Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

Résumé

Cette étude présente l’application de tranches de tissu pancréatique vivant à l’étude de la physiologie des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires.

Résumé

Les tranches de tissu pancréatique vivant permettent d’étudier la physiologie et la fonction des îlots dans le contexte d’un microenvironnement intact des îlots. Les tranches sont préparées à partir de tissu pancréatique humain et souris vivant incorporé dans l’agarose et coupées à l’aide d’un vibratome. Cette méthode permet au tissu de maintenir sa viabilité et sa fonction en plus de préserver les pathologies sous-jacentes telles que le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). La méthode des tranches permet de nouvelles directions dans l’étude du pancréas grâce au maintien des structures complexes et des diverses interactions intercellulaires qui composent les tissus endocriniens et exocrines du pancréas. Ce protocole montre comment effectuer la coloration et la microscopie en accéléré de cellules immunitaires endogènes vivantes dans des tranches pancréatiques ainsi que des évaluations de la physiologie des îlots. De plus, cette approche peut être affinée pour discerner les populations de cellules immunitaires spécifiques aux antigènes des cellules des îlots à l’aide de réactifs complexes-multimères d’histocompatibilité majeurs.

Introduction

L’implication du pancréas est pathognomonique à des maladies telles que la pancréatite, le DT1 et le DT21,2,3. L’étude de la fonction dans les îlots isolés implique généralement l’élimination des îlots de leur ^{environnement4}. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant a été développée pour permettre l’étude du tissu pancréatique tout en maintenant des microenvironnements intacts des îlots et en évitant l’utilisation de procédures stressantes d’isolement des îlots5,6,7. Des tranches de tissu pancréatique provenant de tissus de donneurs humains ont été utilisées avec succès pour étudier le DT1 et ont démontré des processus de perte et de dysfonctionnement des cellules bêta en plus de l’infiltration de cellules immunitaires8,9,10,11,12,13. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant peut être appliquée à la fois au tissu pancréatique de la souris et du tissu pancréatique ^humain5,6,8. Les tranches de tissu pancréatique humain provenant de tissus de donneurs d’organes sont obtenues grâce à une collaboration avec le Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD). Les tranches de souris peuvent être générées à partir d’une variété de souches de souris différentes.

Ce protocole se concentrera sur la recombinaison diabétique non obèse activant le gène 1-null (NOD. Rag1^-/-) et récepteur transgénique des lymphocytes T (AI4) (NOD. Chiffon1^-/-. Souches de souris AI4 ^α/β). HOCHER. Les souris Rag1^-/- sont incapables de développer des lymphocytes T et B en raison d’une perturbation du gène 1 (Rag1)¹⁴ activant la recombinaison. HOCHER. Chiffon1^-/-. Les souris AI4 ^α/β sont utilisées comme modèle pour le diabète de type 1 accéléré parce qu’elles produisent un clone de lymphocytes T unique qui cible un épitope d’insuline, ce qui entraîne une infiltration constante des îlots et un développement rapide de la ^maladie15. Le protocole présenté ici décrit les procédures pour les études fonctionnelles et immunologiques utilisant des tranches pancréatiques humaines et de souris vivantes grâce à l’application d’approches de microscopie confocale. Les techniques décrites ici comprennent les évaluations de la viabilité, l’identification et la localisation des îlots, les enregistrements cytosoliques de ^Ca2+ , ainsi que la coloration et l’identification des populations de cellules immunitaires.

Protocole

NOTES: Tous les protocoles expérimentaux utilisant des souris ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride (201808642). Des coupes pancréatiques humaines de donneurs de tissus des deux sexes ont été obtenues via la banque de tissus Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) de l’Université de Floride. Le pancréas humain a été prélevé sur des donneurs d’organes cadavériques par des organisations d’approvisionnement en organes certifiées en partenariat avec nPOD conformément aux lois et règlements sur le don d’organes et classé comme « sujets non humains » par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Floride (IRB) (IRB n° 392-2008), renonçant à la nécessité du consentement. Les tissus nPOD spécifiquement utilisés pour ce projet ont été approuvés comme non humains par l’IRB de l’Université de Floride (IRB20140093). Les objectifs des sections 1 à 3 de ce protocole sont d’expliquer comment disséquer avec succès une souris, préparer et traiter le pancréas et générer des tranches de tissu pancréatique vivantes. Les solutions doivent être préparées à l’avance et les recettes se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Le temps est le facteur le plus critique au cours de ces étapes du protocole. Une fois que la souris a été sacrifiée, la viabilité des tissus commencera à décliner. Les trois parties de ce protocole doivent être complétées le plus rapidement possible jusqu’à ce que toutes les tranches nécessaires soient générées.

