Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Riepilogo

Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.

Abstract

Le fette di tessuto pancreatico vivo consentono lo studio della fisiologia e della funzione delle isole nel contesto di un microambiente di isole intatte. Le fette sono preparate da tessuto pancreatico umano e di topo vivo incorporato nell'agarosio e tagliate usando un vibratoma. Questo metodo consente al tessuto di mantenere la vitalità e la funzione oltre a preservare patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 (T1D) e di tipo 2 (T2D). Il metodo slice consente nuove direzioni nello studio del pancreas attraverso il mantenimento delle strutture complesse e delle varie interazioni intercellulari che comprendono i tessuti endocrini ed esocrini del pancreas. Questo protocollo dimostra come eseguire la colorazione e la microscopia time-lapse di cellule immunitarie endogene vive all'interno di fette pancreatiche insieme a valutazioni della fisiologia delle isole. Inoltre, questo approccio può essere perfezionato per discernere le popolazioni di cellule immunitarie specifiche per gli antigeni delle cellule insulari utilizzando i principali reagenti multimero complesso di istocompatibilità.

Introduzione

Il coinvolgimento del pancreas è patognomonico a malattie come pancreatite, T1D e T2D1,2,3. Lo studio della funzione in isole isolate di solito comporta la rimozione delle isole dal loro ambiente ^circostante4. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo è stato sviluppato per consentire lo studio del tessuto pancreatico mantenendo intatti i microambienti delle isole ed evitando l'uso di stressanti procedure di isolamento delle ^isole5,6,7. Le fette di tessuto pancreatico da tessuto di donatore umano sono state utilizzate con successo per studiare il T1D e hanno dimostrato processi di perdita e disfunzione delle cellule beta oltre all'infiltrazione delle cellule immunitarie8,9,10,11,12,13. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo può essere applicato sia al tessuto pancreatico di topo che a quello ^umano5,6,8. Le fette di tessuto pancreatico umano da tessuti di donatori di organi sono ottenute attraverso una collaborazione con la Rete per i donatori di organi pancreatici con diabete (nPOD). Le fette di topo possono essere generate da una varietà di diversi ceppi di topo.

Questo protocollo si concentrerà sul gene-1-nullo attivante la ricombinazione diabetica non obesa (NOD). Rag1^-/-) e il recettore delle cellule T transgenico (AI4) (NOD. Rag1^-/-. Ceppi di topo AI4 ^α/β). ANNUIRE. I topi Rag1^-/- non sono in grado di sviluppare cellule T e B a causa di un'interruzione del gene 1 (Rag1)¹⁴ che attiva la ricombinazione. ANNUIRE. Rag1^-/-. I topi AI4 ^α/β sono utilizzati come modello per il diabete di tipo 1 accelerato perché producono un singolo clone di cellule T che prende di mira un epitopo di insulina, con conseguente infiltrazione costante delle isole e rapido sviluppo della ^malattia15. Il protocollo qui descritto descrive le procedure per studi funzionali e immunologici che utilizzano fette pancreatiche umane e di topo vive attraverso l'applicazione di approcci di microscopia confocale. Le tecniche qui descritte includono valutazioni di vitalità, identificazione e localizzazione delle isole, registrazioni citosoliche di ^Ca2+ , nonché colorazione e identificazione delle popolazioni di cellule immunitarie.

Protocollo

NOTE: Tutti i protocolli sperimentali che utilizzano topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (201808642). Sezioni pancreatiche umane da donatori di tessuti di entrambi i sessi sono state ottenute tramite la banca dei tessuti Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), Università della Florida. I pancreati umani sono stati prelevati da donatori di organi cadaverici da organizzazioni certificate di approvvigionamento di organi che collaborano con nPOD in conformità con le leggi e i regolamenti sulla donazione di organi e classificati come "soggetti non umani" dall'Università della Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB n. 392-2008), rinunciando alla necessità di consenso. I tessuti nPOD specificamente utilizzati per questo progetto sono stati approvati come non umani dall'IRB dell'Università della Florida (IRB20140093). Gli obiettivi delle sezioni 1-3 di questo protocollo sono spiegare come sezionare con successo un topo, preparare ed elaborare il pancreas e generare fette di tessuto pancreatico vivo. Le soluzioni devono essere preparate in anticipo e le ricette possono essere trovate nella Tabella supplementare 1. Il tempo è il fattore più critico durante questi passaggi del protocollo. Una volta che il topo è stato sacrificato, la vitalità dei tessuti inizierà a diminuire. Tutte e tre le parti di questo protocollo devono essere completate il più rapidamente possibile fino a quando non vengono generate tutte le sezioni necessarie.

