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Resumen

Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.

Resumen

Las rodajas de tejido pancreático vivo permiten el estudio de la fisiología y la función de los islotes en el contexto de un microambiente intacto de los islotes. Las rodajas se preparan a partir de tejido pancreático humano y de ratón vivo incrustado en agarosa y se cortan con un vibratomo. Este método permite que el tejido mantenga la viabilidad y la función, además de preservar patologías subyacentes como la diabetes tipo 1 (DT1) y la diabetes tipo 2 (DT2). El método de corte permite nuevas direcciones en el estudio del páncreas a través del mantenimiento de las estructuras complejas y diversas interacciones intercelulares que comprenden los tejidos endocrinos y exocrinos del páncreas. Este protocolo demuestra cómo realizar la tinción y la microscopía de lapso de tiempo de células inmunes endógenas vivas dentro de cortes pancreáticos junto con evaluaciones de la fisiología de los islotes. Además, este enfoque se puede refinar para discernir las poblaciones de células inmunes específicas para los antígenos de células de los islotes utilizando los principales reactivos complejos multimer de histocompatibilidad.

Introducción

La afectación del páncreas es patognomónica a enfermedades como la pancreatitis, la DT1 y la DT21,2,3. El estudio de la función en islotes aislados suele implicar la retirada de los islotes de su entornovológico4. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se desarrolló para permitir el estudio del tejido pancreático manteniendo intactos los microambientes de los islotes y evitando el uso de procedimientos estresantes de aislamiento de islotes5,6,7. Las rodajas de tejido pancreático de tejido de donante humano se han utilizado con éxito para estudiar la DT1 y han demostrado procesos de pérdida y disfunción de células beta, además de la infiltración de células inmunes8,9,10,11,12,13. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se puede aplicar tanto al tejido pancreático de ratón como al humano5,6,8. Las rebanadas de tejido pancreático humano de tejidos de donantes de órganos se obtienen a través de una colaboración con la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD). Las rodajas de ratón se pueden generar a partir de una variedad de diferentes cepas de ratón.

Este protocolo se centrará en la recombinación diabética no obesa activando el gen-1-null (NOD. Rag1-/-) y receptor de células T transgénico (AI4) (NOD. Rag1-/-. CEPAS de ratón AI4 α/β). CABECEO. Los ratones Rag1-/- son incapaces de desarrollar células T y B debido a una interrupción en el gen 1 (Rag1)14 activador de la recombinación. CABECEO. Rag1-/-. Los ratones AI4 α/β se utilizan como modelo para la diabetes tipo 1 acelerada porque producen un solo clon de células T que se dirige a un epítopo de insulina, lo que resulta en una infiltración constante de islotes y un rápido desarrollo de la enfermedad15. El protocolo presentado aquí describe procedimientos para estudios funcionales e inmunológicos utilizando cortes pancreáticos vivos humanos y de ratón a través de la aplicación de enfoques de microscopía confocal. Las técnicas descritas en este documento incluyen evaluaciones de viabilidad, identificación y localización de islotes, registros de Ca2+ citosólico, así como tinción e identificación de poblaciones de células inmunes.

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Protocolo

NOTAS: Todos los protocolos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida (201808642). Las secciones pancreáticas humanas de donantes de tejido de ambos sexos se obtuvieron a través del banco de tejidos de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD), Universidad de Florida. La pancreata humana fue extraída de donantes de órganos cadavéricos por organizaciones certificadas de obtención de órganos que se asocian con nPOD de acuerdo con las leyes y regulaciones de donación de órganos y clasificadas como "Sujetos no humanos" por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Florida (IRB) (IRB no. 392-2008), renunciando a la necesidad de consentimiento. Los tejidos nPOD utilizados específicamente para este proyecto fueron aprobados como no humanos por la Universidad de Florida IRB (IRB20140093). Los objetivos de las secciones 1-3 de este protocolo son explicar cómo diseccionar con éxito un ratón, preparar y procesar el páncreas y generar rebanadas de tejido pancreático vivo. Las soluciones deben prepararse con anticipación, y las recetas se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. El tiempo es el factor más crítico durante estos pasos del protocolo. Una vez que el ratón ha sido sacrificado, la viabilidad del tejido comenzará a disminuir. Las tres partes de este protocolo deben completarse lo más rápido posible hasta que se generen todos los segmentos necesarios.