1. Préparation pour la génération de tranches de pancréas de souris

1. Serrez la lame sur le support de lame du vibratome, mais ne l’attachez pas encore au vibratome.
2. Faire fondre 100 mL de 1,25 % p/v d’agarose à faible point de fusion dans un four à micro-ondes. Faites fonctionner le micro-ondes à intervalles de 1 minute et arrêtez le micro-ondes pendant 10 secondes si la solution d’agarose commence à bouillir. Répétez ce processus jusqu’à ce que l’agarose soit fondue et qu’une solution homogène soit produite. Placez la bouteille dans un bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE: La faible concentration d’agarose est à expliquer la densité plus faible du pancréas de la souris.
3. Remplissez une seringue Luer lock de 10 mL avec 3 mL d’agarose chaude. Placez une aiguille de 27 G 25 mm sur la seringue. Conservez la seringue avec l’aiguille attachée dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que la solution soit injectée.
   REMARQUE: Une aiguille de 27 G est préférée car elle s’insère solidement dans le canal biliaire commun des souris entre 10 et 25 g de poids corporel et permet l’écoulement de la solution d’agarose très visqueuse. Bien que des aiguilles de plus gros calibre puissent être choisies pour l’utilisation, les aiguilles plus petites (de plus grande taille) ne sont pas recommandées car elles peuvent être plus facilement obstruées avec la solution d’agarose.
4. Ajouter 20 mL de solution extracellulaire réfrigérée (SEC) dans une boîte de Petri de 10 cm.
   REMARQUE: L’ECS n’a pas besoin d’être bulle à aucun moment.
5. Remplir deux boîtes de Petri non traitées de 10 cm avec 15 mL de tampon bicarbonate de Krebs-Ringer (KRBH) contenant 3 mM de D-glucose et d’inhibiteur de la trypsine de soja à une concentration de 0,1 mg/mL par plat.
   REMARQUE: Tout au long de ce protocole, il est essentiel que toutes les solutions utilisées pour maintenir les tranches contiennent un inhibiteur de la trypsine de soja pour prévenir les dommages tissulaires causés par les protéases digestives pancréatiques.

2. Excision du pancréas de souris et traitement des tissus

REMARQUE: Le protocole d’excise du pancréas, de traitement des tissus et de génération de tranches est modifié à partir de Marciniak et ^al5. Pour assurer la viabilité des tissus, minimisez le temps entre l’ablation du pancréas et la génération de tranches. Tout l’équipement nécessaire doit être préparé à l’avance et orienté de manière à permettre une progression rapide à travers les étapes ci-dessous. La canulation et l’injection des voies biliaires ainsi que l’excision du pancréas sont mieux effectuées sous un stéréoscope.