1. Preparazione per la generazione di fette di pancreas di topo

1. Fissare la lama sul supporto della lama del vibratoma, ma non collegarla ancora al vibrame.
2. Sciogliere 100 mL di agarosio a basso punto di fusione all'1,25% p/v in un forno a microonde. Azionare il microonde a intervalli di 1 minuto e arrestare il microonde per 10 secondi se la soluzione di agarosio inizia a bollire. Ripetere questo processo fino a quando l'agarosio non viene sciolto e viene prodotta una soluzione omogenea. Mettere la bottiglia a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: La bassa concentrazione di agarosio è dovuta alla minore densità del pancreas del topo.
3. Riempire una siringa Luer lock da 10 mL con 3 mL di agarosio caldo. Montare un ago da 27 G da 25 mm sulla siringa. Conservare la siringa con l'ago fissato con cappuccio a bagnomaria a 37 °C fino all'iniezione della soluzione.
   NOTA: Un ago da 27 G è preferito in quanto si adatta saldamente al dotto biliare comune dei topi tra 10-25 g di peso corporeo e consente il flusso della soluzione di agarosio altamente viscosa. Mentre gli aghi di foro più grande possono essere selezionati per l'uso, gli aghi più piccoli (calibro più grande) non sono raccomandati in quanto potrebbero essere più facilmente intasati con la soluzione di agarosio.
4. Aggiungere 20 ml di soluzione extracellulare refrigerata (ECS) a una capsula di Petri da 10 cm.
   NOTA: l'ECS non ha bisogno di essere bollato in nessun punto.
5. Riempire due piastre di Petri non trattate da 10 cm con 15 mL di tampone bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) contenente 3 mM di D-glucosio e inibitore della tripsina di soia ad una concentrazione di 0,1 mg/mL per piatto.
   NOTA: In tutto questo protocollo, è essenziale che tutte le soluzioni utilizzate per il mantenimento delle fette contengano inibitori della tripsina di soia per prevenire danni ai tessuti causati dalle proteasi digestive pancreatiche.

2. Escissione del pancreas del topo ed elaborazione dei tessuti

NOTA: Il protocollo per l'asportazione del pancreas, l'elaborazione del tessuto e la generazione di fette è modificato da Marciniak et ^al5. Per garantire la vitalità dei tessuti, ridurre al minimo la quantità di tempo tra la rimozione del pancreas e la generazione di fette. Tutte le attrezzature necessarie devono essere preparate in anticipo e orientate in modo da consentire una rapida progressione attraverso i passaggi seguenti. La canulazione e l'iniezione del dotto biliare e l'escissione del pancreas vengono eseguite al meglio sotto uno stereoscopio.

