Un modelo animal grande para la lesión renal aguda por oclusión bilateral temporal de la arteria renal

Resumen

Este estudio presenta un modelo animal grande altamente reproducible de lesión renal de la isquemia-reperfusión en cerdos usando la obstrucción bilateral percutánea temporal del globo-catéter de las arterias renales por el minuto 60 y la reperfusión para 24 H.

Resumen

La lesión renal aguda (IRA) se asocia con un mayor riesgo de morbilidad y mortalidad postoperatoria. La lesión de la Isquemia-reperfusión (IRI) es la causa más común de AKI. Para mímico este escenario clínico, este estudio presenta un modelo animal grande altamente reproducible de IRI renal en cerdos usando la obstrucción bilateral percutánea temporal del globo-catéter de las arterias renales. Las arterias renales se ocluyen durante 60 minutos introduciendo los catéteres con balón a través de la arteria femoral y carótida y avanzándolos en la porción proximal de las arterias. El contraste yodado se inyecta en la aorta para evaluar cualquier opacificación de los vasos renales y confirmar el éxito de la oclusión de la arteria. Esto se confirma aún más por el aplanamiento de la forma de onda de pulso en la punta de los catéteres de balón. Los globos se desinflan y se quitan después del minuto 60 de la obstrucción bilateral de la arteria renal, y permiten que los animales se recuperen por 24 h. Al final del estudio, la creatinina plasmática y el nitrógeno ureico en sangre aumentan significativamente, mientras que la eGFR y la producción de orina disminuyen significativamente. La necesidad de contraste yodado es mínima y no afecta a la función renal. La oclusión bilateral de la arteria renal imita mejor el escenario clínico de hipoperfusión renal perioperatoria, y el abordaje percutáneo minimiza el impacto de la respuesta inflamatoria y el riesgo de infección observado con un abordaje abierto, como una laparotomía. La capacidad de crear y reproducir este modelo porcino clínicamente relevante facilita la traducción clínica a los seres humanos.

Introducción

La lesión renal aguda (IRA) es una afección comúnmente diagnosticada entre los pacientes quirúrgicos asociada con morbilidad y mortalidad significativa^1,2. Los datos disponibles muestran que la IRA puede afectar incluso a la mitad de todos los pacientes hospitalizados en todo el mundo y conduce a una tasa de mortalidad del 50% en los pacientes de la unidad de cuidados intensivos^1,3. A pesar de su alta prevalencia, la terapia actual con IRA sigue estando limitada a estrategias preventivas, como el manejo de líquidos y la diálisis. Por lo tanto, hay un interés continuo en explorar terapias alternativas para AKI^4,5,6.

La IRA se clasifica típicamente en prerrenal, intrínseca y postrrenal en función de su etiología^4,5,6. La mayoría de los pacientes quirúrgicos con IRA están asociados a causas prerrenales por hipovolemia, resultando en lesión por isquemia-reperfusión (IRI) de los riñones^2. Clínicamente, la producción de orina disminuye y los niveles de creatinina aumentan debido a la disminución de la función renal. El riñón es un órgano de alta tasa metabólica y susceptible a la isquemia. Es necesario un modelo animal grande altamente reproducible de IRI renal para obtener una mejor comprensión de la fisiopatología de la IRA y sus potenciales abordajes terapéuticos^5.

Para mímico el escenario clínico del hypoperfusion del riñón peri-operatively, un modelo de la obstrucción bilateral de la arteria renal se juzga conveniente. Los modelos previamente descritos que implican oclusión unilateral de la arteria renal con o sin resección del riñón contralateral no proporcionan suficiente aplicabilidad clínica^7,8. Aunque estos modelos son suficientes para causar IRA, no se asemejan a escenarios clínicos de la vida real ni en términos de tipo ni de duración de la lesión.

La puntería de este papel es presentar un modelo porcino de la obstrucción temporal bilateral percutánea de las arterias renales por la obstrucción del globo-catéter bajo angiografía. La oclusión bilateral de la arteria renal imita el escenario clínico de hipoperfusión renal, seguido de la posterior retirada del balón para la reperfusión^9,10. Se describen los pasos técnicos, incluyendo la cateterización, la dirección del catéter, la angiografía, y la supervisión hemodinámica. Este método no sólo permite una obstrucción altamente controlada y replicable de las arterias renales, pero el acercamiento percutáneo reduce al mínimo el impacto de la respuesta inflamatoria limitando la cantidad de insulto al cuerpo comparado a un acercamiento abierto.

Protocolo

Todos los estudios in vivo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Boston Children's Hospital (Protocolo 18-06-3715). Todos los animales recibieron atención humana de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La Figura 1 muestra la línea de tiempo que incluye anestesia, preparación quirúrgica y puntos de tiempo para las mediciones de resultado primarias de este estudio.

