התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

Summary

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

Abstract

פרוסות רקמת לבלב חיות מאפשרות לחקור פיזיולוגיה ותפקוד של איון בהקשר של מיקרו-סביבה שלמה של אי. פרוסות מוכנות מרקמת לבלב אנושית ועכבר חיה המוטבעת באגרוז וחותכת באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת לרקמה לשמור על כדאיות ותפקוד בנוסף לשימור פתולוגיות הבסיסיות כגון סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D). שיטת הפרוסה מאפשרת כיוונים חדשים בחקר הלבלב באמצעות תחזוקת המבנים המורכבים ואינטראקציות בין-תאיות שונות המרכיבות את הרקמות האנדוקריניות והאקסוקריניות של הלבלב. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע כתמים ומיקרוסקופיה בזמן לשגות של תאי מערכת החיסון אנדוגני חיים בתוך פרוסות הלבלב יחד עם הערכות של פיזיולוגיה של אי. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מעודנת כדי להבחין אוכלוסיות תאי החיסון ספציפיים עבור אנטיגנים תאי אי באמצעות ריאגנטים מורכבים-multimer היסטו-תאימות גדולה.

Introduction

מעורבות הלבלב היא פתוגנומית למחלות כגון דלקת הלבלב, T1D ו- T2D1,2,3. חקר התפקוד באיים מבודדים כרוך בדרך כלל בהסרת האיים ^{מסביבתם4}. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה פותחה כדי לאפשר את חקר רקמת הלבלב תוך שמירה על מיקרו-סביבה שלמה של איונים והימנעות משימוש בהליכי בידוד איים מלחיצים5,6,7. פרוסות רקמת הלבלב מרקמת התורם האנושי שימשו בהצלחה לחקר T1D והפגינו תהליכים של אובדן תאי ביתא וחוסר תפקוד בנוסף לחדירה לתאי החיסון8,9,10,11,12,13. ניתן ליישם את שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה הן על העכבר והן על רקמת הלבלב ^{האנושית5,6,8}. פרוסות רקמת הלבלב האנושית מרקמות תורמי איברים מתקבלות באמצעות שיתוף פעולה עם הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD). פרוסות עכבר ניתן ליצור ממגוון של זני עכבר שונים.

פרוטוקול זה יתמקד ללא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null (NOD. ראג1^-/-) וקולטן תא T מהונדס (AI4) (הנהון. ראג1^-/-. AI4 ^α/β) זני עכבר. הנהון. עכברי Rag1^-/- אינם מסוגלים לפתח תאי T ו- B עקב הפרעה בגן מפעיל רקומבינציה 1 (Rag1)¹⁴. הנהון. ראג1^-/-. עכברי AI4 ^α/β משמשים כמודל לסוכרת מסוג 1 מואצת מכיוון שהם מייצרים שיבוט תא T יחיד המכוון לאפיטופ של אינסולין, וכתוצאה מכך חדירת איים עקבית והתפתחות מחלה ^מהירה15. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר נהלים למחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים באמצעות פרוסות לבלב אנושיות ועכבר חיות באמצעות יישום של גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקות המתוארות כאן כוללות הערכות כדאיות, זיהוי איון ומיקום, הקלטות ^Ca2+ ציטוטוסוליות, כמו גם כתמים וזיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון.

Protocol

הערות: כל הפרוטוקולים הניסיוניים באמצעות עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת פלורידה טיפול ושימוש בסמים הוועדה (201808642). מקטעי לבלב אנושיים מתורמי רקמות משני המינים הושגו באמצעות הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD) בנק רקמה, אוניברסיטת פלורידה. הלבלב האנושי נקצר מתורמי איברים קדוואריים על ידי ארגוני רכש איברים מוסמכים השותפים ל- nPOD בהתאם לחוקים ולתקנות לתרומת איברים וסיווגו כ"נושאים לא אנושיים " על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פלורידה (IRB) (IRB מס '392-2008), תוך ויתור על הצורך בהסכמה. רקמות nPOD המשמשות במיוחד עבור פרויקט זה אושרו כלא אנושיות על ידי אוניברסיטת פלורידה IRB (IRB20140093). המטרות של סעיפים 1-3 של פרוטוקול זה הן להסביר כיצד לנתח בהצלחה עכבר, להכין ולעבד את הלבלב, וליצור פרוסות רקמת לבלב חי. יש להכין את הפתרונות מראש, ואת המתכונים ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. הזמן הוא הגורם הקריטי ביותר במהלך שלבי פרוטוקול אלה. ברגע שהעכבר הוקרב, הכדאיות של הרקמות תתחיל לרדת. יש להשלים את כל שלושת החלקים של פרוטוקול זה במהירות האפשרית עד ליצירת כל הפרוסות הדרושות.