1. Il topo è profondamente anestetizzato con isoflurano e sacrificato dalla lussazione cervicale.
   NOTA: l'isoflurano è il metodo di anestesia preferito. Deve essere utilizzata una concentrazione di isoflurano al 5%. Ad esempio, 0,26 ml devono essere utilizzati con una camera da 1 ^L16. Una diminuzione della vitalità del tessuto pancreatico è stata osservata quando è stata utilizzata _CO2 .
2. Spruzzare liberamente il mouse con etanolo al 70% v/v per ridurre la contaminazione dei tessuti con la pelliccia durante la dissezione e l'escissione. Posizionare il mouse in un orientamento dorsale verso il basso, ventrale verso l'alto con il lato anteriore a sinistra.
3. Usando le forbici, aprire il peritoneo e rimuovere la gabbia toracica, facendo attenzione a non perforare il cuore o i vasi adiacenti. Utilizzare una pinza per capovolgere il fegato nella cavità toracica e per spostare l'intestino fuori dalla cavità corporea per esporre il dotto biliare comune. Usa un morsetto bulldog Johns Hopkins per occludere l'ampolla di Vater.
4. Recuperare una siringa Luer lock da 10 mL precaricata con 3 mL di soluzione calda di agarosio dal bagno d'acqua a 37 °C.
   NOTA: Una volta rimossa la siringa con l'agarosio dal bagno d'acqua, l'iniezione del pancreas deve essere eseguita rapidamente prima che l'agarosio si raffreddi e si depositi nella siringa.
5. Tenendo la pinza nella mano sinistra, usarle per sostenere e stabilizzare delicatamente il dotto biliare per l'iniezione.
6. Tenere la siringa nella mano destra, inserire l'ago smussato verso l'alto nel dotto biliare. Iniettare lentamente e costantemente il pancreas. Una volta iniziata l'iniezione, il flusso non può essere interrotto senza l'indurimento dell'agarosio nella siringa e nel pancreas.
   NOTA: il volume utilizzato dipenderà dal peso del mouse. Sulla base dell'esperienza, si raccomanda di utilizzare 1 mL di soluzione di agarosio per 10 g di peso corporeo del topo con un volume massimo di 2 ml. Il pancreas dovrebbe apparire leggermente gonfiato con una struttura più definitiva, ma non eccessivamente esteso. L'iniezione eccessiva provoca isole che si separano dal tessuto esocrino e che hanno un aspetto "soffiato" nelle fette.
7. Asportare il pancreas pieno di agarosio dal topo. Usando pinze e forbici, tagliare via il pancreas, iniziando dallo stomaco, spostandosi verso l'intestino e finendo con la milza. Una volta tagliato, rimuovere delicatamente il pancreas iniettato con una pinza e metterlo in una capsula di Petri di 10 cm piena di ECS refrigerato.
8. Utilizzare le forbici per rimuovere l'adiposo, il tessuto connettivo, il tessuto fibrotico e le parti del pancreas che non vengono iniettate con agarosio.
   NOTA: Le parti del tessuto che devono essere rimosse non avranno strutture fortemente consolidate e appariranno un po 'gelatinose.
9. Dopo aver tagliato il tessuto, utilizzare le forbici per tagliarlo in sezioni più piccole di circa 5 mm di diametro lasciandolo immerso sotto ECS. Tagliare il tessuto con cura, facendo attenzione a non spingere l'agarosio fuori dal tessuto.
10. Rimuovere i pezzi di tessuto dall'ECS e posizionarli su un tergicristallo a due strati (vedere la tabella dei materiali). Arrotolarli delicatamente sul tergicristallo usando una pinza per rimuovere il liquido in eccesso.
11. Usando una pinza, posizionare con cura i pezzi di tessuto in una capsula di Petri da 35 mm con non più di 4 pezzi per piastra. Posizionare il lato più piatto del blocco di tessuto rivolto verso il basso. Premere delicatamente sul tessuto usando una pinza.
    NOTA: Assicurarsi che ci sia spazio, almeno qualche millimetro, tra i pezzi di tessuto e che non stiano toccando il bordo della piastra.
12. Versare lentamente l'agarosio a 37 °C nel piatto, facendo attenzione a non versarlo direttamente sul fazzoletto. Versare abbastanza in modo che i pezzi di tessuto siano completamente coperti. Assicurati che ci sia uno strato di agarosio sopra i pezzi di tessuto poiché questa parte sarà incollata al supporto del campione.
13. Trasferire con cura il piatto con i pezzi di fazzoletto in frigorifero per consentire all'agarosio di fissarsi. Assicurarsi che i pezzi di tessuto non si spostino o inizino a fluttuare. Se lo fanno, riaggiustali rapidamente usando una pinza.
    NOTA: l'impostazione dell'agarosio dovrebbe richiedere solo pochi minuti.
14. Una volta che l'agarosio si è impostato, usa un bisturi per tagliare il tessuto in linea retta per creare blocchi di agarosio come se facessero una griglia tra i pezzi di tessuto. Assicurati di lasciare alcuni millimetri di agarosio che circonda tutti i lati del tessuto.
    NOTA: Non ci dovrebbe essere alcun tessuto sporgente dall'agarosio. Ogni blocco dovrebbe essere un cubo di circa 5 mm x 5 mm x 5 mm di volume.
15. Usa il bisturi per capovolgere le sezioni vuote di agarosio che sono state tagliate attorno ai bordi del piatto. Rimuovere i blocchi con il tessuto dal piatto sollevandoli con cura con una pinza.