1. La souris est profondément anesthésiée avec de l’isoflurane et sacrifiée par la luxation cervicale.
   REMARQUE: L’isoflurane est la méthode d’anesthésie préférée. Une concentration de 5% d’isoflurane doit être utilisée. Par exemple, 0,26 mL doit être utilisé avec une chambre de 1 ^L16. Une diminution de la viabilité du tissu pancréatique a été observée lorsque le _CO2 a été utilisé.
2. Vaporiser généreusement la souris avec de l’éthanol à 70% v/v pour réduire la contamination des tissus par la fourrure pendant la dissection et l’excision. Placez la souris dans une orientation dorsale vers le bas, ventrale vers le haut avec la face antérieure vers la gauche.
3. À l’aide de ciseaux, ouvrez le péritoine et retirez la cage thoracique en prenant soin de ne pas percer le cœur ou les vaisseaux adjacents. Utilisez des pinces pour retourner le foie dans la cavité thoracique et pour déplacer les intestins hors de la cavité corporelle pour exposer le canal biliaire commun. Utilisez une pince de bouledogue Johns Hopkins pour obstruer l’ampoule de Vater.
4. Récupérez une seringue Luer lock de 10 mL préchargée avec 3 mL de solution d’agarose chaude du bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE: Une fois que la seringue contenant l’agarose est retirée du bain-marie, l’injection de pancréas doit être effectuée rapidement avant que l’agarose ne refroidisse et ne se dépose dans la seringue.
5. En tenant les pinces dans la main gauche, utilisez-les pour soutenir et stabiliser doucement le canal biliaire pour l’injection.
6. Tenez la seringue dans la main droite, insérez l’aiguille côté biseau dans le canal biliaire. Injecter lentement et régulièrement le pancréas. Une fois l’injection commencée, le flux ne peut pas être arrêté sans que l’agarose ne durcisse dans la seringue et dans le pancréas.
   REMARQUE: Le volume utilisé dépendra du poids de la souris. Sur la base de l’expérience, il est recommandé d’utiliser 1 mL de solution d’agarose par 10 g de poids corporel de souris avec un volume maximum de 2 mL. Le pancréas doit avoir l’air légèrement gonflé avec une structure plus définitive, mais pas trop étendu. La sur-injection entraîne des îlots qui se séparent du tissu exocrine et qui ont un aspect « soufflé » dans les tranches.
7. Excisez le pancréas rempli d’agarose de la souris. À l’aide de pinces et de ciseaux, coupez le pancréas, en commençant par l’estomac, en se déplaçant vers les intestins et en terminant par la rate. Une fois coupé, retirez doucement le pancréas injecté avec une pince et placez-le dans une boîte de Petri de 10 cm remplie de SEC réfrigéré.
8. Utilisez des ciseaux pour enlever l’adipeux, le tissu conjonctif, le tissu fibrotique et les parties du pancréas qui ne sont pas injectées avec de l’agarose.
   REMARQUE: Les parties du tissu qui doivent être enlevées n’auront pas de structures fortement établies et apparaîtront quelque peu gélatineuses.
9. Après avoir coupé le tissu, utilisez des ciseaux pour le couper en sections plus petites d’environ 5 mm de diamètre tout en le laissant immergé sous le SEC. Coupez le tissu avec précaution, en prenant soin de ne pas pousser l’agarose hors du tissu.
10. Retirez les morceaux de tissu du SEC et placez-les sur un essuie-glace à deux couches (voir le tableau des matériaux). Roulez-les doucement sur l’essuie-glace à l’aide d’une pince pour éliminer l’excès de liquide.
11. À l’aide d’une pince, placez soigneusement les morceaux de tissu dans une boîte de Petri de 35 mm avec pas plus de 4 pièces par plaque. Placez le côté le plus plat du bloc de tissu vers le bas. Appuyez doucement sur le tissu à l’aide d’une pince.
    REMARQUE: Assurez-vous qu’il y a de l’espace, au moins quelques millimètres, entre les morceaux de tissu et qu’ils ne touchent pas le bord de la plaque.
12. Versez lentement l’agarose à 37 °C dans le plat, en prenant soin de ne pas le verser directement sur le tissu. Versez suffisamment pour que les morceaux de tissu soient complètement recouverts. Assurez-vous qu’il y a une couche d’agarose au-dessus des morceaux de tissu car cette partie sera collée au porte-spécimen.
13. Transférer soigneusement le plat avec les morceaux de tissu dans un réfrigérateur pour permettre à l’agarose de se fixer. Assurez-vous que les morceaux de tissu ne se déplacent pas ou ne commencent pas à flotter. Si c’est le cas, réajustez-les rapidement à l’aide de pinces.
    REMARQUE: La prise de l’agarose ne devrait prendre que quelques minutes.
14. Une fois que l’agarose a pris, utilisez un scalpel pour couper autour du tissu en lignes droites pour faire des blocs d’agarose comme s’il faisait une grille entre les morceaux de tissu. Assurez-vous de laisser quelques millimètres d’agarose entourant tous les côtés du tissu.
    REMARQUE: Il ne devrait pas y avoir de tissu dépassant de l’agarose. Chaque bloc doit être un cube d’environ 5 mm x 5 mm x 5 mm de volume.
15. Utilisez le scalpel pour retourner les sections vides d’agarose qui ont été coupées autour des bords de la plaque. Retirez les blocs avec le tissu du plat en les soulevant soigneusement avec une pince.