1. הכנה ליצירת פרוסות לבלב עכבר

1. מהדקים את הלהב על מחזיק להב הוויברטום, אך עדיין לא מחברים אותו לויברטום.
2. ממיסים 100 מ"ל של 1.25% w/v אגרוז נקודת התכה נמוכה במיקרוגל. להפעיל את המיקרוגל במרווחים של דקה אחת, ולעצור את המיקרוגל במשך 10 שניות אם תמיסת אגרוז מתחילה לרתיחה. חזור על תהליך זה עד שהאגרוז נמס, ומיוצר פתרון הומוגני. מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: ריכוז האגרוז הנמוך הוא להסביר את הצפיפות הנמוכה יותר של לבלב העכבר.
3. מלא מזרק מנעול Luer 10 מ"ל עם 3 מ"ל של אגרוז חם. התאימו מחט 27 G 25 מ"מ על המזרק. שמור את המזרק עם המחט המצורפת capped באמבט מים 37 °C עד הפתרון הוא להיות מוזרק.
   הערה: מחט 27 G הוא המועדף כפי שהוא מתאים בבטחה לתוך צינור המרה המשותף של עכברים בין 10-25 גרם במשקל הגוף ומאפשר את זרימת פתרון אגרוז צמיג מאוד. בעוד מחטים משעמם גדול יותר ניתן לבחור לשימוש, מחטים קטנות יותר (מד גדול יותר) אינם מומלצים כמו אלה עשויים להיות סתומים בקלות רבה יותר עם פתרון agarose.
4. הוסיפו 20 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית צוננת (ECS) לצלחת פטרי 10 ס"מ.
   הערה: ECS לא צריך להיות מבעבע בכל שלב.
5. מלא שתי מנות פטרי לא מטופלות בגודל 10 ס"מ עם 15 מ"ל של חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר (KRBH) המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ומעכב טריפסין סויה בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל למנה.
   הערה: לאורך פרוטוקול זה, חיוני כי כל הפתרונות המשמשים לשמירה על פרוסות מכילים מעכב טריפסין סויה כדי למנוע נזק לרקמות הנגרמות על ידי פרוטאזים העיכול הלבלב.

2. כריתת לבלב עכבר ועיבוד רקמות

הערה: הפרוטוקול לחתוך את הלבלב, עיבוד הרקמה, ויצירת פרוסות משתנה מ Marciniak et ^al5. כדי להבטיח כדאיות רקמות, למזער את משך הזמן בין הסרת הלבלב ויצירת פרוסות. כל הציוד הדרוש צריך להיות מוכן מראש ומכוון באופן שיאפשר התקדמות מהירה דרך השלבים הבאים. צינור המרה canulation והזרקה, כמו גם כריתת הלבלב מבוצעים בצורה הטובה ביותר תחת סטריאוסקופ.