3. Generazione di fette pancreatiche di topo

1. Usando la pinza, disporre i blocchi sul supporto del campione; posizionali lateralmente, tenendo presente che verranno capovolti sulla super colla. Disporre i blocchi in modo che non si estendano oltre la larghezza della lama. Mentre il vibratoma si muove lentamente, disporre i blocchi in modo che la lama debba spostarsi in avanti il meno possibile.
   NOTA: Due file di tre o quattro blocchi ciascuna con pochi millimetri tra le righe funzionano bene. I blocchi all'interno della stessa riga possono toccarsi, ma quando entrambe le righe si toccano, può essere difficile recuperare le fette mentre escono dai blocchi.
2. Applicare una linea di super colla sul portacampioni e utilizzare l'estremità del distributore di colla per stendere la colla in uno strato sottile. Capovolgere i blocchi di tessuto sulla colla in modo che il lato più vicino al tessuto sia rivolto verso l'alto. Spingere delicatamente verso il basso sui blocchi e lasciare asciugare la colla per tre minuti.
3. Fissare il supporto della lama e la piastra al vibrato, in genere con una vite o un magnete, a seconda del modello di vibrame. Regolare l'altezza e la distanza percorsa della lama in modo che la lama si muova sulla lunghezza dei blocchi e appena sopra di essi.
   NOTA: la pinza può essere utile durante la regolazione dell'altezza della lama. Possono essere posizionati sopra il blocco di tessuto per aiutare a posizionare la lama il più vicino possibile alla parte superiore del blocco senza toccare il blocco.
4. Assicurarsi che la colla si sia asciugata spingendo delicatamente i blocchi con una pinza e riempire il vassoio del vibratome con ECS refrigerato fino a quando la lama non è coperta. Impostare il vibratoma per creare fette di spessore 120 μm a una velocità di 0,175 mm/s, una frequenza di 70 Hz e un'ampiezza di 1 mm.
   NOTA: La velocità del vibratoma può essere regolata in base alla facilità di taglio del tessuto.
5. Avviare il vibratoma e fare attenzione a quando le fette iniziano a staccarsi dai blocchi di tessuto. Utilizzare una pinza Graefe da 10 cm o un piccolo pennello n. 4 per rimuovere con cura le fette una volta che galleggiano fuori dal blocco e posizionarle in piastre da 10 cm con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e inibitore della tripsina. Raccogli le fette posizionando un pennello o una pinza sotto di esse e sollevando delicatamente le fette. Non incubare più di 15 fette insieme in un unico piatto.
   NOTA: è normale che il vibratoma abbia alcuni passaggi sui blocchi in cui non vengono fatte fette, ma questi dovrebbero essere ridotti al minimo per il tempo. Avere le forbici pronte nel caso in cui le fette non si separino completamente dai blocchi di tessuto. Se ciò accade, un angolo o un bordo della fetta verrà attaccato al blocco dopo il passaggio della lama del vibratome. Non estrarre la fetta o il blocco quando si rimuove la fetta bloccata.
6. Posizionare le piastre con le fette su un bilanciere a temperatura ambiente e a 25 giri / min. Lasciare riposare le fette a temperatura ambiente per un'ora. Se devono essere lasciate più a lungo, posizionare le fette in 15 ml di terreno di coltura a fette (vedere tabella supplementare 1) in un'incubatrice. Incubare le fette preparate per gli studi in giornata a 37 °C e le fette di coltura che vengono coltivate durante la notte a 24 °C, trasferendole a 37 °C almeno 1 ora prima degli esperimenti.
   NOTA: A lungo termine, le fette hanno una migliore vitalità se coltivate a 24 °C, anche se 37 °C sono più vicine al loro ambiente fisiologico nativo, probabilmente a causa della minore attività degli enzimi proteasi secreti a temperatura più bassa. Le fette di tessuto pancreatico umano e di topo vengono entrambe coltivate alla stessa temperatura e con un massimo di 15 fette per piatto. Tuttavia, le ricette dei media differiscono per le fette umane e di topo. Entrambe le formulazioni sono elencate nella Tabella supplementare 1. Inoltre, la procedura è la stessa per la generazione di fette di topo e umane ad eccezione del pancreas del topo che richiede l'iniezione di agarosio per la stabilizzazione. Le fette umane vengono acquisite attraverso il programma nPOD Pancreas Slice. Sia le fette di topo che quelle umane hanno uno spessore di 120 μm. Una varietà di esperimenti può essere eseguita sulle fette; scegli i pannelli di colorazione che funzionano meglio per gli esperimenti pianificati.

4. Preparazione delle fette per le procedure di colorazione

1. Coltivare le fette a 37 °C per almeno 1 ora prima degli esperimenti pianificati. KRBH caldo contenente 3 mM di D-glucosio in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire 2 mL di KRBH contenenti 3mM di D-glucosio in un piatto da 35 mm e utilizzare un pennello per posizionare delicatamente la fetta nel piatto.
2. Se la fetta viene trasferita dal mezzo, lavarla due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta di trasferimento o una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare la fetta. Conservare la fetta nel piatto con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio mentre i pannelli di colorazione sono preparati.