3. Génération de tranches pancréatiques de souris

1. À l’aide de pinces, disposer les blocs sur le porte-spécimen; placez-les latéralement, en gardant à l’esprit qu’ils seront retournés sur la super colle. Disposez les blocs de manière à ce qu’ils ne s’étendent pas au-delà de la largeur de la lame. Comme le vibratome se déplace lentement, disposez les blocs de manière à ce que la lame doive avancer le moins de distance possible.
   REMARQUE: Deux rangées de trois ou quatre blocs chacune avec quelques millimètres entre les rangées fonctionnent bien. Les blocs d’une même ligne peuvent se toucher, mais lorsque les deux lignes se touchent, il peut être difficile de récupérer des tranches lorsqu’elles se détachent des blocs.
2. Appliquez une ligne de super colle sur le porte-échantillon et utilisez l’extrémité du distributeur de colle pour étaler la colle en une fine couche. Retournez les blocs de tissu sur la colle de sorte que le côté le plus proche du tissu soit orienté vers le haut. Appuyez doucement sur les blocs et laissez la colle sécher pendant trois minutes.
3. Fixez le support de lame et la plaque au vibratome, généralement avec une vis ou un aimant, selon le modèle de vibratome. Ajustez la hauteur de la lame et la distance parcourue de sorte que la lame se déplace sur la longueur des blocs et à peine au-dessus d’eux.
   REMARQUE: Les pinces peuvent être utiles lors du réglage de la hauteur de la lame. Ils peuvent être placés sur le dessus du bloc de tissu pour aider à placer la lame aussi près que possible du haut du bloc sans toucher le bloc.
4. Assurez-vous que la colle a séché en poussant doucement les blocs avec des pinces et remplissez le plateau de vibratome avec du SEC réfrigéré jusqu’à ce que la lame soit recouverte. Réglez le vibratome pour faire des tranches de 120 μm d’épaisseur à une vitesse de 0,175 mm/s, une fréquence de 70 Hz et une amplitude de 1 mm.
   REMARQUE: La vitesse du vibratome peut être ajustée en fonction de la facilité de coupe du tissu.
5. Démarrez le vibratome et surveillez le moment où les tranches commencent à se détacher des blocs de tissus. Utilisez une pince Graefe de 10 cm ou un petit pinceau n ° 4 pour retirer soigneusement les tranches une fois qu’elles flottent hors du bloc, et placez-les dans des plaques de 10 cm avec KRBH contenant 3 mM de D-glucose et un inhibiteur de la trypsine. Ramassez les tranches en plaçant un pinceau ou une pince en dessous d’elles et soulevez doucement les tranches. Ne pas incuber plus de 15 tranches ensemble dans une seule assiette.
   REMARQUE: Il est normal que le vibratome ait quelques passages sur les blocs où aucune tranche n’est faite, mais ceux-ci doivent être minimisés pendant le temps. Préparez des ciseaux au cas où les tranches ne se sépareraient pas complètement des blocs de tissu. Si cela se produit, un coin ou un bord de la tranche sera collé au bloc après le passage de la lame du vibratome. Ne retirez pas la tranche ou le bloc lorsque vous retirez la tranche coincée.
6. Placez les plaques avec les tranches sur une bascule à température ambiante et à 25 tr/min. Laissez les tranches reposer à température ambiante pendant une heure. S’ils doivent être laissés plus longtemps, placez les tranches dans 15 mL de milieu de culture en tranches (voir le tableau supplémentaire 1) dans un incubateur. Incuber des tranches préparées pour des études le jour même à 37 °C et des tranches de culture qui sont cultivées pendant la nuit à 24 °C, en les transférant à 37 °C au moins 1 h avant les expériences.
   REMARQUE: À long terme, les tranches ont une meilleure viabilité lorsqu’elles sont cultivées à 24 ° C, bien que 37 ° C soit plus proche de leur environnement physiologique natif, probablement en raison de la plus faible activité des enzymes protéases sécrétées à basse température. Les tranches de tissu pancréatique de souris et d’humains sont toutes deux cultivées à la même température et avec un maximum de 15 tranches par plat. Cependant, les recettes des médias diffèrent pour les tranches d’homme et de souris. Les deux formulations sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1. De plus, la procédure est la même pour générer des tranches de souris et d’humains, à l’exception du pancréas de la souris nécessitant une injection d’agarose pour la stabilisation. Les tranches humaines sont acquises par le biais du programme nPOD Pancreas Slice. Les tranches de souris et d’humains ont une épaisseur de 120 μm. Une variété d’expériences peut être effectuée sur les tranches; choisissez des panneaux de coloration qui fonctionnent le mieux pour les expériences planifiées.

4. Préparation des tranches pour les procédures de coloration

1. Cultiver les tranches à 37 °C pendant au moins 1 h avant les expériences prévues. Réchauffer KRBH contenant 3 mM de D-glucose dans un bain-marie à 37 °C. Transférer 2 mL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose dans un plat de 35 mm et utiliser un pinceau pour placer doucement la tranche dans le plat.
2. Si la tranche est transférée du milieu, lavez-la deux fois avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose. Aspirer soigneusement le KRBH avec 3 mM de D-glucose à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas déranger la tranche. Conservez la tranche dans la plaque avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose pendant que les panneaux de coloration sont préparés.

5. Coloration à la dithizone

REMARQUE: Bien que la dithizone puisse être utilisée pour tacher les îlots en rouge, elle tuera la tranche car elle s’est avérée cytotoxique pour les ^îlots17.

1. Mesurer 12,5 mg de dithizone, l’ajouter à 1,25 mL de diméthylsulfoxyde et prendre ce mélange dans une seringue de 50 mL. Remplissez la seringue à un volume de 25 mL à l’aide de la solution saline équilibrée Hanks et fixez un filtre à l’extrémité de la seringue. Aliquoter 2 mL de KRBH avec 3 mM de D-glucose et ajouter 2 gouttes de la solution de dithizone filtrée de la seringue de 50 mL dans un plat de 35 mm.
2. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement une tranche dans une boîte de Pétri de 35 mm. Imagez la tranche avec les îlots indiqués par une coloration rouge à la dithizone à l’aide d’un stéréomicroscope.