1. העכבר הוא מרדים עמוק עם איזופלוראן ומוקרב על ידי נקע צוואר הרחם.
   הערה: איזופלוריין היא שיטת ההשפלה המועדפת. ריכוז של 5% איזופלוראן יש להשתמש. לדוגמה, יש להשתמש ב- 0.26 מ"ל עם תא ^{1 ליטר16}. ירידה בכדאיות רקמת הלבלב נצפתה כאשר _{נעשה שימוש בפחמן דו חמצני} .
2. לרסס את העכבר עם 70% v / v אתנול בנדיבות כדי להפחית זיהום רקמות עם פרווה במהלך הניתור והניתור. הנח את העכבר בחלק גבי כלפי מטה, כיוון גחוני כלפי מעלה עם הצד השמאלי משמאל.
3. באמצעות מספריים, לפתוח את הצפק ולהסיר את כלוב הצלעות, דואג לא לנקב את הלב או כלי השיט הסמוכים. השתמש במלקחיים כדי להפוך את הכבד לתוך חלל החזה, ולהזיז את המעיים מתוך חלל הגוף כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. השתמש מהדק בולדוג ג'ונס הופקינס כדי לאכל את האמפולה של ואטר.
4. יש לאחזר מזרק מנעול Luer 10 מ"ל טעון מראש עם 3 מ"ל של פתרון אגרוז חם מן אמבט מים 37 °C .C.
   הערה: לאחר המזרק עם agarose מוסר מאמבט המים, הזרקת הלבלב צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתקרר ומגדיר את המזרק.
5. מחזיק את המלקחיים ביד שמאל, להשתמש בהם כדי לתמוך בעדינות לייצב את צינור המרה עבור הזריקה.
6. החזק את המזרק ביד ימין, הכנס את הצד המכופע של המחט לצינור המרה. לאט ובהתמדה להזריק את הלבלב. ברגע שהזריקה מתחילה, לא ניתן לעצור את הזרימה ללא התקשות אגרוז במזרק ובלבלב.
   הערה: אמצעי האחסון בו נעשה שימוש יהיה תלוי במשקל העכבר. בהתבסס על ניסיון, מומלץ כי 1 מ"ל של פתרון agarose לשמש לכל 10 גרם של משקל גוף העכבר עם נפח מרבי של 2 מ"ל. הלבלב צריך להיראות מעט מנופח עם מבנה מוחלט יותר, אבל לא מוגזם. הזרקת יתר גורמת לאיים המופרדים מהרקמה האקסוקרינית ויש להם מראה "מפוצץ" בפרוסות.
7. מוציאים את הלבלב מלא אגרוז מהעכבר. באמצעות מלקחיים ומספריים, לחתוך את הלבלב משם, החל בבטן, נע למעיים, ומסתיים בטחול. לאחר חיתוך, בעדינות להסיר את הלבלב המוזרק עם מלקחיים, ומניחים בצלחת פטרי 10 ס"מ מלא ECS צונן.
8. השתמש במספריים כדי להסיר את השומן, רקמת החיבור, הרקמה הסיבוטית וחלקים מהלבלב שאינם מוזרקים לאגרוז.
   הערה: חלקים של הרקמה שיש להסיר לא יהיו מבנים מבוססים מאוד ייראה קצת gelatinous.
9. לאחר חיתוך הרקמה, השתמש במספריים כדי לחתוך אותו לחלקים קטנים יותר שקוטרם כ -5 מ"מ תוך השארתו שקועה תחת ECS. לחתוך את הרקמה בזהירות, דואג לא לדחוף את האגורז מתוך הרקמה.
10. הסר את חתיכות הרקמה מן ECS, ומניחים אותם על מגב שני רובדים (ראה את טבלת החומרים). מגלגלים אותם בעדינות על המגב באמצעות מלקחיים להסרת נוזלים עודפים.
11. באמצעות מלקחיים, מניחים בזהירות את חתיכות הרקמה בצלחת פטרי 35 מ"מ עם לא יותר מ 4 חתיכות לכל צלחת. מניחים את הצד השטוח ביותר של בלוק הרקמה עם הפנים כלפי מטה. לחץ בעדינות על הרקמה באמצעות מלקחיים.
    הערה: ודא שיש מקום, לפחות כמה מילימטרים, בין חתיכות הרקמה, וכי הם לא נוגעים בקצה הצלחת.
12. לאט לשפוך את 37 °C agarose לתוך המנה, דואג לא לשפוך אותו ישירות על הרקמה. יוצקים מספיק כך חתיכות הרקמה מכוסים לחלוטין. ודא שיש שכבה של אגרוז מעל חתיכות הרקמה כמו חלק זה יהיה מודבק למחזיק הדגימה.
13. מעבירים בזהירות את המנה עם חתיכות הרקמה למקרר כדי לאפשר לאגורוז להקים. ודא חתיכות הרקמה לא לזוז או להתחיל צף. אם כן, תסתגלו מחדש במהירות באמצעות מלקחיים.
    הערה: הגדרת האגורוז אמורה להימשך מספר דקות בלבד.
14. לאחר agarose יש להגדיר, להשתמש באזמל לחתוך סביב הרקמה בקווים ישרים כדי להפוך בלוקים agarose כאילו עושה רשת בין חתיכות הרקמה. הקפד להשאיר כמה מילימטרים של אגרוז סביב כל הצדדים של הרקמה.
    הערה: לא צריך להיות כל רקמה בולטת מן האגורוז. כל בלוק צריך להיות קובייה של כ 5 מ"מ x 5 מ"מ x נפח 5 מ"מ.
15. השתמש באזמל כדי להפוך את החלקים הריקים של אגרוז שנחתכו סביב קצוות הצלחת. הסר את הבלוקים עם הרקמה מן המנה על ידי הרמת אותם בזהירות עם מלקחיים.