5. Colorazione del ditizone

NOTA: Sebbene il ditizone possa essere usato per macchiare le isole di rosso, ucciderà la fetta in quanto è stato trovato citotossico per le ^isole17.

1. Misurare 12,5 mg di ditizone, aggiungerlo a 1,25 ml di dimetilsolfossido e prendere questa miscela in una siringa da 50 mL. Riempire la siringa a un volume di 25 ml utilizzando Hanks Balanced Salt Solution e fissare un filtro all'estremità della siringa. Aliquota 2 mL di KRBH con 3 mM di D-glucosio e aggiungere 2 gocce della soluzione di ditizone filtrata dalla siringa da 50 mL in un piatto da 35 mm.
2. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in una capsula di Petri da 35 mm. Immagina la fetta con gli isolotti indicati dalla colorazione rossa del ditizone usando uno stereomicroscopio.

6. Colorazione di vitalità

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come valutare la vitalità delle fette utilizzando calcein-AM e SYTOX Blue blu-fluorescente (vedere la tabella dei materiali). Calcein-AM deve essere usato ad una concentrazione di 4 μM e SYTOX Blue a 1 μM.

1. Aliquota 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e aggiungere 2 μL di colorante calcein-AM e SYTOX Blue per separare le aliquote. Vortice le miscele per 5 s.
2. Aggiungere 200 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e colorante calcein-AM a ciascun pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti.
   NOTA: è possibile utilizzare piastre alternative e/o camere di imaging diverse da un vetro di copertura a 8 pozzetti.
3. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in ogni pozzetto del piatto e trasferire il piatto con le fette in un incubatore a 37 °C per 20 minuti. Lavare le fette due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, avendo cura di non disturbare la fetta.
4. Porre la fetta in una capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente 2 mL di KRBH con 3 mM di D-glucosio e 2 μL di SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL di soluzione. Coprire la fetta con un'ancora a fetta, assicurandosi che il lato con l'arpa sia rivolto verso il basso. Scatta immagini della fetta.
   NOTA: se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla nella soluzione. È fondamentale mantenere sempre le fette in soluzioni contenenti inibitore della proteasi, anche durante il caricamento del colorante. Le macchie di viabilità utilizzate possono essere adattate per l'esperimento specifico o la configurazione del microscopio.

7. Colorazione dell'indicatore ^Ca2+ della fetta

NOTA: questa sezione del protocollo descrive come macchiare le fette per le registrazioni ^Ca2+ utilizzando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue nelle sezioni del mouse (vedere la Tabella dei materiali). L'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM deve essere usato ad una concentrazione di 5,6 μM e il SYTOX Blue a 1 μM. Nelle fette umane, Fluo-4-AM deve essere usato ad una concentrazione di 6,4 μM.

1. Aliquota 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio, aggiungere 7 μL di Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e vortice la miscela per 5 s.
   NOTA: per le fette di tessuto umano, utilizzare Fluo-4-AM invece di Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Il Fluo-4-AM è preferibile perché è più luminoso quando aumenta la concentrazione intracellulare ^{di Ca2} +; tuttavia, non si carica bene nel tessuto pancreatico del topo. Il protocollo è lo stesso descritto sopra per Fluo-4-AM con l'eccezione che Fluo-4-AM deve essere incubato solo per 30 minuti.
2. Aggiungere 200 μL di KRBH contenente 3mM di D-glucosio e il colorante a ciascun pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta in ogni pozzetto del vetro di copertura camerato. Trasferire il vetro di copertura camerato con le fette in un incubatore a 37 °C per 45 minuti.
3. Lavare le fette due volte con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, avendo cura di non disturbare la fetta.
4. Posizionare una fetta in una piastra o camera di imaging con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL e coprire con un'ancora a fetta, assicurandosi che l'arpa sia rivolta verso il basso. Scatta immagini della fetta.
   NOTA: In questo protocollo è stata utilizzata una parabola da 35 mm riempita con 2 mL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e 2 μL di SYTOX Blue. Se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla in soluzione.

8. Registrazioni ^ca2+ della fetta di mouse

NOTE: La sezione seguente descrive come eseguire registrazioni ^Ca2+ su fette di tessuto pancreatico di topo utilizzando Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e SYTOX Blue. L'imaging è stato eseguito su un microscopio a scansione laser confocale (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli). I laser utilizzati erano 405 nm per il SYTOX Blue, 488 nm per l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM e 638 nm per la riflettanza. Un rilevatore HyD è stato utilizzato per l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. I rivelatori a tubo fotomoltiplicatore (PMT) sono stati utilizzati per la riflettanza e il SYTOX Blue. Il protocollo ^{di imaging Ca2+} è lo stesso per le fette di tessuto pancreatico umano, tranne per il fatto che Fluo-4-AM è stato utilizzato come indicatore. I livelli di potenza del laser, il guadagno e le dimensioni del foro stenopeico devono essere regolati in base al campione e alla particolare isolotto ripreso. In genere, un foro stenopeico di 1,5 unità ariose e una potenza laser dell'1% sono buoni punti di partenza.