6. Coloration de viabilité

REMARQUE : Cette section du protocole décrit comment évaluer la viabilité des tranches à l’aide de la calcéine-AM et du bleu fluorescent SYTOX Blue (voir la Table des matériaux). La calcéine-AM doit être utilisée à une concentration de 4 μM et le bleu SYTOX à 1 μM.

1. Aliquote 2 mL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose, et ajouter 2 μL de colorant calcéine-AM et de bleu SYTOX pour séparer les aliquotes. Vortex les mélanges pendant 5 s.
2. Ajouter 200 μL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose et de colorant calcéine-AM à chaque puits d’un verre de couverture chambré à 8 puits.
   REMARQUE: Des plaques et / ou des chambres d’imagerie alternatives autres qu’un verre de couverture chambré à 8 puits peuvent être utilisées.
3. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement une tranche dans chaque puits de la plaque et transférez la plaque avec les tranches dans un incubateur à 37 °C pendant 20 min. Lavez les tranches deux fois avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose. Aspirer soigneusement le KRBH à l’aide d’une pipette de transfert ou de Pasteur, en prenant soin de ne pas déranger la tranche.
4. Placer la tranche dans une boîte de Petri à fond de verre de 35 mm contenant 2 mL de KRBH avec 3 mM de D-glucose et 2 μL de bleu SYTOX à une concentration de 1 μL pour 1 mL de solution. Couvrez la tranche avec une ancre de tranche, en vous assurant que le côté avec la harpe est orienté vers le bas. Prenez des images de la tranche.
   REMARQUE: Si l’ancre de la tranche continue de flotter, mouillez-la des deux côtés avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose pour l’immerger dans la solution. Il est essentiel de toujours maintenir les tranches dans des solutions contenant un inhibiteur de la protéase, même pendant la charge de colorant. Les taches de viabilité utilisées peuvent être adaptées à l’expérience spécifique ou à la configuration du microscope.

7. Coloration de l’indicateur Slice ^Ca2+

REMARQUE : Cette section du protocole décrit comment colorer des tranches pour les enregistrements ^Ca2+ à l’aide d’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM et SYTOX Blue dans des tranches de souris (voir la table des matériaux). L’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM doit être utilisé à une concentration de 5,6 μM et le SYTOX Blue à 1 μM. Dans les tranches humaines, Fluo-4-AM doit être utilisé à une concentration de 6,4 μM.

1. Aliquote 2 mL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose, ajouter 7 μL de l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM et vortex le mélange pendant 5 s.
   REMARQUE: Pour les tranches de tissus humains, utilisez Fluo-4-AM au lieu de l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Le Fluo-4-AM est préférable car il est plus lumineux lorsque la concentration intracellulaire de ^Ca2+ augmente ; cependant, il ne se charge pas bien dans le tissu pancréatique de la souris. Le protocole est le même que celui décrit ci-dessus pour Fluo-4-AM à l’exception que Fluo-4-AM ne doit être incubé que pendant 30 min.
2. Ajouter 200 μL de KRBH contenant 3mM de D-glucose et le colorant à chaque puits d’un verre de couverture chambré à 8 puits. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement une tranche dans chaque puits du verre de couverture chambré. Transférer le verre de couverture chambré avec les tranches dans un incubateur à 37 °C pendant 45 min.
3. Lavez les tranches deux fois avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose. Aspirer soigneusement le KRBH avec 3 mM de D-glucose à l’aide d’un transfert ou d’une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas déranger la tranche.
4. Placer une tranche dans une plaque ou une chambre d’imagerie avec KRBH contenant 3 mM de D-glucose et SYTOX Blue à une concentration de 1 μL par 1 mL, et couvrir avec une ancre de tranche, en s’assurant que la harpe est tournée vers le bas. Prenez des images de la tranche.
   REMARQUE: Dans ce protocole, un plat de 35 mm rempli de 2 mL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose et 2 μL de bleu SYTOX a été utilisé. Si l’ancre de la tranche continue de flotter, mouillez-la des deux côtés avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose pour l’immerger dans une solution.