3. יצירת פרוסות לבלב עכבר

1. באמצעות מלקחיים, מסדרים את הבלוקים על מחזיק הדגימה; מניחים אותם לצדדים, תוך התחשבות בכך שהם יופכו על דבק העל. סדר את הבלוקים כך שהם לא ישתרעו רחוק יותר מרוחב הלהב. כאשר הוויברטום נע לאט, סדר את הבלוקים כך שהלהב צריך לנוע קדימה המרחק הכי פחות אפשרי.
   הערה: שתי שורות של שלושה או ארבעה בלוקים כל אחת עם כמה מילימטרים בין השורות עובד טוב. הבלוקים באותה שורה יכולים לגעת זה בזה, אך כאשר שתי השורות נוגעות זו בזו, קשה לאחזר פרוסות כאשר הן יורדות מהבלוקים.
2. יש למרוח קו של דבק-על על מחזיק הדגימה, ולהשתמש בקצה מתקן הדבק כדי לפזר את הדבק לשכבה דקה. הפוך את בלוקי הרקמה על הדבק כך שהצד הקרוב ביותר לרקמה פונה כלפי מעלה. דוחפים בעדינות כלפי מטה על הבלוקים, ומניחים לדבק להתייבש במשך שלוש דקות.
3. חבר את מחזיק הלהב ואת הצלחת לויברטום, בדרך כלל עם בורג או מגנט, בהתאם לדגם הוויברטום. התאם את גובה הלהב ואת המרחק נסע כך הלהב נע על פני אורך הבלוקים ורק בקושי מעליהם.
   הערה: מלקחיים יכולים להיות מועילים בעת התאמת גובה הלהב. הם יכולים להיות ממוקמים על גבי בלוק הרקמה כדי לעזור למקם את הלהב קרוב ככל האפשר לראש הבלוק מבלי לגעת בבלוק.
4. ודא שהדבק התייבש על ידי דחיקת בלוקים בעדינות במלקחיים, ומלא את מגש הוויברטום ב- ECS צונן עד שהלהב מכוסה. הגדר את הוויברטום כדי להפוך פרוסות בעובי 120 מיקרומטר במהירות של 0.175 מ"מ / s, תדירות של 70 הרץ, ומשרעת של 1 מ"מ.
   הערה: ניתן להתאים את מהירות הוויברטום בהתאם לקלות חיתוך הרקמה.
5. התחל את הוויברטום, ושים לב מתי פרוסות מתחילות לרדת מבלוני הרקמה. השתמש 10 ס"מ מלקחיים גראפה או מברשת צבע מס '4 קטן כדי להסיר בזהירות את הפרוסות ברגע שהם צפים את הבלוק, ומניחים אותם לוחות 10 ס"מ עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז מעכב טריפסין. מרימים את הפרוסות על ידי הנחת מברשת צבע או מלקחיים מתחתם והרמת הפרוסות בעדינות. אין לדגור יותר מ-15 פרוסות יחד בצלחת אחת.
   הערה: זה נורמלי עבור רטט יש כמה עובר מעל הבלוקים שבו אין פרוסות נעשות, אבל אלה צריכים להיות ממוזערים לזמן. יש מספריים מוכנים במקרה הפרוסות לא נפרדים לחלוטין בלוקים רקמה. במקרה כזה, פינה או קצה של הפרוסה יהיו תקועים לבלוק לאחר שהלהב הוויברטום יעבור. אין לשלוף את הפרוסה או החסימה בעת הסרת הפרוסה התקועה.
6. מניחים את הצלחות עם הפרוסות על נדנדה בטמפרטורת החדר וב-25 סל"ד. תן לפרוסות לנוח בטמפרטורת החדר במשך שעה. אם הם הולכים להישאר יותר זמן, למקם את הפרוסות 15 מ"ל של פרוסה תרבות בינונית (ראה טבלה משלימה 1) באינקובטור. פרוסות דגירה שהוכנו ללימודים באותו יום ב 37 °C (50 °F), ופרוסות תרבות כי הם מתורבתים לילה ב 24 °C (77 °F), העברתם ל 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניסויים.
   הערה: בטווח הארוך, הפרוסות יש כדאיות טובה יותר כאשר תרבית ב 24 °C (50 °F), אם כי 37 °C (37 °F) קרוב יותר לסביבה הפיזיולוגית הטבעית שלהם, כנראה בשל הפעילות הנמוכה יותר של אנזימי פרוטאז מופרש בטמפרטורה נמוכה יותר. פרוסות עכבר ורקמת לבלב אנושית הן בתרבית באותה טמפרטורה ועם מקסימום של 15 פרוסות למנה. עם זאת, מתכוני המדיה שונים עבור פרוסות אדם ועכבר. שני הניסוחים מפורטים בטבלה משלימה 1. בנוסף, ההליך זהה ליצירת פרוסות עכבר ואדם למעט לבלב העכבר הדורש הזרקה עם אגרוז לייצוב. פרוסות אנושיות נרכשות באמצעות תוכנית פרוסת הלבלב nPOD. גם עכבר וגם פרוסות אנושיות הם בעובי 120 מיקרומטר. מגוון ניסויים ניתן לבצע על הפרוסות; בחרו לוחות כתמים הפועלים בצורה הטובה ביותר לניסויים מתוכננים.