1. Almeno 1 ora prima della registrazione, accendere il microscopio ed equilibrare l'incubatore a 37 °C. Posizionare sul palco la capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente la fetta dopo aver rimosso il coperchio. Mettere a fuoco impostando il microscopio sulla modalità obiettivo 10x e campo luminoso. Individua gli isolotti usando brightfield cercando ovali arancio-marrone all'interno della fetta.
2. Una volta individuata una probabile isolotto, passare il microscopio alla modalità di imaging confocale. Per confermare gli isolotti in base alla riflettanza, accendere il laser a 638 nm, impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2% e spegnere il filtro notch da 638 nm che normalmente rimuoverebbe la luce retrodiffusa. Impostare i limiti di rilevamento sul rilevatore PMT su una larghezza di banda di circa 20 nm centrata intorno a 638 nm.
   NOTA: Prestare attenzione poiché l'utilizzo del microscopio in modalità di riflettanza potrebbe danneggiare il rilevatore. A causa dell'elevata granularità del tessuto endocrino, la luce riflessa può ora essere utilizzata per localizzare le isole. Le isole appariranno come gruppi di cellule granulari brillantemente retrodiffuse su questo canale di riflettanza.
3. Per visualizzare il SYTOX Blue, accendere il rilevatore laser e PMT da 405 nm e impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2%. Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse e confermato dal backscatter, passa all'obiettivo 20x e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte dell'inquadratura.
4. Prendi una pila z dell'isolotto con una dimensione z-step di 1,5 μm. Trova la migliore sezione ottica dell'isolotto in cui la maggior parte delle cellule sono vive (negativo per il SYTOX Blue) e ben caricato con l'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM o Fluo-4-AM.
   NOTA: Non è insolito vedere cellule che sono sovraccariche con una grande quantità di colorante e che sono molto luminose. Queste possono essere cellule pancreatiche morenti in cui può essere rilasciato lo stoccaggio di ^{Ca2 +} nel reticolo endoplasmatico, con conseguenti alti livelli di carico; queste non sono celle ideali da registrare. Cerca le cellule che hanno chiaramente caricato il colorante, ma non stanno sovrasaturando il rilevatore in modo che sia visibile un aumento della luminosità che si verifica quando i livelli citosolici di ^{Ca2 +} fluttuano. Il caricamento del colorante delle isole all'interno delle fette è variabile; tuttavia, il colorante in genere si carica bene attraverso ~ 10-15 μm dell'isolotto. Tuttavia, il carico del colorante può essere difficile da visualizzare se le cellule sono profonde nel tessuto.
5. Per evitare lo sbiadimento del colorante durante la registrazione, assicurarsi che la potenza del laser sul canale a 488 nm non superi il 2%. Aumentare il foro stenopeico a 2 unità ariose per raccogliere più segnale con una potenza di eccitazione inferiore.
6. Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT. Ottimizza le impostazioni per ridurre la frequenza dei fotogrammi a 2 s o meno per fotogramma.
   NOTA: le regolazioni delle impostazioni che possono essere effettuate per ridurre la frequenza dei fotogrammi includono l'attivazione della scansione bidirezionale, la diminuzione o la disattivazione della media di linea e l'aumento della velocità di scansione.
7. Una volta ottimizzate le impostazioni, registrare diversi minuti di attività basale.
   NOTA: Un altro buon indicatore della vitalità dei tessuti è se le cellule appaiono attive e lampeggiano visibilmente durante questa registrazione dell'attività basale.
8. Aggiungere 100 μL di glucosio concentrato 20x e KCl in KRBH alla piastra utilizzando una micropipetta da 200 μL nei punti temporali indicati per ottenere una concentrazione finale di 16,7 mM di glucosio o 30 mM KCl.
   NOTE: Aggiungere le soluzioni con attenzione, facendo attenzione a non disturbare la fetta durante la registrazione. Assicurati di non urtare la piastra con la micropipetta. È tipico vedere il tessuto contrarsi in risposta a queste stimolazioni. Le registrazioni del flusso di ^Ca2+ sono state elaborate e quantificate in ^ImageJ18. Utilizzando il software ImageJ, l'intensità di colorazione dell'Oregon Green 488 BAPTA-1, AM è stata misurata nelle celle selezionando manualmente le regioni di interesse (ROI). L'intensità di fluorescenza di questi ROI è stata calcolata dividendo i valori di fluorescenza nei punti temporali successivi per i valori di fluorescenza iniziali delle cellule (F / _F0). Un sistema di perfusione può essere utilizzato insieme a una camera di imaging specializzata per amministrare le soluzioni alle fette in modo dinamico anziché aggiungerle manualmente. Le raccomandazioni sul sistema di perfusione e sulla camera di imaging sono disponibili nella Tabella dei materiali.

