Espectrometria de massa de cromatografia a gás emparelhada com microextração de fase sólida de vaporização total como ferramenta forense

Resumo

A Microextração de Fase Sólida de Vaporização Total (TV-SPME) vaporiza completamente uma amostra líquida enquanto os analitos são sorbados em uma fibra SPME. Isso permite a particionamento do analito entre apenas o vapor solvente e o revestimento de fibra SPME.

Resumo

Cromatografia gasosa – Espectrometria de Massa (GC-MS) é uma técnica frequentemente utilizada para a análise de numerosos analitos de interesse forense, incluindo substâncias controladas, líquidos inflamáveis e explosivos. O GC-MS pode ser acoplado à Microextração de Fase Sólida (SPME), na qual uma fibra com revestimento sorptivo é colocada no espaço da cabeça acima de uma amostra ou imersa em uma amostra líquida. Os analitos são sorbados sobre a fibra que é então colocada dentro da entrada aquecida gc para desorção. A Microextração de Fase Sólida (TV-SPME) utiliza a mesma técnica do SPME de imersão, mas imergi a fibra em um extrato de amostra completamente vaporizado. Esta vaporização completa resulta em uma divisória entre apenas a fase de vapor e a fibra SPME sem interferência de uma fase líquida ou quaisquer materiais insolúveis. Dependendo do ponto de ebulição do solvente utilizado, a TV-SPME permite grandes volumes de amostra (por exemplo, até centenas de microliters). A derivatização on-fiber também pode ser realizada utilizando TV-SPME. A TV-SPME tem sido usada para analisar drogas e seus metabólitos em cabelo, urina e saliva. Esta técnica simples também tem sido aplicada a drogas de rua, lipídios, amostras de combustível, resíduos explosivos pós-explosão e poluentes na água. Este artigo destaca o uso de TV-SPME para identificar adúlteros ilegais em amostras muito pequenas (quantidades de microliteres) de bebidas alcoólicas. Tanto o gama-hidroxibutirato (GHB) quanto o gama-butyrolactona (GBL) foram identificados em níveis que seriam encontrados em bebidas espetadas. A derivação por um agente trimetilsilyl permitiu a conversão da matriz aquosa e GHB em seus derivados TMS. No geral, a TV-SPME é rápida, fácil e não requer preparação de amostra, além de colocar a amostra em um frasco de headspace.

Introdução

A Microextração de Fase Sólida (SPME) é uma técnica de amostragem na qual uma amostra líquida ou sólida é colocada em um frasco de espaço para a cabeça e uma fibra SPME, revestida com um material polimérico, é então introduzida no headspace da amostra (ou imersa em uma amostra líquida). O analito é sorbado sobre a fibra e, em seguida, a fibra é colocada dentro da entrada GC para desorção^1,2. A Microextração de Fase Sólida (TV-SPME) é uma técnica semelhante à spme de imersão, mas vaporiza completamente uma amostra líquida antes que os analitos sejam adsorvidos na fibra. Isso permite particionamento do analito entre apenas o vapor solvente e o revestimento da fibra, permitindo que mais do analito seja adsorvida na fibra e resultando em boa sensibilidade³. Existem várias fibras SPME disponíveis e a fibra deve ser escolhida com base no analito de interesse, solvente/matriz e agente de derivatização. Consulte a Tabela 1 para analitos de TV-SPME estabelecidos.

amostra	Analyte	Fibra SPME recomendada	Referência(s)
Cabelo Humano	Nicotina, cotinina	Polidimethylsiloxano/divinylbenzeno (PDMS/DVB), poliacrilato (PA)	3
Pó sem fumo	Nitroglicerina, difenilamina	Polidimimetilsiloxano (PDMS), polietileno glicol (PEG)	7, 8
Combustível de corrida	Metanol, nitrometano	gancho	9
Água	Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos	PDMS	10
Bebidas	ɣ-ácido hidroxibutírico, ɣ-butyrolactona	PDMS	Este Trabalho
Pó Sólido	Metanfetamina, anfetamina	PDMS/DVB	inédito

Mesa 1. Fibras SPME recomendadas com analitos de TV-SPME estabelecidos.