4. פרוסת הכנה להליכי הכתמים

1. תרבות הפרוסות ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעה לפני הניסויים המתוכננים. KRBH חם המכיל 3 mM D-גלוקוז באמבט מים 37 °C.C. מעבירים 2 מ"ל של KRBH המכיל 3m D-גלוקוז בצלחת 35 מ"מ, ולהשתמש במכחול כדי למקם בעדינות את הפרוסה בצלחת.
2. אם הפרוסה מועברת מבינונית, יש לשטוף אותה פעמיים עם KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות פיפטה העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה. שמור את הפרוסה בצלחת עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז בזמן לוחות הכתמים מוכנים.

5. כתמי Dithizone

הערה: למרות dithizone יכול לשמש כדי להכתים את האיים אדום, זה יהרוג את הפרוסה כפי שהוא נמצא להיות ציטוטוקסי ^לאיים17.

1. למדוד 12.5 מ ג של dithizone, להוסיף אותו 1.25 מ"ל של דימתילסולפוקס, ולקחת את התערובת הזאת במזרק 50 מ"ל. מלאו את המזרק לנפח של 25 מ"ל באמצעות תמיסת מלח מאוזנת של Hanks, וצרפו מסנן לסוף המזרק. Aliquot 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז, ולהוסיף 2 טיפות של פתרון dithizone מסונן מן המזרק 50 מ"ל לתוך צלחת 35 מ"מ.
2. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ. דמיין את הפרוסה עם האיים המצוינים על ידי כתמי dithizone אדומים באמצעות סטריאומיקוסקופ.

6. מכתים את הכדאיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להעריך את הכדאיות של פרוסה באמצעות calcein-AM וכחול SYTOX כחול-פלואורסצנטי (ראה טבלת החומרים). Calcein-AM צריך לשמש בריכוז של 4 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר.

1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, ולהוסיף 2 μL של צבע calcein-AM ו SYTOX כחול כדי להפריד aliquots. מערבולת התערובות עבור 5 s.
2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3 מ"מ של גלוקוז D וצבע קלצ'ין-AM לכל באר של משקפת עם 8 תאים טובים.
   הערה: ניתן להשתמש בלוחות חלופיים ו/או בתאי הדמיה שאינם משקפת עם 8 בארות.
3. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של הצלחת, ומעבירים את הצלחת עם הפרוסות לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ בתחתית תחתית המכילה 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז ו 2 μL של כחול SYTOX בריכוז של 1 μL לכל 1 מ"ל של פתרון. מכסים את הפרוסה בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
   הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. זה קריטי תמיד לשמור על הפרוסות בפתרונות המכילים מעכב פרוטאז, גם במהלך טעינת צבע. כתמי הכדאיות המשמשים יכולים להיות מותאמים לניסוי ספציפי או להגדרת מיקרוסקופ.

7. כתמי מחוון פרוסה ^Ca2+

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים פרוסות עבור הקלטות ^Ca2+ באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו- SYTOX כחול בפרוסות עכבר (ראה טבלת החומרים). אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM צריך לשמש בריכוז של 5.6 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר. בפרוסות אנושיות, פלואו-4-AM צריך לשמש בריכוז של 6.4 מיקרומטר.