9. Colorazione delle cellule T di topo in fette pancreatiche vive

NOTA: questa sezione del protocollo descrive come macchiare le cellule immunitarie all'interno di fette di topo. Il ceppo di topo utilizzato è il NOD. Rag1^-/-. AI4 ^α/β poiché questo modello sviluppa costantemente malattie con insolite significativa. Le cellule T CD8⁺ in questo topo prendono tutte di mira un epitopo di insulina, consentendo l'uso di un tetramero di insulina ^Db marcato con ficoeritrina (PE)¹⁵. L'anticorpo CD8 deve essere usato ad una concentrazione di 1:20 e il tetramero di insulina a 1:50.

1. Aliquota 100 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio, aggiungere 2 μL di tetramero di insulina PE e 5 μL di anticorpo alloficocianina (APC) CD8 e vortice la miscela per 5 s.
2. Aggiungere 100 μL di KRBH contenente 3 mM di D-glucosio e il tetramero e l'anticorpo a un pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti. Usando un pennello, posizionare con cura una fetta nel pozzetto del vetro di copertura camerato. Trasferire il vetro di copertura camerato con la fetta in un incubatore a 37 °C per 30 minuti.
3. Lavare la fetta due volte con 2 mL di KRBH contenenti 3 mM di D-glucosio. Aspirare accuratamente il KRBH con 3 mM di D-glucosio utilizzando una pipetta transfer o Pasteur, facendo attenzione a non disturbare la fetta.
4. Posizionare la fetta in una capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente KRBH con 3 mM di D-glucosio e SYTOX Blue ad una concentrazione di 1 μL per 1 mL, e coprire con un'ancora a fetta, posizionando il lato con l'arpa rivolta verso il basso. Scatta immagini della fetta.
   NOTA: se l'ancora della fetta continua a galleggiare, bagnarla su entrambi i lati con KRBH contenente 3 mM di D-glucosio per immergerla nella soluzione. L'anticorpo diluito e il tetramero possono essere riutilizzati una volta. Dopo aver macchiato due fette, deve essere fatta una miscela di anticorpi freschi.

10. Registrazione delle cellule immunitarie del topo

NOTA: la sezione seguente descrive come eseguire registrazioni di cellule immunitarie su fette di tessuto pancreatico di topo utilizzando anticorpo CD8, tetramero di insulina PE e SYTOX Blue. La configurazione dell'imaging è quella descritta nella sezione 8. Le registrazioni sono state effettuate a 800 × risoluzione di 800 pixel. I laser utilizzati erano 405 nm per il SYTOX Blue, 488 nm per il tetramero dell'insulina e 638 nm per l'anticorpo CD8 e la riflettanza. I rilevatori HyD sono stati utilizzati per l'anticorpo CD8 e il tetramero di insulina PE. I rilevatori PMT sono stati utilizzati per la riflettanza e il SYTOX Blue. Il protocollo di imaging delle cellule immunitarie è lo stesso per le fette di tessuto pancreatico umano, ad eccezione dell'uso di anticorpi diversi e multimeri HLA complessati con antigene per il tessuto umano. Sia per la colorazione del tetramero dell'insulina nel tessuto di topo che per la colorazione del multimero HLA nel tessuto umano, deve essere utilizzata una co-colorazione delle cellule immunitarie per verificare la presenza delle specifiche cellule T antigene-reattive. Qui è stato utilizzato un anticorpo anti-CD8. Gli anticorpi, come anti-CD3 o anti-CD4, possono anche essere utilizzati a seconda della popolazione cellulare target.