Para realizar a TV-SPME, os analitos são dissolvidos em um solvente e uma alíquota dessa mistura é colocada em um frasco de headspace. As amostras não precisam ser filtradas porque apenas os analitos solventes e voláteis vaporizarão. Devem ser utilizados volumes específicos de amostras líquidas para garantir a vaporização total da amostra. Esses volumes são determinados utilizando-se a Lei do Gás Ideal para calcular o número de mols de um solvente multiplicado pelo volume molar do líquido (Equação 1).
Equação 1

onde V_o é o volume da amostra (mL), P é a pressão de vapor do solvente (barra), V_v é o volume do frasco (L), R é a constante de gás ideal (0,083145 ), M é a massa molar do solvente (g/mol), T é temperatura (K), e é a densidade do solvente (g/mL). ³

Para usar a pressão correta do vapor, a equação de Antoine (Equação 2) é usada para explicar a influência da temperatura:⁴
Equação 2

onde T é temperatura e A, B e C são as constantes antoine para o solvente. A equação 2 pode ser substituída na Equação 1, rendendo:
Equação 3

A equação 3 dá o volume da amostra (V_o) que pode ser completamente vaporizado em função da temperatura e do solvente utilizado.

Para realizar a derivatização com TV-SPME, a fibra SPME é primeiramente exposta a um frasco contendo o agente de derivatização por um período de tempo predeterminado, dependendo do analito. A fibra SPME é então exposta a um novo frasco contendo o analito de interesse. Este frasco é aquecido dentro de um agitador aquecido. O analito é então adsorvido na fibra com o agente de derivatização. A derivatização do analito e/ou da matriz ocorre na fibra antes de ser inserida na entrada gc para desabedação. A Figura 1 mostra uma representação do processo TV-SPME com derivatização.

Figura 1: Representação do processo TV-SPME com derivatização. A fibra SPME entra primeiro no frasco de derivatização onde o agente de derivatização (círculos amarelos) sorb sobre a fibra. A fibra é então introduzida à amostra (círculos azuis) e aquecida. A formação do derivado (círculos verdes) ocorre na fibra durante o tempo de extração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A TV-SPME é benéfica porque permite que o analito seja derivado durante o processo de extração, o que reduz o tempo de análise. Outros métodos, como a injeção líquida, exigem que o analito reaja com o agente derivatante em solução antes de ser injetado no GC. A TV-SPME também requer pouca ou nenhuma preparação amostral. Uma matriz contendo um analito pode ser colocada diretamente no frasco do espaço para a cabeça e analisada. Muitos compostos de interesse são compatíveis com TV-SPME. Os compostos devem ser solúveis em um solvente e suficientemente voláteis para permitir a vaporização. Além disso, os compostos devem ser termicamente estáveis a serem analisados pelo GC-MS. A TV-SPME tem sido usada para analisar drogas e metabólitos de drogas, combustíveis de corrida, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e materiais explosivos^{3,5,6,7,8,9,10}.

Protocolo

1. Preparação geral da amostra de TV-SPME e análise de GC-MS

NOTA: Se a amostra já estiver dissolvida em uma matriz, pule para o Passo 1.2.

1. Extrair ou dissolver a amostra sólida em solvente suficiente (água, metanol, acetona, etc.) para alcançar a concentração desejada. Amostras líquidas podem ser usadas "como está".
   NOTA: A quantidade de amostra sólida utilizada depende da concentração desejada da amostra. Concentrações abaixo de 1 ppm (c/v) são recomendadas para evitar sobrecarregar a coluna GC. Analito deve ser solúvel em solvente orgânico escolhido.
   1. Certifique-se de que a amostra foi totalmente dissolvida.
2. Calcule o volume necessário para vaporizar totalmente a amostra usando a Equação 3 na temperatura escolhida. Por exemplo, se o experimento for realizado a 60 °C, calcule o volume necessário para vaporizar completamente o solvente a 60 °C.
   1. Transfira este volume de amostra para um frasco de espaço para a cabeça e fixe a tampa. Métodos aceitáveis para a transferência de amostras líquidas na escala de microliter incluem manualmente através de seringa de vidro, uma seringa de vidro eletrônico ou um robô autosampler capaz de transferências líquidas para preparação de amostras.
3. Se derivatizar a amostra, prepare o agente de derivação adequado colocando ~1 mL do agente em um frasco de headspace.
   1. Escolha o agente de derivação com base no tipo de derivatização necessária: alquilação, aciilação ou silicação. Neste caso, o agente de derivatização recomendado para os grupos funcionais de ácido carboxílico e álcool encontrados no GHB é O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamida (BSTFA). O agente de derivatização pode ser usado "como está" e não requer diluição. Um mL de agente de derivatização é suficiente para garantir a saturação completa da fibra SPME.
      ATENÇÃO: Os agentes de derivatização são tóxicos e devem ser manuseados em um capô de fumaça.
4. Defina a temperatura de incubação/extração adequada com base no cálculo da etapa 1.2. Esta temperatura garante vaporização total, extração suficiente da amostra e derivação completa (se necessário).
   1. Selecione parâmetros GC-MS (programa de temperatura do forno, taxa de fluxo, temperatura de entrada, etc.) com base na classe dos compostos de interesse. Consulte o Passo 3 para um conjunto de parâmetros de exemplo.
   2. Certifique-se de que o forro de entrada adequado (por exemplo, 2 mm de diâmetro interno ou menos) esteja na entrada GC.
5. Certifique-se de que a fibra SPME foi devidamente condicionada e está em boas condições de trabalho antes de iniciar a análise.
   1. Varie os parâmetros de condicionamento com base no tipo de fibra SPME utilizada. Consulte as instruções de fibra SPME para obter temperatura e tempo de condicionamento adequados. Em geral, analisar vários espaços em branco de fibra SPME até que sejam reprodutíveis é suficiente para caracterizar uma fibra SPME como totalmente condicionada.