1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 7 μL של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ומערבולת התערובת עבור 5 s.
   הערה: לפרוסות רקמה אנושית, השתמש פלו-4-AM במקום אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. פלו-4-AM עדיף כי הוא בהיר יותר כאשר ריכוז ^{Ca2 +} תאיים עולה; עם זאת, זה לא לטעון היטב ברקמת הלבלב העכבר. הפרוטוקול זהה למתואר לעיל עבור Fluo-4-AM למעט כי פלואו-4-AM רק צריך להיות דגירה במשך 30 דקות.
2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3mM D-גלוקוז וצבע לכל באר של 6 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
3. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
4. מניחים פרוסה בצלחת הדמיה או בתא עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז ו- SYTOX Blue בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
   הערה: בפרוטוקול זה, צלחת 35 מ"מ מלא 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D גלוקוז ו 2 μL של SYTOX כחול שימש. אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה.

8. פרוסת עכבר ^Ca2+ הקלטות

הערות: החלק הבא מתאר כיצד לבצע ^{Ca2 +} הקלטות על פרוסות רקמת הלבלב העכבר באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו SYTOX כחול. ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים). הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור כחול SYTOX, 488 ננומטר עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM, ו 638 ננומטר עבור רפלקציה. גלאי HyD שימש עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. גלאי שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) שימשו להשתקפויות ולכחול SYTOX. פרוטוקול ההדמיה ^Ca2+ זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית, למעט העובדה ש- Fluo-4-AM שימש כאינדיקטור. יש להתאים את רמות הכוח, הרווח וגודל חור הסיכה של הלייזר בהתבסס על המדגם ועל האי המסוים. בדרך כלל, חור סיכה של 1.5 יחידות אוורירית וכוח לייזר של 1% הם נקודות התחלה טובות.

1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה על הבמה או בסגנון הכלוב ל-37 מעלות צלזיוס. מניחים את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה לאחר הסרת המכסה. התמקד על-ידי הגדרת המיקרוסקופ למטרה 10x ולמצב Brightfield. אתר איים באמצעות brightfield על ידי חיפוש אליפסות כתומות-חומות בתוך הפרוסה.
2. לאחר איתור אי סביר, החלף את המיקרוסקופ למצב הדמיה קונפוקלית. כדי לאשר איונים על ידי רפלקטיביות, להפעיל את לייזר 638 ננומטר, להגדיר את כוח הלייזר בין 1% ו 2%, ולכבות את מסנן חריץ 638 ננומטר כי בדרך כלל להסיר אור backscattered. הגדר את מגבלות הזיהוי בגלאי PMT לרוחב פס של כ-20 ננומטר המרוכז סביב 638 ננומטר.
   הערה: היזהר מכיוון שהפעלת המיקרוסקופ במצב רפלקטיביות עלולה להזיק לגלאי. בשל הגרגריות הגבוהה של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול לשמש כעת כדי לאתר איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים פרטניים בעלי תותים בערוץ רפלקטיביות זה.
3. כדי להציג את SYTOX Blue, הדליקו את גלאי הלייזר וה-PMT של 405 ננומטר והגדירו את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. ברגע שאי עניין ממוקם ומאושר על ידי backscatter, עבור למטרה 20x, להתקרב כך האי תופס את רוב המסגרת.
4. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלק האופטי הטוב ביותר של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וטעון היטב עם אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM או Fluo-4-AM.
   הערה: אין זה יוצא דופן לראות תאים עמוסים בכמות גדולה של צבע והם בהירים מאוד. אלה עשויים להיות תאי לבלב גוסס שבו ^{Ca2 +} אחסון ברטיקולום אנדופלסמי עשוי להשתחרר, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של טעינה; אלה אינם תאים אידיאליים להקלדת. חפשו תאים שטענו בבירור את הצבע, אך אינם רוויים יתר על המידה את הגלאי כך שניתן לראות עלייה בבהירות המתרחשת כאשר רמות ^Ca2+ ציטוטוסוליות משתנות. טעינת צבע של איונים בתוך פרוסות משתנה; עם זאת, הצבע בדרך כלל נטען היטב דרך ~ 10-15 מיקרומטר של האי. עם זאת, טעינת צבע יכול להיות קשה לדמיין אם התאים עמוק ברקמה.
5. כדי למנוע דהייה של צבע במהלך ההקלטה, ודא כי כוח הלייזר בערוץ 488 ננומטר אינו עולה על 2%. הגדל את חור הסיכה ל-2 יחידות אוורירית כדי לאסוף יותר אות עם כוח עירור נמוך יותר.
6. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להפחית את קצב הפריימים ל-2 s או פחות לכל מסגרת.
   הערה: התאמות הגדרות שניתן לבצע כדי לסייע בהקטנת קצב הפריימים כוללות הפעלת סריקה דו-כיוונית, הקטנה או כיבוי של ממוצע הקו והגברת מהירות הסריקה.
7. לאחר מיטוב ההגדרות, הקלט מספר דקות של פעילות בזלית.
   הערה: אינדיקטור טוב נוסף של הכדאיות רקמה הוא אם התאים נראים פעילים והם מהבהבים בעליל במהלך הקלטה זו של פעילות בזאלית.
8. הוסף 100 μL של גלוקוז מרוכז 20x ו KCl ב KRBH לצלחת באמצעות 200 מיקרופיפט μL בנקודות הזמן נתון כדי להשיג ריכוז סופי של גלוקוז 16.7 mM או 30 mM KCl.
   הערות: הוסף את הפתרונות בקפידה, תוך הקפדה לא להפריע לפרוסה במהלך ההקלטה. הקפד לא להקפיץ את הצלחת עם micropipette. זה אופייני לראות את הרקמה מתכווצת בתגובה לגירויים אלה. הקלטות שטף ^Ca2+ עובדו וכומתו ב- ^ImageJ18. באמצעות תוכנת ImageJ, עוצמת הכתמים של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM נמדד בתאים על ידי בחירה ידנית של אזורים של עניין (ROIs). עוצמת הפלואורסצנטיות של ROIs אלה חושבה על ידי חלוקת ערכי הפלואורסצנטיות בנקודות זמן מאוחרות יותר על ידי ערכי הפלואורסצנטיות הראשוניים של התאים (F/_F0). ניתן להשתמש במערכת זלוף יחד עם תא הדמיה מיוחד כדי לנהל את הפתרונות לפרוסות באופן דינמי לעומת הוספתן באופן ידני. מערכת זלוף והמלצות לתא הדמיה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