1. Inducción, anestesia e intubación

1. Para prevenir el estrés y las molestias innecesarias, seda los cerdos mediante la inyección intramuscular de una mezcla de tiletamine/zolazepam 4-6 mg/kg y xilazina 1,1-2,2 mg/kg, así como isoflurano al 3% utilizando una mascarilla.
2. Cannulate la vena del oído para obtener el acceso venoso con una cánula de 20 G IV después de desinfectar el área con etanol al 95%. Iniciar una infusión de mantenimiento (NaCl al 0,9% a 5 mL/kg/h).
3. Intubar el cerdo con un tubo endotraqueal (tamaño 7 para cerdos que pesen 40-50 kg) una vez que se confirme la adecuación anestésica. Realice la balón-ventilación con una frecuencia de 12 respiraciones/minuto y transporte el cerdo al quirófano.
4. Coloque al animal en la mesa de operaciones en decúbito supino. Inicie inmediatamente la ventilación mecánica con presión positiva con FiO₂ 0,50, 10 mL/kg de volumen corriente y una frecuencia de 12 respiraciones/min bajo capnografía continua.
5. Coloque un oxímetro de pulso en la oreja o en el labio inferior para un monitoreo continuo.
6. Mantener la normotermia (37 °C) utilizando una almohadilla calentada por aire.
7. Para mantener la anestesia general, mantenga la administración de isoflurano al 0,5-4% a través del tubo endotraqueal. A lo largo del procedimiento, controle continuamente el ECG, la presión arterial, la temperatura y la capnografía para medir la profundidad de la anestesia.
8. Inserte un catéter de Foley para verificar el estado flúido del animal y controle la producción de orina recogiendo la orina en una bolsa de drenaje.
   NOTA:Las hembras porcinas son preferidas sobre los machos debido a las características anatómicas de su uretra, lo que permite un cateterismo más fácil.

2. Preparación quirúrgica y acceso vascular

1. Envolvía al animal de forma estéril.
2. Desinfecte el área lateral derecha del cuello aplicando betadina y luego etanol al 95% durante 3 veces.
3. Realizar un corte para el cateterismo de la arteria carótida derecha y la vena yugular derecha. Retraer el músculo esternocleidomastoideo lateralmente y diseccionarlo hasta la arteria carótida derecha y la vena yugular derecha.
4. Inserte una vatina de angiografía 5F tanto en la arteria como en la vena. Asegurarlo con una sutura de seda 2-0.
5. Inserte una vaia de angiografía 5F usando la técnica de Seldinger en la arteria femoral izquierda.
   1. Para realizar la técnica de Seldinger se perfore la arteria femoral utilizando una aguja hueca. Inserte un cable guía de punta suave a través de la luz y avance hacia la arteria femoral.
   2. Sostenga el cable guía seguro con la mano mientras retira la aguja. Pase la vatina de angiografía sobre el cable guía hacia la arteria femoral y retire el cable guía. Use la guía de ultrasonido, si es necesario.

3. Inducción de lesión renal de la isquemia-reperfusión

1. Administrar 200 UI/kg de heparina sódica por vía intravenosa para lograr la anticoagulación sistémica (tiempo de coagulación activado objetivo (ACT) > 300 s).
2. Realizar una angiografía inyectando un agente de contraste yodado bajo fluoroscopia para identificar las arterias renales.
   NOTA:Para reducir el riesgo de nefrotoxicidad inducida por contraste, diluya el agente de contraste yodado en una solución 1:1 con solución salina normal. Tabular la dosis para todos los animales para asegurar una dosificación equivalente.
3. Identificar las arterias renales, avanzar manualmente el cable guía en el catéter guía.
4. Coloque el catéter guía 5F JL4 en la arteria renal izquierda a través de la arteria carótida derecha (Figura 1A).
5. Coloque el segundo catéter guía 5F JL4 en la arteria renal derecha a través de la arteria femoral izquierda (Figura 1A).
6. Utilice los cables guía para dirigir un catéter de dilatación transluminal percutánea (PTA) de 5F en cada arteria renal.
   NOTA:Es preferible colocar el balón en la arteria renal proximal para que no queden ramas o colaterales de la arteria renal patente después de la inflación del balón.
7. Coloque cada catéter con balón en su lugar y conecte una línea de presión a cada catéter.
8. Compruebe la presencia de formas de onda de pulso arterial en el monitor de presión para asegurar el posicionamiento correcto del catéter.
9. Infle cada globo y apunte a una presión de aproximadamente 2,5 atm dentro del globo (Figura 1B).
10. Para confirmar el cese del flujo sanguíneo a los riñones, observe el aplanamiento de la forma de onda del pulso en la punta del catéter con balón.
11. Inyecte un medio de contraste yodado (dilución 1:1) y compruebe si hay opacificación de los vasos renales.
    NOTA: También es posible llenar el globo con un agente de contraste yodado para la visualización del globo inflado. Sin embargo, este método no es tan sensible como el aplanamiento de la forma de onda del pulso para confirmar la oclusión de las arterias renales.
12. Después de 60 minutos de oclusión, desinflar cuidadosamente y retirar los catéteres de balón de las arterias renales.
13. Realizar una angiografía (utilizando el medio de contraste diluido 1:1) para confirmar la permeabilidad de la arteria renal y el establecimiento de reperfusión renal (Figura 1C).
14. Retire la vatina de la angiografía 5F de la arteria femoral izquierda.
15. Aplicar presión firme en el sitio de cateterismo durante 30 min.
16. Invertir el efecto de la heparina mediante la administración de protamina (3 mg/kg) hasta que act se normalice.
17. Para tomar muestras de orina durante el período postoperatorio, asegure un tubo al catéter de Foley con una sutura de seda 2-0 usando una puntada interrumpida en la piel.
18. Deje las vatinas de angiografía en la arteria carótida derecha y la vena yugular derecha en su lugar y asegure con una sutura de seda 2-0 usando una puntada interrumpida para permitir la toma de muestras de sangre durante todo el estudio.
19. Cierre la incisión del cuello con una sutura de seda 2-0 usando una puntada continua en 2 capas.
20. Administre bupivacaína (3 mg/kg) en el sitio de la incisión para minimizar el dolor.
21. Continuar hidratando al animal con NaCl al 0,9% a 5 mL/kg/h durante un total de 2 h tras el final de la isquemia.
22. Coloque un parche de fentanilo (25-50 μg/h) en la espalda del animal para minimizar el dolor postoperatorio.
23. Administre una inyección intramuscular de buprenorfina (0,005-0,1 mg/kg) para minimizar el dolor postoperatorio.
24. Monitorear al animal y mantenerlo en ventilación mecánica hasta que se desn.vigile al animal y lo mantenga en ventilación mecánica hasta que se desn.vigile al animal y mantenerlo en ventilación mecánica hasta

