Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas Emparejada con La Vaporización Total De Microextracción En Fase Sólida Como Una Herramienta Forense

Resumen

La microextracción en fase sólida de vaporización total (TV-SPME) vaporiza completamente una muestra líquida mientras que los analitos se absorben en una fibra SPME. Esto permite la partición del analito entre sólo el vapor del disolvente y el recubrimiento de fibra SPME.

Resumen

Cromatografía de gases – Espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica de uso frecuente para el análisis de numerosos analitos de interés forense, incluyendo sustancias controladas, líquidos inflamables y explosivos. GC-MS se puede acoplar con microextracción en fase sólida (SPME), en la que una fibra con un recubrimiento sorptivo se coloca en el espacio de la cabeza por encima de una muestra o se sumerge en una muestra líquida. Los analitos se absorben sobre la fibra que luego se coloca dentro de la entrada de GC calentada para la desorción. Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) utiliza la misma técnica que la inmersión SPME pero sumerge la fibra en un extracto de muestra completamente vaporizado. Esta vaporización completa da como resultado una partición entre solo la fase de vapor y la fibra SPME sin interferencias de una fase líquida o de cualquier material insoluble. Dependiendo del punto de ebullición del disolvente utilizado, TV-SPME permite grandes volúmenes de muestra (por ejemplo, hasta cientos de microlitros). La derivatización en fibra también se puede realizar usando TV-SPME. TV-SPME se ha utilizado para analizar fármacos y sus metabolitos en el cabello, la orina y la saliva. Esta técnica simple también se ha aplicado a drogas callejeras, lípidos, muestras de combustible, residuos explosivos post-explosión y contaminantes en el agua. Este trabajo destaca el uso de TV-SPME para identificar adulterantes ilegales en muestras muy pequeñas (cantidades de microlitro) de bebidas alcohólicas. El gamma-hydroxybutyrate (GHB) y la gamma-butyrolactone (GBL) fueron identificados en los niveles que serían encontrados en bebidas puntiagudas. La derivatización por un agente trimetilsililo permitió la conversión de la matriz acuosa y el GHB en sus derivados de TMS. En general, TV-SPME es rápido, fácil y no requiere preparación de la muestra aparte de colocar la muestra en un vial de espacio para la cabeza.

Introducción

La microextracción en fase sólida (SPME) es una técnica de muestreo en la que se coloca una muestra líquida o sólida en un vial de espacio de cabeza y una fibra SPME, recubierta con un material polimérico, se introduce en el espacio de cabeza de la muestra (o se sumerge en una muestra líquida). El analito sesorbe sobre la fibra y luego la fibra se coloca dentro de la entrada GC para la desorción^1,2. La microextracción en fase sólida de vaporización total (TV-SPME) es una técnica similar a la SPME de inmersión, pero vaporiza completamente una muestra líquida antes de que los analitos se adsorban en la fibra. Esto permite la partición del analito entre sólo el vapor del disolvente y el recubrimiento de la fibra, lo que permite que más del analito sea adsorbido sobre la fibra y resultando en una buena sensibilidad^3. Hay varias fibras SPME disponibles y la fibra debe elegirse en función del analito de interés, el disolvente /matriz y el agente de derivatización. Véase el Cuadro 1 para los analitos establecidos de TV-SPME.

muestra	Analito(s)	Fibra SPME recomendada	Referencia(s)
Cabello humano	Nicotina, cotinina	Polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), poliacrilato (PA)	3
Polvo sin humo	Nitroglicerina, difenilamina	Polidimetilsiloxano (PDMS), polietilenglicol (PEG)	7, 8
Combustible de carreras	Metanol, nitrometano	clavija	9
Agua	Hidrocarburos aromáticos policíclicos	PDMS	10
bebestibles	ɣ-Ácido hidroxibutírico, ɣ-butirolactona	PDMS	Esta Obra
Polvo sólido	Metanfetamina, anfetamina	PDMS/DVB	inédito

Tabla 1. Fibras SPME recomendadas con analitos TV-SPME establecidos.

Para realizar TV-SPME, los analitos se disuelven en un disolvente y una alícuota de esta mezcla se coloca en un vial de espacio para la cabeza. Las muestras no necesitan ser filtradas porque solo el solvente y los analitos volátiles se vaporizarán. Se deben utilizar volúmenes específicos de muestras líquidas para garantizar la vaporización total de la muestra. Estos volúmenes se determinan utilizando la Ley del Gas Ideal para calcular el número de moles de un disolvente multiplicado por el volumen molar del líquido (Ecuación 1).
Ecuación 1

donde V_o es el volumen de la muestra (mL), P es la presión de vapor del disolvente (bar), V_v es el volumen del vial (L), R es la constante de gas ideal (0.083145 ), M es la masa molar del disolvente (g/mol), T es la temperatura (K), y es la densidad del disolvente (g/mL). ^3.