1. Preparación para la generación de rodajas de páncreas de ratón

  1. Sujete la cuchilla en el soporte de la cuchilla del vibratomo, pero no la conecte al vibrátomo todavía.
  2. Derretir 100 ml de agarosa de bajo punto de fusión al 1,25% p/v en un microondas. Opere el microondas en intervalos de 1 minuto y detenga el microondas durante 10 s si la solución de agarosa comienza a hervir. Repita este proceso hasta que la agarosa se derrita y se produzca una solución homogénea. Coloque la botella en un baño de agua a 37 °C.
    NOTA: La baja concentración de agarosa es para explicar la menor densidad del páncreas del ratón.
  3. Llene una jeringa de bloqueo Luer de 10 ml con 3 ml de agarosa tibia. Coloque una aguja de 27 G y 25 mm en la jeringa. Mantenga la jeringa con la aguja tapada en un baño de agua a 37 °C hasta que se inyecte la solución.
    NOTA: Se prefiere una aguja de 27 G, ya que se adapta de forma segura al conducto biliar común de ratones entre 10-25 g de peso corporal y permite el flujo de la solución de agarosa altamente viscosa. Si bien se pueden seleccionar agujas de orificio más grandes para su uso, no se recomiendan agujas más pequeñas (de calibre más grande), ya que pueden obstruirse más fácilmente con la solución de agarosa.
  4. Añadir 20 ml de solución extracelular refrigerada (SEC) a una placa de Petri de 10 cm.
    NOTA: El ECS no necesita ser burbujeado en ningún momento.
  5. Llene dos placas de Petri de 10 cm sin tratar con 15 ml de tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) que contenga 3 mM de D-glucosa e inhibidor de tripsina de soja a una concentración de 0,1 mg/ml por plato.
    NOTA: A lo largo de este protocolo, es esencial que todas las soluciones utilizadas para mantener las rodajas contengan inhibidor de tripsina de soja para prevenir el daño tisular causado por las proteasas digestivas pancreáticas.

2. Escisión de páncreas de ratón y procesamiento de tejidos

NOTA: El protocolo para extirpar el páncreas, procesar el tejido y generar rebanadas se modifica a partir de Marciniak et al5. Para garantizar la viabilidad del tejido, minimice la cantidad de tiempo entre la extirpación del páncreas y la generación de rebanadas. Todo el equipo necesario debe prepararse de antemano y orientarse de manera que permita una progresión rápida a través de los pasos a continuación. La canulación y la inyección del conducto biliar, así como la escisión del páncreas, se realizan mejor bajo un estereoscopio.

  1. El ratón es profundamente anestesiado con isoflurano y sacrificado por dislocación cervical.
    NOTA: El isoflurano es el método de anestesia preferido. Se debe utilizar una concentración de isoflurano al 5%. Por ejemplo, se debe utilizar 0,26 ml con una cámara de 1 L16. Se observó una disminución en la viabilidad del tejido pancreático cuando se utilizó CO2 .
  2. Rocíe al ratón con etanol al 70% v/v generosamente para reducir la contaminación tisular con pelaje durante la disección y la escisión. Coloque el ratón en una orientación dorsal hacia abajo, ventral hacia arriba con el lado anterior a la izquierda.
  3. Usando tijeras, abra el peritoneo y retire la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar el corazón o los vasos adyacentes. Use fórceps para voltear el hígado hacia la cavidad torácica y para mover los intestinos fuera de la cavidad corporal para exponer el conducto biliar común. Use una abrazadera de bulldog Johns Hopkins para ocluir la ampolla de Vater.
  4. Recupere una jeringa de bloqueo Luer de 10 ml precargada con 3 ml de solución de agarosa tibia del baño de agua a 37 °C.
    NOTA: Una vez que la jeringa con la agarosa se retira del baño de agua, la inyección de páncreas debe realizarse rápidamente antes de que la agarosa se enfríe y se fije en la jeringa.
  5. Sosteniendo las pinzas en la mano izquierda, úselas para apoyar y estabilizar suavemente el conducto biliar para la inyección.
  6. Sostenga la jeringa en la mano derecha, inserte el bisel de la aguja hacia arriba en el conducto biliar. Inyecte lenta y constantemente el páncreas. Una vez que comienza la inyección, el flujo no se puede detener sin el endurecimiento de la agarosa en la jeringa y en el páncreas.
    NOTA: El volumen utilizado dependerá del peso del ratón. Según la experiencia, se recomienda que se use 1 ml de solución de agarosa por cada 10 g de peso corporal del ratón con un volumen máximo de 2 ml. El páncreas debe verse ligeramente inflado con una estructura más definitiva, pero no sobreextendido. La sobreinyección da como resultado islotes que se separan del tejido exocrino y que tienen una apariencia "soplada" en las rebanadas.
  7. Extirpar el páncreas lleno de agarosa del ratón. Usando fórceps y tijeras, corte el páncreas, comenzando en el estómago, moviéndose a los intestinos y terminando en el bazo. Una vez cortado, retire suavemente el páncreas inyectado con fórceps y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm llena de ECS refrigerado.
  8. Use tijeras para extirpar el tejido adiposo, el tejido conectivo, el tejido fibrótico y las partes del páncreas que no se inyectan con agarosa.
    NOTA: Las partes del tejido que deben eliminarse no tendrán estructuras fuertemente establecidas y aparecerán algo gelatinosas.
  9. Después de recortar el tejido, use tijeras para cortarlo en secciones más pequeñas que tengan aproximadamente 5 mm de diámetro mientras lo deja sumergido debajo del SEC. Corte el tejido con cuidado, teniendo cuidado de no empujar la agarosa fuera del tejido.
  10. Retire los trozos de tejido del SEC y colóquelos en un limpiaparabrisas de dos capas (consulte la Tabla de materiales). Enrollarlos suavemente en el limpiaparabrisas usando fórceps para eliminar el exceso de líquido.
  11. Usando fórceps, coloque cuidadosamente los trozos de tejido en una placa de Petri de 35 mm con no más de 4 piezas por placa. Coloque el lado más plano del bloque de tejido hacia abajo. Presione suavemente el tejido con fórceps.
    NOTA: Asegúrese de que haya espacio, al menos unos milímetros, entre las piezas de tejido y que no toquen el borde de la placa.
  12. Vierta lentamente la agarosa a 37 ° C en el plato, teniendo cuidado de no verterla directamente sobre el tejido. Vierta lo suficiente para que las piezas de tejido estén completamente cubiertas. Asegúrese de que haya una capa de agarosa sobre las piezas de tejido, ya que esta parte se pegará al soporte de la muestra.
  13. Transfiera cuidadosamente el plato con los trozos de pañuelo de papel a un refrigerador para permitir que la agarosa cuaje. Asegúrese de que las piezas de tejido no se desplacen ni comiencen a flotar. Si lo hacen, reajustarlos rápidamente con fórceps.
    NOTA: El ajuste de la agarosa solo debe tomar unos minutos.
  14. Una vez que la agarosa se haya establecido, use un bisturí para cortar alrededor del tejido en líneas rectas para hacer bloques de agarosa como si estuviera haciendo una rejilla entre los trozos de tejido. Asegúrese de dejar unos pocos milímetros de agarosa rodeando todos los lados del tejido.
    NOTA: No debe haber ningún tejido que sobresalga de la agarosa. Cada bloque debe ser un cubo de aproximadamente 5 mm x 5 mm x 5 mm de volumen.
  15. Use el bisturí para voltear las secciones vacías de agarosa que se cortaron alrededor de los bordes del plato. Retire los bloques con el tejido del plato levantándolos cuidadosamente con fórceps.