4. Recuperación animal

1. Después de despertarse, acomodar al animal en una habitación con temperatura controlada.
2. Continúe girando al animal de un lado lateral al otro hasta que recupere la plena conciencia y la capacidad de ambular.
3. Proporcionar agua y alimentos ad libitum.

5. Evaluación funcional

1. Recoja la sangre y las muestras de orina según el protocolo deseado.
   NOTA:En este estudio, se designaron los siguientes puntos de tiempo: basal (1 h después del inicio del protocolo de hidratación y antes de la oclusión de las arterias renales), final de la isquemia y reperfusión (2 h, 6 h, 24 h).
2. Recoger las muestras de sangre arterial y venosa. Guárdelos en vacutainers recubiertos de heparina de litio o EDTA para su posterior análisis.
   NOTA:Extraiga sangre directamente de los catéteres en la arteria carótida y la vena yugular.
3. Recoja las muestras de orina del catéter de Foley y guárdelas en tubos de 15 mL para su análisis.
   NOTA:Recoja la orina de la bolsa de drenaje conectada al catéter de Foley.
4. Para determinar la producción de orina, vacíe la bolsa de drenaje y recoja la orina durante 1 h.
   NOTA:Para el punto de tiempo de 6 h en el que una bolsa de drenaje no está conectada al catéter de Foley, cierre el tubo conectado al catéter de Foley durante 30 minutos y luego recoja la orina con una jeringa de 60 ml para determinar la producción de orina.

6. Eutanasia

1. Después del final del período de reperfusión, realice anestesia y monitoree como se describió anteriormente.
2. Continuar hidratando con NaCl al 0,9% a 5 mL/kg/h.
3. Utilice los catéteres arterial y venoso para la toma de muestras de sangre y el catéter de Foley para determinar la producción de orina. Recoja las muestras finales de sangre y orina y calcule la producción de orina.
4. Realice una incisión de laparotomía de línea media de 15 cm usando una hoja de tamaño 10 desde la xifoidea hasta la pelvis media.
5. Use un retractor lateral recto para retraer la piel abdominal.
6. Diseccione los accesorios peritoneales laterales de la pared abdominal para exponer el retroperitoneo derecho e izquierdo.
7. Identificar y diseccionar sin rodeos tanto las arterias renales como las venas.
8. Ligar tanto arterias renales como venas con una sutura de seda 2-0 y realizar nefrectomías bilaterales para recolectar muestras de tejido entero para su análisis histológico y metabólico.
9. Eutanasia del animal con el método preferido de eutanasia (por ejemplo, exsanguinación, pentobarbital)

Resultados

Análisis funcional
Los resultados representativos de este estudio surgen de 6 animales y los datos mostrados son media ± error estándar de la media. La función renal se evalúa determinando la producción de orina, la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR), la creatina plasmática y el nitrógeno ureico en sangre (BUN). Los biomarcadores de la función renal se evalúan utilizando un analizador químico portátil. eGFR se calcula según la siguiente fórmula: eGFR =1,879 × BW^1,092

Discusión

La IRA es un trastorno clínico común que afecta hasta el 50% de los pacientes adultos hospitalizados en todo el mundo^6,12. Se necesita un modelo animal clínicamente relevante para investigar más a fondo la fisiopatología de la enfermedad y las posibles dianas terapéuticas. Aunque existen varios modelos murinos que replican la IRA, estos no imitan completamente sus respectivos escenarios clínicos y la anatomía del riñón humano. Este estudio propone un mo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM