue agarose contendo 81 recessos circulares (800 μm de diâmetro; 800 μm de profundidade) em uma placa estéril de 12 poços.
6. Adicione 2 mL de PBS à bandeja de microtesue agarose e inspecione sob o microscópio para quaisquer bolhas presas ou poços de forma irregular.
7. Submergir a bandeja de agarose em 2 mL 70% de etanol durante a noite, seguido pelo tratamento UV no gabinete de biossegurança por 1h.
8. Antes de usar, retire o etanol de 70% e lave duas vezes com água destilada e uma lavagem final com PBS de 2 ml.
9. Trypsinize, neutralize e conte iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs e coloque as suspensões celulares no gelo.
10. Remova o PBS do poço e da câmara de semeadura celular cuidadosamente sem tocar nos recessos.
11. Em um novo tubo, misture iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs na proporção 7:2:1, respectivamente, para alcançar uma densidade celular final de ¹⁰⁶ células/mL. Maiores densidades celulares resultarão em microtissues maiores.
    NOTA: Não exceda 2 x ¹⁰⁶ células/mL.
12. Adicione cuidadosamente os 200 μL da suspensão da célula em gota na câmara de semeadura.
13. Deixe as células se instalarem a 37 °C em uma incubadora de _CO2 por 2h.
14. Adicione meio de fabricação de microtissue ao redor do molde de agarose para cobrir apenas a superfície da câmara interna.
15. Após 24 horas, as células se auto-montam e compactam significativamente nos recessos circulares. Substitua por meio fresco a cada 2 dias para manutenção.

6. Fixação e permeabilização de células e microtissues cardíacas para imunossuagem

1. Para cada tipo de célula individual, cultue as células separadamente em lâminas de câmara revestidas de membrana do porão ou lâminas de câmara revestidas de gelatina (aproximadamente 2,5-3 x ¹⁰⁵ células/mL). Microtissues cardíacas podem ser coletadas em tubo cônico de 15 mL, expulsando-as suavemente dos recessos circulares.
2. Aspirar o meio e enxaguar as células ou microtissues com 1 mL PBS; depois disso, fixe com o tampão de fixação contendo 4,2% pfa para 20 min para os slides da câmara e 1h para microtissues à temperatura ambiente.
3. Aspire o PFA e adicione 1 mL de solução permeabilizante (0,25% Triton X-100 em PBS) por 5 a 7 min para lâminas de câmara e 20 min para microtissues em tubo cônico de 15 mL.
   NOTA: A partir deste passo em diante, as amostras podem ser suavemente balançadas em uma plataforma de balanço de bancada.
4. Aspire a solução de permeabilização e enxágue uma vez com 2 a 3 mL de PBS.
5. Incubar as células com 500-1.000 μL de solução de bloqueio (soro de cabra ou soro de burro normal de 2% a 5% normal) por pelo menos 1h para os slides da câmara e 3 a 4 horas para os microtissues.
6. Incubar as células ou microtissues cardíacas com anticorpos conjugados preparados na solução de bloqueio suficiente para cobrir a amostra. Incubar com troponina anti-cardíaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) e anti-DDR2/Vimentina (1:50) para 1h para os slides da câmara e durante a noite a 4 °C para microtissues cardíacas.
7. Lave os slides da câmara três vezes com 500 μL 0,1% Tween-20 por 5 minutos entre cada lavagem e uma lavagem final com PBS.
8. Para os microtissues cardíacos, lave com 2 mL 0,1% Tween-20 cinco vezes com 20 minutos de duração entre cada lavagem. Faça uma etapa final de lavagem por mais 20 minutos.
9. Incubar as células ou microtissues com 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 μg/mL) antes da microscopia confocal.
10. Para microtissues cardíacas, transfira cuidadosamente para uma placa de fundo de vidro de 35 mm e adicione PBS para submergir microtissues.
11. Para imagens 3D, o uso de um objetivo de imersão de óleo de 20x ou 40x ganha foco central do microtissue e ajusta parâmetros de exposição para cada fluoróforo.
12. Para obter uma pilha Z, defina as primeiras e últimas coordenadas no modo Live com uma profundidade total de imagem de 100-200 μm com intervalo de fatia de 5-10 μm.

7. Digestão de microtissues cardíacas e preparação de células para citometria de fluxo

1. Para digerir microtissues, lave suavemente os microtissues com o Medium #1 dos recessos circulares usando uma ponta de pipeta de 1 mL larga em um tubo cônico de 15 mL.
2. Permita que os microtissues se assentam e aspirem o meio cuidadosamente e enxágue as células ou microtissues com PBS de 1 mL e adicione 200-300 μL de tampão de digestão enzimática por 20 min a 37 °C. Em 10 min, misture os microtissues suavemente por 1 min e incubar novamente a 37 °C pelo resto do tempo.
3. Após a incubação, use uma dica regular de pipeta de 1 mL para misturar os microtissues vigorosamente para obter uma suspensão de célula turva.
4. Uma vez que as microtissues sejam suficientemente digeridas em células únicas, neutralize imediatamente a suspensão celular com 5 mL de meio contendo 5% de FBS e coe a suspensão celular através de um coador de células de 40 μm. Conte o número total de células e centrifugar a suspensão de célula única a 300 x g por 5 min a 4 °C.
5. Aspire as células de liga de anexo supernante e resuspend 1 x ^105-1 x ¹⁰⁶ em tampão de ligação de anexo de 100 μL com anexo FITC V e 100 μg/mL de iodida (PI) ou corante de exclusão celular morta To-Pro3 por 10 minutos no gelo.
6. Após a incubação, adicione 300 μL do tampão de ligação de anexo à suspensão da célula e transfira para um tubo FACS de fundo redondo para análise de citometria de fluxo. Use os lasers corretos e filtros de emissão para os fluoroforos selecionados.
7. Para quantificação de marcadores de superfície celular utilizando células fixas, realize a fixação e permeabilização da pelota celular conforme descrito nas etapas 6.2 e 6.3.
8. Após a permeabilização, enxágue a pelota celular e incuba as células com os respectivos anticorpos conjugados por 1h. Lave a pelota celular em tampão FACS de 4 mL (2% FBS em PBS) e centrífuga a 300 x g por 3 min. Repita o passo de lavagem duas vezes.
9. Resuspend as células em 200-300 μL FACS buffer para análise de citometria de fluxo.
10. Ajuste as propriedades de dispersão dianteira e lateral com uma amostra não manchada e considere usar um controle isótipo para cada fluoróforo para ajustar as tensões a laser. Colete um mínimo de 20.000 eventos para análise de dados.