3. Generación de rebanadas pancreáticas de ratón

  1. Usando fórceps, coloque los bloques en el soporte de la muestra; colóquelos de lado, teniendo en cuenta que se voltearán sobre el súper pegamento. Organice los bloques de manera que no se extiendan más allá del ancho de la hoja. A medida que el vibratome se mueve lentamente, organice los bloques de modo que la cuchilla tenga que avanzar la menor distancia posible.
    NOTA: Dos filas de tres o cuatro bloques cada una con unos pocos milímetros entre las filas funciona bien. Los bloques dentro de la misma fila pueden tocarse entre sí, pero cuando ambas filas se tocan, puede ser difícil recuperar las rodajas a medida que salen de los bloques.
  2. Aplique una línea de súper pegamento en el soporte de la muestra y use el extremo del dispensador de pegamento para extender el pegamento en una capa delgada. Voltee los bloques de tejido sobre el pegamento para que el lado más cercano al tejido mire hacia arriba. Empuje suavemente hacia abajo los bloques y deje que el pegamento se seque durante tres minutos.
  3. Conecte el soporte de la cuchilla y la placa al vibrátomo, generalmente con un tornillo o un imán, dependiendo del modelo de vibrátomo. Ajuste la altura de la cuchilla y la distancia recorrida para que la cuchilla se mueva a lo largo de los bloques y apenas por encima de ellos.
    NOTA: Las pinzas pueden ser útiles al ajustar la altura de la cuchilla. Se pueden colocar en la parte superior del bloque de tejido para ayudar a colocar la cuchilla lo más cerca posible de la parte superior del bloque sin tocar el bloque.
  4. Asegúrese de que el pegamento se haya secado empujando suavemente los bloques con fórceps y llene la bandeja de vibratomo con ECS refrigerado hasta que la cuchilla esté cubierta. Ajuste el vibratomo para hacer cortes de 120 μm de espesor a una velocidad de 0.175 mm / s, una frecuencia de 70 Hz y una amplitud de 1 mm.
    NOTA: La velocidad del vibratomo se puede ajustar dependiendo de la facilidad de corte del tejido.
  5. Comience el vibratome y observe cuándo comienzan a desprenderse las rebanadas de los bloques de tejido. Use pinzas Graefe de 10 cm o un pequeño pincel No. 4 para retirar cuidadosamente las rodajas una vez que floten fuera del bloque, y colóquelas en placas de 10 cm con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa e inhibidor de tripsina. Recoge las rodajas colocando un pincel o fórceps debajo de ellas y levantando suavemente las rodajas. No incube más de 15 rebanadas juntas en un solo plato.
    NOTA: Es normal que el vibratome tenga algunas pasadas sobre los bloques donde no se hacen rodajas, pero estas deben minimizarse por tiempo. Tenga las tijeras listas en caso de que las rodajas no se separen completamente de los bloques de tejido. Si esto sucede, una esquina o borde de la rebanada se pegará al bloque después de que pase la cuchilla del vibratomo. No retire la rebanada o el bloque al quitar la rebanada atascada.
  6. Coloque las placas con las rodajas en un balancín a temperatura ambiente y a 25 rpm. Deja reposar las rodajas a temperatura ambiente durante una hora. Si se van a dejar por más tiempo, coloque las rebanadas en 15 ml de medio de cultivo de rebanadas (ver Tabla suplementaria 1) en una incubadora. Incubar rodajas preparadas para estudios el mismo día a 37 °C, y cultivar rodajas que se cultivan durante la noche a 24 °C, transfiriéndolas a 37 °C al menos 1 h antes de los experimentos.
    NOTA: A largo plazo, las rodajas tienen una mejor viabilidad cuando se cultivan a 24 ° C, aunque 37 ° C está más cerca de su entorno fisiológico nativo, probablemente debido a la menor actividad de las enzimas proteasa secretadas a menor temperatura. Las rodajas de tejido pancreático de ratón y humano se cultivan a la misma temperatura y con un máximo de 15 rebanadas por plato. Sin embargo, las recetas de los medios difieren para las rebanadas humanas y de ratón. Ambas formulaciones se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. Además, el procedimiento es el mismo para generar rodajas de ratón y humanos con la excepción del páncreas de ratón que requiere inyección con agarosa para la estabilización. Las rebanadas humanas se adquieren a través del Programa de Rebanadas de Páncreas nPOD. Tanto las rodajas de ratón como las humanas tienen un grosor de 120 μm. Se puede realizar una variedad de experimentos en las rebanadas; elija paneles de tinción que funcionen mejor para experimentos planificados.