Para utilizar la presión de vapor correcta, se utiliza la ecuación de Antoine (Ecuación 2) para explicar la influencia de la temperatura:⁴
Ecuación 2

donde T es la temperatura y A, B y C son las constantes de Antoine para el disolvente. La ecuación 2 puede ser sustituida por la ecuación 1, produciendo:
Ecuación 3

La ecuación 3 da el volumen de la muestra (V_o) que puede ser completamente vaporizado en función de la temperatura y el disolvente utilizado.

Para realizar la derivatización con TV-SPME, la fibra SPME se expone primero a un vial que contiene el agente de derivatización durante un período de tiempo predeterminado dependiendo del analito. La fibra SPME se expone entonces a un nuevo vial que contiene el analito de interés. Este vial se calienta dentro de un agitador calentado. El analito se adsorbe entonces sobre la fibra con el agente de derivatización. La derivatización del analito y/o la matriz tiene lugar en la fibra antes de ser insertada en la entrada gc para la desorción. La Figura 1 muestra una representación del proceso TV-SPME con derivatización.

Figura 1: Representación del proceso TV-SPME con derivatización. La fibra SPME entra primero en el vial de derivatización donde el agente de derivatización (círculos amarillos) sesorbe sobre la fibra. La fibra se introduce en la muestra (círculos azules) y se calienta. La formación del derivado (círculos verdes) tiene lugar en la fibra durante el tiempo de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

TV-SPME es beneficioso porque permite que el analito se derivetized durante el proceso de extracción que reduce el tiempo de análisis. Otros métodos, como la inyección de líquido, requieren que el analito reaccione con el agente derivatizante en solución antes de ser inyectado en el GC. TV-SPME también requiere poca o ninguna preparación de la muestra. Una matriz que contiene un analito se puede colocar directamente en el vial del espacio de la cabeza y analizarse. Muchos compuestos de interés son compatibles con TV-SPME. Los compuestos deben ser solubles en un disolvente y lo suficientemente volátiles como para permitir la vaporización. Además, los compuestos deben ser térmicamente estables para ser analizados por GC-MS. TV-SPME se ha utilizado para analizar fármacos y metabolitos de fármacos, combustibles de carreras, hidrocarburos aromáticos policíclicos y materiales explosivos^{3,5,6,7,8,9,10.}

Protocolo

1. Preparación general de muestras de TV-SPME y análisis GC-MS

NOTA: Si la muestra ya está disuelta en una matriz, vaya al paso 1.2.

1. Extraiga o disuelva la muestra sólida en suficiente disolvente (agua, metanol, acetona, etc.) para alcanzar la concentración deseada. Las muestras líquidas se pueden utilizar "tal cual".
   NOTA: La cantidad de muestra sólida utilizada depende de la concentración deseada de la muestra. Se recomiendan concentraciones inferiores a 1 ppm (p/v) para evitar sobrecargar la columna GC. El analito debe ser soluble en el disolvente orgánico elegido.
   1. Asegúrese de que la muestra se ha disuelto por completo.
2. Calcule el volumen necesario para vaporizar completamente la muestra utilizando la Ecuación 3 a la temperatura elegida. Por ejemplo, si el experimento se va a realizar a 60 °C, calcule el volumen necesario para vaporizar completamente el disolvente a 60 °C.
   1. Transfiera este volumen de muestra a un vial de espacio en la cabeza y asegure la tapa. Los métodos aceptables para transferir muestras líquidas a escala de microlitro incluyen manualmente a través de una jeringa de vidrio, una jeringa de vidrio electrónico o un robot automuestreador capaz de transferir líquidos para la preparación de muestras.
3. Si derivatiza la muestra, prepare el agente de derivatización adecuado colocando ~1 mL del agente en un vial de espacio en la cabeza.
   1. Elija el agente de derivatización en función del tipo de derivatización necesaria: alquilación, acilación o siliberación. En este caso, el agente de derivatización recomendado para los grupos funcionales de ácido carboxílico y alcohol que se encuentran en el GHB es O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA). El agente de derivatización puede utilizarse "tal cual" y no requiere dilución. Un mL de agente de derivatización es suficiente para asegurar la saturación completa de la fibra SPME.
      PRECAUCIÓN: Los agentes de derivatización son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora de humos.
4. Establezca la temperatura de incubación/extracción adecuada en función del cálculo del paso 1.2. Esta temperatura asegura la vaporización total, la extracción suficiente de la muestra y la derivatización completa (si es necesario).
   1. Seleccione los parámetros GC-MS (programa de temperatura del horno, caudal, temperatura de entrada, etc.) en función de la clase de compuesto(s) de interés. Consulte el paso 3 para obtener un conjunto de parámetros de ejemplo.
   2. Asegúrese de que el revestimiento de entrada adecuado (por ejemplo, 2 mm de diámetro interior o menos) está en la entrada GC.
5. Asegúrese de que la fibra SPME ha sido correctamente acondicionado y está en buenas condiciones de trabajo antes de comenzar el análisis.
   1. Varíe los parámetros de acondicionamiento según el tipo de fibra SPME que se esté utilizando. Consulte las instrucciones de fibra SPME para obtener la temperatura y el tiempo de acondicionamiento adecuados. En general, el análisis de varios espacios en blanco de fibra SPME hasta que sean reproducibles es suficiente para caracterizar una fibra SPME como totalmente condicionada.