9. הכתמת תאי עכבר T בפרוסות לבלב חיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים תאי מערכת החיסון בתוך פרוסות עכבר. זן העכבר המשמש הוא הנהון. ראג1^-/-. AI4 ^α/β כמו מודל זה מפתחת באופן עקבי מחלה עם אינסוליטיס משמעותית. תאי CD8⁺ T בעכבר זה כולם מכוונים לאפיטופ של אינסולין, המאפשר שימוש ב- phycoerythrin (PE) שכותרתו טטרמר אינסולין-Db15. יש להשתמש בנוגדן CD8 בריכוז של 1: 20 וטטרמר האינסולין בשעה 1: 50.

1. Aliquot 100 μL של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 2 μL של טטרמר אינסולין PE ו 5 μL של נוגדן CD8 אלופיקוציאנין (APC), ומערבולת התערובת עבור 5 s.
2. הוסיפו 100 מיקרו-אל של KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ואת הטטרמר והנוגדן לבאר של 8 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בבאר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. לשטוף את הפרוסה פעמיים עם 2 מ"ל KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי באורך 35 מ"מ עם תחתית 35 מ"מ המכילה KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז וכחול SYTOX בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומניחים את הצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
   הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. ניתן לעשות שימוש חוזר בנוגדן ובטטמר מדולל פעם אחת. לאחר הכתמת שתי פרוסות, יש לבצע תערובת נוגדנים טרייה.

10. הקלטה של תאי מערכת החיסון של העכבר

הערה: הסעיף הבא מתאר כיצד לבצע הקלטות של תאי מערכת החיסון על פרוסות רקמת הלבלב של העכבר באמצעות נוגדן CD8, טטרמר אינסולין PE, וכחול SYTOX. כיוונון ההדמיה הוא כמתואר בסעיף 8. ההקלטות נעשו ברזולוציה של 800 × 800 פיקסלים. הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור SYTOX כחול, 488 ננומטר עבור טטרמר אינסולין, ו 638 ננומטר עבור נוגדן CD8 רפלקטיביות. גלאי HyD שימשו לנוגדן CD8 וטטרמר אינסולין PE. גלאי PMT שימשו עבור רפלקציה וכחול SYTOX. פרוטוקול הדמיית תאי החיסון זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית למעט שימוש בנוגדנים שונים ומולטי-מולטימרים HLA מורכבים אנטיגן לרקמה אנושית. הן עבור כתמי טטרמר אינסולין ברקמת העכבר והן עבור כתמים HLA-multimer ברקמה האנושית, יש להשתמש בכתם משותף של תאי מערכת החיסון כדי לאמת את נוכחותם של תאי T אנטיגן ספציפיים תגובתי. כאן נעשה שימוש בנוגדן נגד CD8. נוגדנים, כגון אנטי-CD3 או אנטי-CD4, יכולים לשמש גם בהתאם לאוכלוסיית תאי היעד.