4. Preparación de rodajas para procedimientos de tinción

  1. Cultive las rodajas a 37 °C durante al menos 1 h antes de los experimentos planificados. KRBH caliente que contiene 3 mM de D-glucosa en un baño de agua de 37 °C. Transfiera 2 ml de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa en un plato de 35 mm y use un pincel para colocar suavemente la rebanada en el plato.
  2. Si la rebanada se transfiere del medio, lávela dos veces con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa. Aspire cuidadosamente el KRBH con 3 mM D-glucosa utilizando una pipeta de transferencia o pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no molestar la rebanada. Mantenga la rebanada en el plato con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa mientras se preparan los paneles de tinción.

5. Tinción de ditizone

NOTA: Aunque la ditizona se puede usar para teñir los islotes de rojo, matará la rebanada, ya que se ha encontrado que es citotóxica para los islotes17.

  1. Mida 12,5 mg de ditizona, agréguelo a 1,25 ml de dimetilsulfóxido y tome esta mezcla en una jeringa de 50 ml. Llene la jeringa a un volumen de 25 ml con Hanks Balanced Salt Solution y conecte un filtro al extremo de la jeringa. Alícuota 2 ml de KRBH con 3 mM de D-glucosa y agregue 2 gotas de la solución filtrada de ditizona de la jeringa de 50 ml en un plato de 35 mm.
  2. Con un pincel, coloque cuidadosamente una rodaja en una placa de Petri de 35 mm. Imagine la rebanada con los islotes indicados por la tinción de ditizona roja utilizando un estereomicroscopio.

6. Tinción de viabilidad

NOTA: Esta sección del protocolo describe cómo evaluar la viabilidad de la rebanada utilizando calceína-AM y azul-fluorescente SYTOX Blue (consulte la Tabla de materiales). La calceína-AM debe utilizarse a una concentración de 4 μM y SYTOX Blue a 1 μM.

  1. Alícuota 2 ml de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa, y agregue 2 μL de colorante de calceína-AM y azul SYTOX para separar las alícuotas. Vórtice las mezclas durante 5 s.
  2. Agregue 200 μL de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa y calceína-AM a cada pocillo de un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos.
    NOTA: Se pueden usar placas alternativas y / o cámaras de imágenes que no sean una cubierta de 8 pocillos.
  3. Usando un pincel, coloque cuidadosamente una rebanada en cada pocillo del plato y transfiera el plato con las rodajas a una incubadora de 37 ° C durante 20 minutos. Lave las rodajas dos veces con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa. Aspire cuidadosamente el KRBH usando una pipeta de transferencia o Pasteur, teniendo cuidado de no molestar la rebanada.
  4. Coloque la rodaja en una placa de Petri con fondo de vidrio de 35 mm que contenga 2 ml de KRBH con 3 mM de D-glucosa y 2 μL de SYTOX Blue a una concentración de 1 μL por 1 ml de solución. Cubra la rebanada con un anclaje de rebanada, asegurándose de que el lado con el arpa mire hacia abajo. Tome imágenes de la rebanada.
    NOTA: Si el anclaje de la rebanada sigue flotando, mojarlo por ambos lados con KRBH que contiene 3 mM de D-glucosa para sumergirlo en la solución. Es fundamental mantener siempre las rodajas en soluciones que contengan inhibidores de la proteasa, incluso durante la carga del colorante. Las tinciones de viabilidad utilizadas se pueden adaptar para el experimento específico o la configuración del microscopio.