8. Tranche de souris ^Ca2+ enregistrements

REMARQUES: La section suivante décrit comment effectuer des enregistrements ^Ca2+ sur des tranches de tissu pancréatique de souris à l’aide de l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM et SYTOX Blue. L’imagerie a été réalisée sur un microscope confocal à balayage laser (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Les lasers utilisés étaient de 405 nm pour le SYTOX Blue, 488 nm pour l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, et 638 nm pour la réflectance. Un détecteur HyD a été utilisé pour l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Des détecteurs à tube photomultiplicateur (PMT) ont été utilisés pour la réflectance et le SYTOX Blue. Le protocole d’imagerie ^Ca2+ est le même pour les tranches de tissu pancréatique humain, sauf que Fluo-4-AM a été utilisé comme indicateur. Les niveaux de puissance laser, le gain et la taille du sténopé doivent être ajustés en fonction de l’échantillon et de l’îlot particulier imagé. En règle générale, un sténopé de 1,5 unité aérée et une puissance laser de 1% sont de bons points de départ.

1. Au moins 1 h avant l’enregistrement, allumez le microscope et équilibrez l’incubateur de type scène ou cage à 37 °C. Placez la boîte de Petri à fond de verre de 35 mm contenant la tranche sur la scène après avoir retiré le couvercle. Faites la mise au point en réglant le microscope sur le mode objectif 10x et champ lumineux. Localisez les îlots en utilisant un champ lumineux en recherchant des ovales brun orangé dans la tranche.
2. Une fois qu’un îlot probable est localisé, passez le microscope en mode d’imagerie confocale. Pour confirmer les îlots par réflectance, allumez le laser 638 nm, réglez la puissance du laser entre 1% et 2% et éteignez le filtre à encoche de 638 nm qui éliminerait normalement la lumière rétrodiffusée. Réglez les limites de détection sur le détecteur PMT sur une bande passante d’environ 20 nm centrée autour de 638 nm.
   REMARQUE: Faites preuve de prudence car l’utilisation du microscope en mode réflectance pourrait endommager le détecteur. En raison de la granularité élevée du tissu endocrinien, la lumière réfléchie peut maintenant être utilisée pour localiser les îlots. Les îlots apparaîtront comme des groupes de cellules granulaires à rétrodiffusion lumineuse sur ce canal de réflectance.
3. Pour visualiser le SYTOX Blue, allumez le détecteur laser et PMT de 405 nm et réglez la puissance du laser entre 1 % et 2 %. Centrez l’îlot d’intérêt dans le champ de vision à l’aide des boutons X et Y du contrôleur de scène. Une fois qu’un îlot d’intérêt est localisé et confirmé par rétrodiffusion, passez à l’objectif 20x et zoomez pour que l’îlot occupe la majeure partie du cadre.
4. Prenez une pile z de l’îlot avec une taille z-step de 1,5 μm. Trouvez la meilleure section optique de l’îlot où la plupart des cellules sont vivantes (négatives pour le bleu SYTOX) et bien chargées avec l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ou Fluo-4-AM.
   REMARQUE: Il n’est pas rare de voir des cellules surchargées d’une grande quantité de colorant et très brillantes. Il peut s’agir de cellules pancréatiques mourantes dans lesquelles le stockage de ^Ca2+ dans le réticulum endoplasmique peut être libéré, ce qui entraîne des niveaux élevés de charge; ce ne sont pas des cellules idéales à enregistrer. Recherchez les cellules qui ont clairement chargé le colorant, mais qui ne sursaturent pas le détecteur afin qu’une augmentation de la luminosité qui se produit lorsque les niveaux cytosoliques de ^Ca2+ fluctuent soit visible. La charge en colorant des îlots dans les tranches est variable; cependant, le colorant se charge généralement bien à travers ~ 10-15 μm de l’îlot. Cependant, la charge en colorant peut être difficile à visualiser si les cellules sont profondément dans le tissu.
5. Pour éviter la décoloration pendant l’enregistrement, assurez-vous que la puissance laser sur le canal 488 nm ne dépasse pas 2%. Augmentez le sténopé à 2 unités aérées pour collecter plus de signal avec une puissance d’excitation plus faible.
6. Réglez le microscope pour qu’il enregistre en mode XYZT. Optimisez les paramètres pour réduire la fréquence d’images à 2 s ou moins par image.
   REMARQUE: Les réglages qui peuvent être effectués pour aider à réduire la fréquence d’images incluent l’activation de la numérisation bidirectionnelle, la diminution ou la désactivation de la moyenne des lignes et l’augmentation de la vitesse de numérisation.
7. Une fois les réglages optimisés, enregistrez plusieurs minutes d’activité basale.
   REMARQUE: Un autre bon indicateur de la viabilité des tissus est si les cellules semblent actives et clignotent visiblement pendant cet enregistrement de l’activité basale.
8. Ajouter 100 μL de glucose concentré 20x et KCl dans KRBH à la plaque à l’aide d’une micropipette de 200 μL aux points de temps donnés pour obtenir une concentration finale de 16,7 mM de glucose ou 30 mM KCl.
   NOTES: Ajoutez les solutions avec soin, en prenant soin de ne pas déranger la tranche pendant l’enregistrement. Assurez-vous de ne pas heurter la plaque avec la micropipette. Il est typique de voir le tissu se contracter en réponse à ces stimulations. Les enregistrements de flux ^Ca2+ ont été traités et quantifiés dans ^ImageJ18. À l’aide du logiciel ImageJ, l’intensité de coloration de l’Oregon Green 488 BAPTA-1, AM a été mesurée dans les cellules en sélectionnant manuellement les régions d’intérêt (ROI). L’intensité de fluorescence de ces ROI a été calculée en divisant les valeurs de fluorescence à des moments ultérieurs par les valeurs de fluorescence initiales des cellules (F/ _F0). Un système de perfusion peut être utilisé avec une chambre d’imagerie spécialisée pour administrer les solutions aux tranches de manière dynamique au lieu de les ajouter manuellement. Les recommandations relatives aux systèmes de perfusion et aux chambres d’imagerie se trouvent dans la Table des matériaux.