1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה העליונה ל-37 מעלות צלזיוס. אבטחו את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה. מקד את המיקרוסקופ על-ידי הגדרת המטרה 10x במצב Brightfield. אתר את האיים באמצעות מצב Brightfield על-ידי חיפוש אליפסות בצבע חום כתום בתוך הפרוסה.
2. החלף את המיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית על-ידי לחיצה על לחצן CS בבקר מסך המגע של המיקרוסקופ. כדי להציג איונים לפי רפלקטיביות, הפעל את גלאי הלייזר וה-PMT 638, הגדר את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%, וכבה את מסנני החרוזים.
   הערה: בשל הגרגריות המוגברת של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול כעת לשמש לאיתור איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים גרגירים בהירים בערוץ זה.
3. כדי לצפות ב- SYTOX Blue, נוגדן CD8 וטטרמר אינסולין, בדוק שכוח הלייזר הוא בין 1% ל-2%. השתמש בהגדרות הבאות כדי להציג כל אחת מהשלושה: עבור SYTOX Blue, הפעל את לייזר 405 ננומטר וגלאי PMT; עבור נוגדן CD8, הפעל את גלאי HyD; ולצפייה בטטרמר האינסולין, הפעל את הלייזר 488 ננומטר וגלאי HyD.
4. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. לאחר איתור אי עניין, עבור למטרה 20x והגדל את התצוגה כך שהאי תופס את רוב המסגרת. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלקים האופטיים הטובים ביותר (סדרה של בין 5 ל -10 חלקים) של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וכל תאי החיסון שמסביב נמצאים בפוקוס.
   הערה: נסו למצוא מסגרות שבהן יש מספר תאים חיוביים ל-CD8 ואינסולין הסובבים או חודרים לאי.
5. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להקליט ערימת Z של השלבים שנבחרו כל 20 דקות על-פני תקופה של מספר שעות.
   הערה: אם אפשר, עדיף לעשות הקלטות אלה בתא הדמיה שבו ניתן לשלוט בטמפרטורה וברמות _CO2 , במיוחד בעת הקלטה במשך יותר מארבע שעות. במקרה של הקלטה בן לילה, נוגדן עודף ניתן להוסיף לתקשורת כדי לפצות על רכיבה על אופניים קולטן תא T ודעכת צבע. בנוסף, פלואורופורים שונים יכולים לשמש נוגדני תאי T. בהתבסס על ניסיון, נוגדנים בטווח האדום הרחוק פועלים בצורה הטובה ביותר עבור תאי T.

תוצאות

פרוטוקול זה יניב פרוסות רקמת לבלב חיות המתאימות הן למחקרי פונקציונליות והן להקלטות תאי מערכת החיסון. מראה פרוסה הן בבהירות והן באור משתקף מוצג באיור 1A,B. כפי שנדון, איונים ניתן למצוא בפרוסות באמצעות אור משתקף בשל הגרגריות המוגברת שלהם המתרחשת בגלל תוכן האינסולין ?...

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את הדור של פרוסות הלבלב ואת ההליכים הדרושים כדי להעסיק את הפרוסות במחקרים פונקציונליים ואימוניולוגיים. ישנם יתרונות רבים לשימוש בפרוסות לבלב חיות. עם זאת, ישנם מספר צעדים קריטיים החיוניים עבור הרקמה להישאר קיימא ושימושי במהלך פרוטוקולי הניסוי המתוארים. זה הכר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Handle	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish	Corning	430591
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	301029	BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle	BD	BD 305109	BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe	BD	309653
8-well chambered coverglass	Ibidi	80826	µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Calcium chloride	Sigma	C5670	CaCl2
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Confocal laser-scanning microscope	Leica	SP8	Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm tissue culture dish	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Ice bucket	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform	Warner Instruments	PM-1	Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave	GE	JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Paintbrush	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26	Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer	Emory Tetramer Research Core	sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Potassium chloride	Sigma	P5405	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque low melting-point agarose	Lonza	50101	To make agarose for slice generation
Slice anchor	Warner Instruments	64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)	Warner Instruments	640253	Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma	S5886	NaCl
Sodium phosphate monohydrate	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter	Warner Instruments	SA-20MW-AL	To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator	Okolab	H201
Stereoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet	Falcon	357575	Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System	Warner Instruments	VCS-8	System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02