7. Tinción del indicador Slice Ca2+

NOTA: Esta sección del protocolo describe cómo teñir cortes para grabaciones de Ca2+ usando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM y SYTOX Blue en cortes de ratón (consulte la Tabla de Materiales). El Oregon Green 488 BAPTA-1, AM debe usarse a una concentración de 5.6 μM y el SYTOX Blue a 1 μM. En rodajas humanas, Fluo-4-AM debe utilizarse a una concentración de 6,4 μM.

  1. Alícuota 2 mL de KRBH que contenga 3 mM D-glucosa, añadir 7 μL del Oregon Green 488 BAPTA-1, AM y vórtice la mezcla durante 5 s.
    NOTA: Para rebanadas de tejido humano, use Fluo-4-AM en lugar del Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. El Fluo-4-AM es preferible porque es más brillante cuando aumenta la concentración intracelular de Ca2+ ; sin embargo, no se carga bien en el tejido pancreático del ratón. El protocolo es el mismo descrito anteriormente para Fluo-4-AM con la excepción de que Fluo-4-AM solo necesita ser incubado durante 30 min.
  2. Agregue 200 μL de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa y el tinte a cada pocillo de un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos. Con un pincel, coloque cuidadosamente una rebanada en cada pocillo de la cubierta con cámara. Transfiera el vidrio de la cubierta con cámara con las rodajas a una incubadora de 37 °C durante 45 min.
  3. Lave las rodajas dos veces con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa. Aspire cuidadosamente el KRBH con 3 mM de D-glucosa utilizando una pipeta de transferencia o Pasteur, teniendo cuidado de no molestar la rebanada.
  4. Coloque una rebanada en una placa o cámara de imágenes con KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa y SYTOX Blue a una concentración de 1 μL por 1 ml, y cúbrala con un anclaje de rebanada, asegurándose de que el arpa mire hacia abajo. Tome imágenes de la rebanada.
    NOTA: En este protocolo, se utilizó un plato de 35 mm lleno de 2 ml de KRBH que contenía 3 mM de D-glucosa y 2 μL de SYTOX Blue. Si el anclaje de la rebanada sigue flotando, mojarlo por ambos lados con KRBH que contiene 3 mM de D-glucosa para sumergirlo en solución.

8. Grabaciones de Ca2+ de corte de ratón

NOTAS: La siguiente sección describe cómo realizar grabaciones de Ca2+ en rodajas de tejido pancreático de ratón utilizando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM y SYTOX Blue. Las imágenes se realizaron en un microscopio de barrido láser confocal (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Los láseres utilizados fueron de 405 nm para el SYTOX Blue, 488 nm para el Oregon Green 488 BAPTA-1, AM y 638 nm para la reflectancia. Se utilizó un detector HyD para el Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Se utilizaron detectores de tubo fotomultiplicador (PMT) para la reflectancia y el SYTOX Blue. El protocolo de imágenes de Ca2 + es el mismo para las rodajas de tejido pancreático humano, excepto que se utilizó Fluo-4-AM como indicador. Los niveles de potencia del láser, la ganancia y el tamaño del agujero de alfiler deben ajustarse en función de la muestra y el islote particular fotografiado. Por lo general, un agujero de alfiler de 1.5 unidades aireadas y una potencia láser del 1% son buenos puntos de partida.