2. Gamma-hidroxibutirato (GHB) y gamma-butirolactona (GBL) preparación de muestras

1. Preparar una muestra de GHB y/o GBL en agua con una concentración inferior a 1 ppm.
2. Transferir 1 μL de esta muestra a un vial de 20 ml de espacio de cabeza utilizando uno de los métodos descritos en el punto 1.2.1.
   1. Tenga en cuenta que el análisis de muestras acuosas requiere los volúmenes de muestra más bajos. Por ejemplo, un μL de agua se vaporizará completamente en un vial de espacio de cabeza de 20 ml a 60 °C.
   2. Tapar el vial inmediatamente.
3. Coloque ~ 1 mL de BSTFA + 1% de trimetilclorosilano (TMCS) en un vial y tapa separados de 20 ml de espacio de cabeza.
   Nota: GBL no derivatize. Un paso de derivatización todavía se requiere, sin embargo, es asegurar que el disolvente de agua derivatiza y no interfiere con la muestra.
   PRECAUCIÓN: BSTFA es tóxico y debe manipularse en una campana extractora de humos.

3. Parámetros de GC-MS y configuración para GHB y GBL en agua

1. Cree un método utilizando los siguientes parámetros GC-MS:
   Temperatura inicial del horno: 60 °C mantenido durante 1 minuto.
   Programa horno: 15 °C/minuto.
   Temperatura final del horno: 280 °C, mantenido durante 1 minuto.
   Caudal: 2,5 mL/minuto (caudal optimizado en velocidad para una columna de 0,25 mm i.d.).
   Temperatura de entrada: 250 °C.
   Temperatura de la línea de transferencia: 280 °C.
2. Asegúrese de que se haya colocado un revestimiento de entrada SPME estrecho (2 mm i.d. o menos) dentro de la entrada GC.
3. Asegúrese de que la fibra PDMS/DVB SPME se haya acondicionado correctamente y esté en buen estado de funcionamiento antes del análisis.
   NOTA: Las fibras PDMS/DVB SPME deben acondicionarse en la entrada GC a 250 °C durante 30 minutos. Las fibras PDMS/DVB SPME deben ser de un color blanquecino.
4. Ejecute el GC-MS en el ejemplo.

Resultados

Un estudio del volumen de GBL fue realizado para demostrar la sensibilidad de TV-SPME comparado al espacio principal y a la inmersión SPME. Se preparó una muestra de 100ppm_v de GBL en agua y se colocó en viales de espacio de cabeza de 20 ml con volúmenes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 y 10,000 μL. La relación de fase de las muestras permitió TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3.000 μL) y Immersion SPME (10.000 μL). Todas las muestras se analizaron por triplicado y el área de pico promed...

Discusión

TV-SPME tiene algunos beneficios sobre la inyección de líquido GC en que los tamaños de muestra grandes (por ejemplo, 100 μL) se pueden utilizar sin modificaciones del instrumento. TV-SPME también tiene algunos de los mismos beneficios que el espacio de cabeza SPME. Headspace SPME no requiere ninguna extracción o filtración porque cualquier compuesto no volátil permanecerá en el vial de headspace y no se adsorberá en la fibra, produciendo una muestra limpia. Este método también ayuda a eliminar los efectos de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µL Syringe	Gerstel	100111-014-00
BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM)	Regis Technologies Inc.	50442882
eVol XR Sample Dispensing System Kit	ThermoFisher Scientific	66002-024
-Butyrolactone (GBL)	Sigma-Aldrich	B103608-26G
-Hydroxy Butyric Acid (GHB)	Cayman Chemicals	9002506
Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm	Restek	23083
Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm	Restek	23091
Optima water for HPLC	Fisher Chemical	W71
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57341-U
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB)	Supelco	57293-U
Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner	Restek	23313