9. Coloration des lymphocytes T de souris dans des tranches pancréatiques vivantes

REMARQUE: Cette section du protocole décrit comment colorer les cellules immunitaires dans les tranches de souris. La souche de souris utilisée est le NOD. Chiffon1^-/-. AI4 ^α/β car ce modèle développe systématiquement une maladie avec une insulite importante. Les lymphocytes T CD8⁺ de cette souris ciblent tous un épitope d’insuline, ce qui permet l’utilisation d’un tétramère insuline-Db marqué à la phycoérythrine (PE⁾¹⁵. L’anticorps CD8 doit être utilisé à une concentration de 1:20 et le tétramère d’insuline à 1:50.

1. Aliquote 100 μL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose, ajouter 2 μL de tétramère d’insuline PE et 5 μL d’anticorps CD8 allophycocyanine (APC), et vortex le mélange pendant 5 s.
2. Ajouter 100 μL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose et le tétramère et l’anticorps à un puits d’un verre de couverture chambré à 8 puits. À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement une tranche dans le puits du verre de couverture chambré. Transférer le verre de couverture chambré avec la tranche dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min.
3. Laver la tranche deux fois avec 2 mL de KRBH contenant 3 mM de D-glucose. Aspirer soigneusement le KRBH avec 3 mM de D-glucose à l’aide d’un transfert ou d’une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas déranger la tranche.
4. Placer la tranche dans une boîte de Petri à fond de verre de 35 mm contenant du KRBH avec 3 mM de D-glucose et le bleu SYTOX à une concentration de 1 μL pour 1 mL, et couvrir avec une ancre en tranche, en plaçant le côté avec la harpe tournée vers le bas. Prenez des images de la tranche.
   REMARQUE: Si l’ancre de la tranche continue de flotter, mouillez-la des deux côtés avec du KRBH contenant 3 mM de D-glucose pour l’immerger dans la solution. L’anticorps dilué et le tétramère peuvent être réutilisés une fois. Après avoir teint deux tranches, un mélange d’anticorps frais doit être fait.

10. Enregistrement des cellules immunitaires de souris

REMARQUE: La section suivante décrit comment effectuer des enregistrements de cellules immunitaires sur des tranches de tissu pancréatique de souris à l’aide d’anticorps CD8, de tétramère d’insuline PE et de bleu SYTOX. La configuration de l’imagerie est décrite à la section 8. Les enregistrements ont été réalisés à une résolution de 800 × 800 pixels. Les lasers utilisés étaient de 405 nm pour le SYTOX Blue, de 488 nm pour le tétramère d’insuline et de 638 nm pour l’anticorps CD8 et la réflectance. Des détecteurs HyD ont été utilisés pour les anticorps CD8 et le tétramère d’insuline PE. Les détecteurs PMT ont été utilisés pour la réflectance et le SYTOX Blue. Le protocole d’imagerie des cellules immunitaires est le même pour les tranches de tissu pancréatique humain, à l’exception de l’utilisation de différents anticorps et multimères HLA complexés d’antigènes pour les tissus humains. Pour la coloration tétramère d’insuline dans le tissu de souris et la coloration HLA-multimère dans le tissu humain, une co-coloration des cellules immunitaires doit être utilisée pour vérifier la présence des cellules T spécifiques réactives à l’antigène. Ici, un anticorps anti-CD8 a été utilisé. Les anticorps, tels que les anti-CD3 ou les anti-CD4, peuvent également être utilisés en fonction de la population cellulaire cible.