  1. Al menos 1 h antes de la grabación, encienda el microscopio y equilibre la incubadora de techo o estilo jaula a 37 °C. Coloque la placa de Petri con fondo de vidrio de 35 mm que contiene la rebanada en el escenario después de quitar la tapa. Enfoque ajustando el microscopio al objetivo 10x y al modo de campo brillante. Localice los islotes usando brightfield buscando óvalos de color marrón anaranjado dentro de la rebanada.
  2. Una vez que se localice un islote probable, cambie el microscopio al modo de imagen confocal. Para confirmar los islotes por reflectancia, encienda el láser de 638 nm, ajuste la potencia del láser entre el 1% y el 2% y apague el filtro de muesca de 638 nm que normalmente eliminaría la luz retrodispersada. Establezca los límites de detección en el detector PMT a un ancho de banda de aproximadamente 20 nm centrado en alrededor de 638 nm.
    NOTA: Tenga cuidado ya que operar el microscopio en modo de reflectancia podría dañar el detector. Debido a la alta granularidad del tejido endocrino, la luz reflejada ahora se puede utilizar para localizar islotes. Los islotes aparecerán como grupos de células granulares brillantemente retrodispersadas en este canal de reflectancia.
  3. Para ver el SYTOX Blue, encienda el láser de 405 nm y el detector PMT, y ajuste la potencia del láser entre el 1% y el 2%. Centra el islote de interés en el campo de visión utilizando las perillas X e Y del controlador de escenario. Una vez que un islote de interés es localizado y confirmado por retrodispersión, cambie al objetivo 20x y amplíe para que el islote ocupe la mayor parte del marco.
  4. Tome una pila z del islote con un tamaño z-step de 1,5 μm. Encuentre la mejor sección óptica del islote donde la mayoría de las células están vivas (negativas para el SYTOX Blue) y bien cargadas con el Oregon Green 488 BAPTA-1, AM o Fluo-4-AM.
    NOTA: No es raro ver células que están sobrecargadas con una gran cantidad de tinte y que son muy brillantes. Estas pueden ser células pancreáticas moribundas en las que se puede liberar el almacenamiento de Ca2 + en el retículo endoplásmico, lo que resulta en altos niveles de carga; estas no son celdas ideales para grabar. Busque células que hayan cargado claramente el tinte, pero que no estén sobresaturando el detector para que sea visible un aumento en el brillo que ocurre cuando los niveles de Ca2+ citosólico fluctúan. La carga de colorantes de los islotes dentro de las rebanadas es variable; sin embargo, el tinte generalmente se carga bien a través de ~ 10-15 μm del islote. Sin embargo, la carga de tinte puede ser difícil de visualizar si las células están profundamente en el tejido.
  5. Para evitar que el tinte se desvanezca durante la grabación, asegúrese de que la potencia del láser en el canal de 488 nm no supere el 2%. Aumente el agujero de alfiler a 2 unidades aireadas para recoger más señal con menor potencia de excitación.
  6. Configure el microscopio para que grabe en modo XYZT. Optimice la configuración para reducir la velocidad de fotogramas a 2 s o menos por fotograma.
    NOTA: Los ajustes de configuración que se pueden realizar para ayudar a disminuir la velocidad de fotogramas incluyen activar el escaneo bidireccional, disminuir o desactivar el promedio de línea y aumentar la velocidad de escaneo.
  7. Una vez que se hayan optimizado los ajustes, registre varios minutos de actividad basal.
    NOTA: Otro buen indicador de la viabilidad del tejido es si las células aparecen activas y están parpadeando visiblemente durante este registro de la actividad basal.
  8. Agregue 100 μL de glucosa concentrada 20x y KCl en KRBH a la placa utilizando una micropipeta de 200 μL en los puntos de tiempo dados para lograr una concentración final de 16.7 mM de glucosa o 30 mM KCl.
    NOTAS: Agregue las soluciones con cuidado, teniendo cuidado de no molestar la rebanada durante la grabación. Asegúrese de no golpear la placa con la micropipeta. Es típico ver que el tejido se contrae en respuesta a estas estimulaciones. Las grabaciones de flujo de Ca2+ se procesaron y cuantificaron en ImageJ18. Utilizando el software ImageJ, la intensidad de tinción del Oregon Green 488 BAPTA-1, AM se midió en las células seleccionando manualmente las regiones de interés (ROI). La intensidad de fluorescencia de estos ROI se calculó dividiendo los valores de fluorescencia en puntos de tiempo posteriores por los valores iniciales de fluorescencia de las células (F / F0). Se puede utilizar un sistema de perfusión junto con una cámara de imágenes especializada para administrar las soluciones a las rodajas de forma dinámica en lugar de agregarlas manualmente. Las recomendaciones del sistema de perfusión y la cámara de imágenes se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

9. Tinción de células T de ratón en rodajas pancreáticas vivas

NOTA: Esta sección del protocolo describe cómo teñir las células inmunes dentro de las rodajas de ratón. La cepa de ratón utilizada es el NOD. Rag1-/-. AI4 α/β ya que este modelo desarrolla consistentemente la enfermedad con insulitis significativa. Todas las células T CD8+ de este ratón se dirigen a un epítopo de insulina, lo que permite el uso de un tetrámero de insulina-Db marcado con ficoeritrina (PE)15. El anticuerpo CD8 debe usarse a una concentración de 1:20 y el tetrámero de insulina a 1:50.