1. Almeno 1 ora prima della registrazione, accendere il microscopio ed equilibrare l'incubatore sul palco a 37 °C. Fissare sul palco la capsula di Petri con fondo in vetro da 35 mm contenente la fetta. Focalizzare il microscopio impostando l'obiettivo 10x in modalità brightfield. Individua gli isolotti usando la modalità brightfield cercando ovali di colore arancio-marrone all'interno della fetta.
2. Passare il microscopio all'imaging confocale premendo il pulsante CS sul controller touch screen del microscopio. Per visualizzare gli isolotti in base alla riflettanza, accendere il rilevatore laser e PMT 638, impostare la potenza del laser tra l'1% e il 2% e disattivare i filtri notch.
   NOTA: A causa della maggiore granularità del tessuto endocrino, la luce riflessa può ora essere utilizzata per localizzare le isole. Le isole appariranno come gruppi di cellule granulari luminose su questo canale.
3. Per visualizzare il SYTOX Blue, l'anticorpo CD8 e il tetramero di insulina, verificare che la potenza del laser sia compresa tra l'1% e il 2%. Utilizzare le seguenti impostazioni per visualizzare ciascuna delle tre: per il SYTOX Blue, accendere il rilevatore laser e PMT da 405 nm; per l'anticorpo CD8, accendere il rilevatore HyD; e per visualizzare il tetramero dell'insulina, accendere il rilevatore laser e HyD da 488 nm.
4. Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse, passa all'obiettivo 20x e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte del fotogramma. Prendi una pila z dell'isolotto con una dimensione z-step di 1,5 μm. Trova le migliori sezioni ottiche (una serie da 5 a 10 sezioni) dell'isolotto in cui la maggior parte delle cellule sono vive (negativo per il SYTOX Blue) e tutte le cellule immunitarie circostanti sono a fuoco.
   NOTA: Cercare di trovare fotogrammi in cui ci sono più cellule CD8-positive e insulino-tetramero-positive che circondano o si infiltrano nell'isolotto.
5. Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT. Ottimizza le impostazioni per registrare uno Z-stack dei passaggi selezionati ogni 20 minuti per un periodo di diverse ore.
   NOTA: Se possibile, è meglio eseguire queste registrazioni in una camera di imaging in cui è possibile controllare la temperatura e i livelli di _CO2 , in particolare quando si registra per oltre quattro ore. Nel caso della registrazione notturna, l'eccesso di anticorpi può essere aggiunto al supporto per compensare il ciclo del recettore delle cellule T e lo sbiadimento del colorante. Inoltre, diversi fluorofori possono essere utilizzati per gli anticorpi delle cellule T. Sulla base dell'esperienza, gli anticorpi nella gamma rosso lontano funzionano meglio per le cellule T.

Risultati

Questo protocollo produrrà fette di tessuto pancreatico vivo adatte sia per studi di funzionalità che per registrazioni di cellule immunitarie. L'aspetto delle sezioni sia in campo luminoso che sotto la luce riflessa è mostrato nella Figura 1A,B. Come discusso, le isole possono essere trovate in fette usando la luce riflessa a causa della loro maggiore granularità che si verifica a causa del loro contenuto di insulina (Figura 1C) e sono chia...

Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione di fette di pancreas e le procedure necessarie per impiegare le fette in studi funzionali e immunologici. Ci sono molti vantaggi nell'uso di fette pancreatiche vive. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali affinché il tessuto rimanga vitale e utile durante i protocolli di esperimento descritti. È imperativo lavorare rapidamente. Il periodo di tempo tra l'iniezione del pancreas e la generazione delle fette sul vibratoma dovrebbe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Handle	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish	Corning	430591
10 mL Luer-Lok Syringe	BD	301029	BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle	BD	BD 305109	BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish	Ibidi	81156	µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe	BD	309653
8-well chambered coverglass	Ibidi	80826	µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Calcium chloride	Sigma	C5670	CaCl2
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Confocal laser-scanning microscope	Leica	SP8	Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm tissue culture dish	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	Electron Microscopy Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Ice bucket	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform	Warner Instruments	PM-1	Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave	GE	JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Paintbrush	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26	Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	20012050	To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer	Emory Tetramer Research Core	sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
Potassium chloride	Sigma	P5405	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque low melting-point agarose	Lonza	50101	To make agarose for slice generation
Slice anchor	Warner Instruments	64-1421
Slice anchor (dynamic imaging)	Warner Instruments	640253	Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma	S5886	NaCl
Sodium phosphate monohydrate	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter	Warner Instruments	SA-20MW-AL	To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator	Okolab	H201
Stereoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet	Falcon	357575	Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System	Warner Instruments	VCS-8	System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02