1. Au moins 1 h avant l’enregistrement, allumez le microscope et équilibrez l’incubateur de la scène à 37 °C. Fixez la boîte de Petri à fond de verre de 35 mm contenant la tranche sur la scène. Focalisez le microscope en réglant l’objectif 10x en mode champ lumineux. Localisez les îlots en utilisant le mode champ lumineux en recherchant des ovales de couleur brun orangé dans la tranche.
2. Basculez le microscope vers l’imagerie confocale en appuyant sur la touche CS du contrôleur à écran tactile du microscope. Pour visualiser les îlots par réflectance, allumez le laser 638 et le détecteur PMT, réglez la puissance laser entre 1% et 2% et éteignez les filtres à encoche.
   REMARQUE: En raison de la granularité accrue du tissu endocrinien, la lumière réfléchie peut maintenant être utilisée pour localiser les îlots. Les îlots apparaîtront comme des groupes de cellules granulaires brillantes sur ce canal.
3. Pour voir le bleu SYTOX, l’anticorps CD8 et le tétramère d’insuline, vérifiez que la puissance du laser est comprise entre 1% et 2%. Utilisez les paramètres suivants pour afficher chacun des trois : pour le SYTOX Blue, allumez le laser 405 nm et le détecteur PMT ; pour l’anticorps CD8, allumez le détecteur HyD; et pour voir le tétramère d’insuline, allumez le laser 488 nm et le détecteur HyD.
4. Centrez l’îlot d’intérêt dans le champ de vision à l’aide des boutons X et Y du contrôleur de scène. Une fois qu’un îlot d’intérêt est localisé, passez à l’objectif 20x et zoomez pour que l’îlot occupe la majeure partie du cadre. Prenez une pile z de l’îlot avec une taille z-step de 1,5 μm. Trouvez les meilleures sections optiques (une série de 5 à 10 sections) de l’îlot où la plupart des cellules sont vivantes (négatives pour le bleu SYTOX) et toutes les cellules immunitaires environnantes sont au centre de l’attention.
   REMARQUE: Essayez de trouver des cadres où il y a plusieurs cellules CD8 positives et tétramères d’insuline positives entourant ou infiltrant l’îlot.
5. Réglez le microscope pour qu’il enregistre en mode XYZT. Optimisez les paramètres pour enregistrer une pile Z des étapes sélectionnées toutes les 20 minutes sur une période de plusieurs heures.
   REMARQUE: Si possible, il est préférable de faire ces enregistrements dans une chambre d’imagerie où la température et les niveaux de _CO2 peuvent être contrôlés, en particulier lors de l’enregistrement pendant plus de quatre heures. Dans le cas d’un enregistrement de nuit, un excès d’anticorps peut être ajouté au milieu pour compenser le cycle des récepteurs des lymphocytes T et la décoloration du colorant. De plus, différents fluorophores peuvent être utilisés pour les anticorps des lymphocytes T. D’après l’expérience, les anticorps dans la gamme rouge lointain fonctionnent mieux pour les cellules T.

Résultats

Ce protocole produira des tranches de tissu pancréatique vivant adaptées à la fois aux études de fonctionnalité et aux enregistrements de cellules immunitaires. L’apparence des tranches en champ clair et sous la lumière réfléchie est illustrée à la Figure 1A,B. Comme nous l’avons vu, les îlots peuvent être trouvés en tranches en utilisant la lumière réfléchie en raison de leur granularité accrue qui se produit en raison de leur teneur en insuline (

Discussion

L’objectif de ce protocole est d’expliquer la génération de tranches de pancréas et les procédures nécessaires pour utiliser les tranches dans des études fonctionnelles et immunologiques. Il y a de nombreux avantages à utiliser des tranches pancréatiques vivantes. Cependant, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour que le tissu reste viable et utile au cours des protocoles d’expérience décrits. Il est impératif de travailler rapidement. Le temps entre l’injection du pancréas et la générati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Handle	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish	Corning	430591
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	301029	BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle	BD	BD 305109	BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe	BD	309653
8-well chambered coverglass	Ibidi	80826	µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Calcium chloride	Sigma	C5670	CaCl2
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Confocal laser-scanning microscope	Leica	SP8	Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm tissue culture dish	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Ice bucket	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform	Warner Instruments	PM-1	Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave	GE	JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Paintbrush	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26	Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer	Emory Tetramer Research Core	sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Potassium chloride	Sigma	P5405	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque low melting-point agarose	Lonza	50101	To make agarose for slice generation
Slice anchor	Warner Instruments	64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)	Warner Instruments	640253	Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma	S5886	NaCl
Sodium phosphate monohydrate	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter	Warner Instruments	SA-20MW-AL	To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator	Okolab	H201
Stereoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet	Falcon	357575	Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System	Warner Instruments	VCS-8	System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02