  1. Alícuota de 100 μL de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa, agregue 2 μL de tetrámero de insulina PE y 5 μL de anticuerpo CD8 de aloficocianina (APC), y vórtice la mezcla durante 5 s.
  2. Agregue 100 μL de KRBH que contenga 3 mM de D-glucosa y el tetrámero y el anticuerpo a un pocillo de un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos. Con un pincel, coloque cuidadosamente una rebanada en el pozo de la cubierta con cámara. Transfiera el vidrio de cubierta con cámara con la rebanada a una incubadora de 37 °C durante 30 min.
  3. Lave la rodaja dos veces con 2 ml de KRBH que contenga 3 ml de D-glucosa. Aspire cuidadosamente el KRBH con 3 mM de D-glucosa utilizando una pipeta de transferencia o Pasteur, teniendo cuidado de no molestar la rebanada.
  4. Coloque la rodaja en una placa de Petri con fondo de vidrio de 35 mm que contenga KRBH con 3 mM de D-glucosa y el SYTOX Blue a una concentración de 1 μL por 1 ml, y cúbrala con un anclaje de rebanada, colocando el lado con el arpa hacia abajo. Tome imágenes de la rebanada.
    NOTA: Si el anclaje de la rebanada sigue flotando, mojarlo por ambos lados con KRBH que contiene 3 mM de D-glucosa para sumergirlo en la solución. El anticuerpo diluido y el tetrámero se pueden reutilizar una vez. Después de teñir dos rebanadas, se debe hacer una mezcla fresca de anticuerpos.

10. Registro de células inmunes de ratón

NOTA: La siguiente sección describe cómo realizar registros de células inmunes en rodajas de tejido pancreático de ratón utilizando anticuerpo CD8, tetrámero de insulina PE y SYTOX Blue. La configuración de la imagen es la descrita en la sección 8. Las grabaciones se realizaron a una resolución de 800 × 800 píxeles. Los láseres utilizados fueron de 405 nm para el SYTOX Blue, 488 nm para el tetrámero de insulina y 638 nm para el anticuerpo CD8 y la reflectancia. Se utilizaron detectores HyD para el anticuerpo CD8 y el tetrámero de insulina PE. Se utilizaron detectores PMT para la reflectancia y el SYTOX Blue. El protocolo de imágenes de células inmunes es el mismo para las rebanadas de tejido pancreático humano, excepto para el uso de diferentes anticuerpos y multímeros HLA complejos con antígenos para el tejido humano. Tanto para la tinción de tetrámeros de insulina en el tejido del ratón como para la tinción del multímero HLA en el tejido humano, se debe utilizar una tinción de células inmunes para verificar la presencia de las células T específicas reactivas al antígeno. Aquí, se utilizó un anticuerpo anti-CD8. Los anticuerpos, como anti-CD3 o anti-CD4, también se pueden usar dependiendo de la población de células objetivo.

  1. Al menos 1 h antes de la grabación, encienda el microscopio y equilibre la incubadora de la parte superior del escenario a 37 ° C. Asegure la placa de Petri con fondo de vidrio de 35 mm que contiene la rebanada en el escenario. Enfoca el microscopio estableciendo el objetivo 10x en el modo de campo brillante. Localice los islotes utilizando el modo de campo brillante buscando óvalos de color marrón anaranjado dentro de la rebanada.
  2. Cambie el microscopio a imágenes confocales presionando el botón CS en el controlador de pantalla táctil del microscopio. Para ver los islotes por reflectancia, encienda el láser 638 y el detector PMT, ajuste la potencia del láser entre el 1% y el 2% y apague los filtros de muesca.
    NOTA: Debido al aumento de la granularidad del tejido endocrino, la luz reflejada ahora se puede utilizar para localizar islotes. Los islotes aparecerán como grupos de células granulares brillantes en este canal.
  3. Para ver el SYTOX Blue, el anticuerpo CD8 y el tetrámero de insulina, verifique que la potencia del láser esté entre el 1% y el 2%. Utilice los siguientes ajustes para ver cada uno de los tres: para el SYTOX Blue, encienda el láser de 405 nm y el detector PMT; para el anticuerpo CD8, encienda el detector HyD; y para ver el tetrámero de insulina, encienda el láser de 488 nm y el detector HyD.
  4. Centra el islote de interés en el campo de visión utilizando las perillas X e Y del controlador de escenario. Una vez que se encuentre un islote de interés, cambie al objetivo 20x y amplíe para que el islote ocupe la mayor parte del marco. Tome una pila z del islote con un tamaño z-step de 1,5 μm. Encuentre las mejores secciones ópticas (una serie de entre 5 y 10 secciones) del islote donde la mayoría de las células están vivas (negativas para el SYTOX Blue) y cualquier célula inmune circundante está enfocada.
    NOTA: Trate de encontrar marcos donde haya múltiples células CD8 positivas y positivas para el tetrámero de insulina que rodean o se infiltran en el islote.
  5. Configure el microscopio para que grabe en modo XYZT. Optimice la configuración para grabar una pila Z de los pasos seleccionados cada 20 minutos durante un período de varias horas.
    NOTA: Si es posible, es mejor hacer estas grabaciones en una cámara de imágenes donde se puedan controlar la temperatura y los niveles de CO2 , especialmente cuando se graba durante más de cuatro horas. En el caso de la grabación nocturna, se puede agregar un exceso de anticuerpos a los medios para compensar el ciclo del receptor de células T y el desvanecimiento del tinte. Además, se pueden usar diferentes fluoróforos para los anticuerpos de células T. Según la experiencia, los anticuerpos en el rango rojo lejano funcionan mejor para las células T.