2. Preparação amostral de gamma-hidroxibutirato (GHB) e Gamma-butyrolactona (GBL)

1. Prepare uma amostra de GHB e/ou GBL na água com uma concentração inferior a 1 ppm.
2. Transfira 1 μL desta amostra para um frasco de headspace de 20 mL usando um dos métodos descritos em 1.2.1.
   1. Note-se que a análise de amostras aquosas requer os volumes amostrais mais baixos. Por exemplo, um μL de água será completamente vaporizado em um frasco de 20 mL de headspace a 60 °C.
   2. Tampe o frasco imediatamente.
3. Coloque ~1 mL de BSTFA + 1% trimtilcloosilano (TMCS) em um frasco e tampa separados de 20 mL.
   NOTA: O GBL não derivatiza. Uma etapa de derivação ainda é necessária, no entanto, é garantir que o solvente de água se desvae e não interfira na amostra.
   ATENÇÃO: O BSTFA é tóxico e deve ser manuseado em um capô de fumaça.

3. Parâmetros GC-MS e configuração para GHB e GBL na água

1. Crie um método usando os seguintes parâmetros GC-MS:
   Temperatura inicial do forno: 60 °C mantida por 1 minuto.
   Programa de forno: 15 °C/minuto.
   Temperatura final do forno: 280 °C, mantida por 1 minuto.
   Vazão: 2,5 mL/minuto (fluxo otimizado de velocidade para uma coluna de 0,25 mm de i.d.).
   Temperatura da entrada: 250 °C.
   Temperatura da linha de transferência: 280 °C.
2. Certifique-se de que um forro de entrada SPME estreito (2 mm ou menos) tenha sido colocado dentro da entrada GC.
3. Certifique-se de que a fibra SPME PDMS/DVB foi devidamente condicionada e está em bom estado de funcionamento antes da análise.
   NOTA: As fibras PDMS/DVB SPME devem ser condicionadas na entrada gc a 250 °C por 30 minutos. As fibras PDMS/DVB SPME devem ser de cor off-white.
4. Execute o GC-MS na amostra.

Resultados

Foi realizado um estudo de volume GBL para demonstrar a sensibilidade da TV-SPME em comparação com o headspace e a imersão SPME. Uma amostra de 100ppm_v de GBL na água foi preparada e colocada em frascos de headspace de 20 mL com volumes de 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 e 10.000 μL. A razão de fase das amostras permitida para TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3.000 μL) e Imersão SPME (10.000 μL). Todas as amostras foram analisadas em triplicado e a área média de pico foi traçada em rela...

Discussão

A TV-SPME tem alguns benefícios sobre a injeção líquida GC em que grandes tamanhos de amostra (por exemplo, 100 μL) podem ser usados sem modificações de instrumentos. A TV-SPME também tem alguns dos mesmos benefícios que o HEADSpace SPME. O SPME do headspace não requer nenhuma extração ou filtragem porque quaisquer compostos não ativos permanecerão no frasco do headspace e não serão adsorvidos na fibra, produzindo uma amostra limpa. Este método também ajuda a eliminar os efeitos da matriz devido a este ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µL Syringe	Gerstel	100111-014-00
BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM)	Regis Technologies Inc.	50442882
eVol XR Sample Dispensing System Kit	ThermoFisher Scientific	66002-024
-Butyrolactone (GBL)	Sigma-Aldrich	B103608-26G
-Hydroxy Butyric Acid (GHB)	Cayman Chemicals	9002506
Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm	Restek	23083
Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm	Restek	23091
Optima water for HPLC	Fisher Chemical	W71
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS)	Supelco	57341-U
SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB)	Supelco	57293-U
Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner	Restek	23313