8. Realizando análises de contração de microtissues cardíacas que batem espontaneamente

1. Grave vídeos de microtissues cardíacas para capturar pelo menos três batidas. Defina a resolução de gravação para pelo menos 1280 x 720 pixels à taxa de quadros >30 quadros por segundo e salve o vídeo em . Formato AVI.
2. Execute o script ^MotionGUI11 em um ambiente MATLAB para iniciar a interface do usuário.
3. Encontre o. Localização do arquivo AVI em sua pasta para carregar o vídeo. Em seguida, digite a taxa de quadros em que o vídeo foi capturado no painel De entrada.
4. No painel de entrada avançado, um tamanho de pixel pode ser especificado com base na resolução e na ampliação da captura.
5. Um tamanho de pixel de macrobloco adequado pode ser especificado (padrão 16) e um movimento de pixel detectável dependendo da força da contração de microtissue.
6. Depois de ajustar os parâmetros, clique em Obter vetores de movimento para iniciar a análise.
7. Selecione uma região de interesse com o botão de rádio Choose AOI para excluir áreas ao redor do microtissue único no recesso circular.
8. Use a função Map Time Ave para gerar um mapa de calor de contração média baseado no movimento detectado em eixos X e Y.
9. Para dados de rastreamento de pico, use a função Obter Dados de Contração para medir automaticamente os picos de contração e relaxamento.
10. No caso de uma baixa relação sinal-ruído, aplique um limiar de altura e distância de pico para anotar corretamente a velocidade máxima de contração (ponto azul) e velocidade máxima de relaxamento (triângulo vermelho).
11. Depois de definir os limites corretos, selecione Analisar picos para obter os valores de contração e relaxamento com taxa de batida e intervalo de batida.
12. Obter medições de um mínimo de 25 microtissues individuais para análises estatísticas.

Resultados

Caracterização de icometria e citometria de fluxo de CMs, CEs e CFs derivados do iPSC
Para gerar microtissues cardíacas compostas por iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs, todos os três tipos de células são diferenciados e caracterizados individualmente. A diferenciação in vitro de iPSCs para iPSC-CMs melhorou nos últimos anos. No entanto, o rendimento e a pureza dos iPSC-CMs diferem de linha para linha. O protocolo atual produz mais de 75% de iPSC-CMs puros que começam a bater espontaneam...

Discussão

Para gerar microtissues cardíacas a partir de iPSC-CMs pré-diferenciados, iPSC-CEs e iPSC-CFs, é essencial obter uma cultura altamente pura para um melhor controle dos números celulares após a compactação celular inibida pelo contato dentro das microtissues cardíacas. Recentemente, Giacomelli et. ^al.18 demonstraram a fabricação de microtissues cardíacas utilizando iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs. As microtissues cardíacas geradas usando o método descrito consistem em ~5.000 células (70...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Fisher Scientific	08-772-29
3D micro-molds	Microtissues	12-81 format
6-well plates	Fisher Scientific	08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution	Thermo Fisher Scientific	NC9104697
B27 Supplement minus Insulin	Life Technologies	A1895601
B27 Supplement plus Insulin	Life Technologies	17504-044
BD Cytofix	BD Biosciences	554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix	BD Biosciences	354277
Cardiac Troponin T Antibody	Miltenyi	130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads	Miltenyi	130-097-857
CD31 Antibody	Miltenyi	130-110-670
CD31 Microbeads	Miltenyi	130-091-935
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DDR2	Santa Cruz Biotechnology	sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI	Thermo Fisher Scientific	V13242
Dispase I	Millipore Sigma	4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium		11960044
DMEM/F-12 basal medium	Gibco	11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-136
EGM2 BulletKit	Lonza	CC-3124
Fetal bovine serum	Life Technologies	10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit	LifeLIne Cell Technology	LS-1010
Glucose free RPMI medium	Life Technologies	11879-020
Goat serum	Life Technologies	16210-064
Human FGF-basic	Thermo Fisher Scientific	13256029
Human VEGF-165	PeproTech	100-20
IWR-1-endo	Selleckchem	S7086
Liberase TL	Millipore Sigma	5401020001
LS Sorting Columns	Miltenyi	130-042-401
MACS BSA Stock solution	Miltenyi	130-091-376
MACS Rinsing Buffer	Miltenyi	130-091-222
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302
RPMI medium	Life Technologies	11835055
SB431542	Selleckchem	S1067
TO-PRO 3	Thermo Fisher Scientific	R37170
Triton X-100	Millipore Sigma	X100-100ML
TrypLE Select 10X	Thermo Fisher Scientific	red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody	R&D Systems	IC2105G