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Resultados

Este protocolo producirá cortes de tejido pancreático vivo adecuados tanto para estudios de funcionalidad como para registros de células inmunes. La apariencia de las rebanadas tanto en el campo brillante como en la luz reflejada se muestra en la Figura 1A, B. Como se discutió, los islotes se pueden encontrar en rodajas utilizando luz reflejada debido a su mayor granularidad que se produce debido a su contenido de insulina (Figura 1C) y se o...

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Discusión

El objetivo de este protocolo es explicar la generación de lonchas de páncreas y los procedimientos necesarios para emplear las rebanadas en estudios funcionales e inmunológicos. Hay muchos beneficios al usar rebanadas pancreáticas vivas. Sin embargo, hay varios pasos críticos que son esenciales para que el tejido siga siendo viable y útil durante los protocolos de experimento descritos. Es imperativo trabajar rápidamente. El tiempo transcurrido entre la inyección del páncreas y la generación de las rebanadas e...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 y P01 AI042288. Esta investigación se realizó con el apoyo de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un proyecto colaborativo de investigación de la diabetes tipo 1 patrocinado por JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) y The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). El contenido y las opiniones expresadas son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente la opinión oficial de nPOD. Las organizaciones de obtención de órganos (OPO) que se asocian con nPOD para proporcionar recursos de investigación se enumeran en http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Gracias al Dr. Kevin Otto, de la Universidad de Florida, por proporcionar el vibratomo utilizado para generar rodajas de ratón.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Style Scalpel HandleFisherbrand12-000-163
1 M HEPESFisher ScientificBP299-100HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture DishCorning430591
10 mL Luer-Lok SyringeBD301029BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G NeedleBDBD 305109BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dishIbidi81156µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringeBD309653
8-well chambered coverglassIbidi80826µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibodyBiolegend100712
BSAFisher Scientific199898
Calcium chlorideSigmaC5670CaCl2
Calcium chloride dihydrateSigmaC7902CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital RockerThermo Fisher Scientific88880020
Confocal laser-scanning microscopeLeicaSP8Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-GlucoseSigmaG7021C6H12O6
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345Dimethyl sulfoxide
EthanolDecon Laboratories2805
Falcon 35 mm tissue culture dishCorning353001Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBSGibco10082147
Feather No. 10 Surgical BladeElectron Microscopy Sciences7204410
fluo-4-AMInvitrogenF14201cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super GlueLoctite45198
Graefe ForcepsFine Science Tools11049-10
Hardened Fine ScissorsFine Science Tools14090-09
HBSSGibco14025092Hanks Balanced Salt Solution
HEPESSigmaH4034C8H18N2O4S
Ice bucketFisherbrand03-395-150
IsofluranePatterson VeterinaryNDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog ClampRoboz Surgical StoreRS-7440 Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
KimwipesKimberly-Clark Professional34705Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitInvitrogenL3224This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEMCorning10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrateSigmaM9272MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrateSigmaM2773MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated PlatformWarner InstrumentsPM-1Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
MicrowaveGEJES1460DSWW
Nalgene Syringe FilterThermo Fisher Scientific726-2520
No.4 PaintbrushMichaels10269140
Open Diamond Bath Imaging ChamberWarner InstrumentsRC-26Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AMInvitrogenO6807cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamberOkolabH201-LG
PBSThermo Fisher Scientific20012050To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramerEmory Tetramer Research Coresequence YAIENYLEL
Penicillin StreptomycinGibco15140122
Potassium chlorideSigmaP5405KCl
Potassium phosphate monobasicSigmaP5655KH2PO4
Razor BladesElectron Microscopy Sciences71998For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640Gibco11875093
SeaPlaque low melting-point agaroseLonza50101To make agarose for slice generation
Slice anchorWarner Instruments64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)Warner Instruments640253Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonateSigmaS5761NaHCO3
Sodium chlorideSigmaS5886NaCl
Sodium phosphate monohydrateSigmaS9638NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin InhibitorSigmaT6522-1GTrypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage AdapterWarner InstrumentsSA-20MW-ALTo fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubatorOkolabH201
StereoscopeLeicaIC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell StainInvitrogenS34857blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer PipetFalcon357575Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control SystemWarner InstrumentsVCS-8System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
Water bathFisher ScientificFSGPD02Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02

Referencias

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