Модель крупного животного для острого повреждения почек путем временной двусторонней окклюзии почечной артерии

Резюме

В данном исследовании представлена высоковоспроизводимая крупная животная модель почечной ишемии-реперфузионного повреждения у свиней с использованием временной чрескожной двусторонней баллонно-катетерной окклюзии почечных артерий в течение 60 мин и реперфузии в течение 24 ч.

Аннотация

Острое повреждение почек (ОПН) связано с более высоким риском заболеваемости и смертности после операции. Ишемия-реперфузионный травма (ИРИ) является наиболее распространенной причиной ОКИ. Чтобы имитировать этот клинический сценарий, это исследование представляет высоковоспроизводимую модель почечного ИРИ у свиней на больших животных с использованием временной чрескожной двусторонней баллонно-катетерной окклюзии почечных артерий. Почечные артерии закупоривают в течение 60 мин путем введения баллонных катетеров через бедренную и сонную артерии и продвижения их в проксимальную часть артерий. Йодированный контраст вводится в аорту для оценки любого помутнения почечных сосудов и подтверждения успеха окклюзии артерии. Это дополнительно подтверждается сглаждение формы импульсного сигнала на кончике баллонных катетеров. Баллоны сдувают и удаляют через 60 мин двусторонней окклюзии почечной артерии, а животным дают восстановиться в течение 24 ч. В конце исследования значительно повышается креатинин плазмы и азот мочевины крови, при этом сКФ и диуреза значительно снижаются. Потребность в йодированном контрасте минимальна и не влияет на функцию почек. Двусторонняя окклюзия почечной артерии лучше имитирует клинический сценарий периоперационной почечной гипоперфузии, а чрескожный подход минимизирует влияние воспалительной реакции и риск заражения, наблюдаемый при открытом подходе, таком как лапаротомия. Способность создавать и воспроизводить эту клинически релевантную модель свиней облегчает клинический перевод на людей.

Введение

Острое повреждение почек (ОПН) является часто диагностируемым состоянием среди хирургических пациентов, связанным со значительной заболеваемостью и смертностью^1,2. Имеющиеся данные показывают, что ОКИ может поражать даже половину всех госпитализированных пациентов во всем мире и приводит к 50% смертности у пациентов в отделении интенсивной^{терапии 1,3.} Несмотря на высокую распространенность, текущая терапия ОКИ по-прежнему ограничена профилактическими стратегиями, такими как управление жидкостью и диализ. Поэтому существует постоянный интерес к изучению альтернативных методов лечения ОКИ^4,5,6.

ОПН обычно классифицируется на преретинальный, внутренний и пост-почечный на основе его этиологии^4,5,6. Большинство хирургических пациентов с ОКИ связаны с препочечниками из-за гиповолемии, что приводит к ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ) почек^2. Клинически диуреза уменьшается, а уровень креатинина увеличивается из-за снижения функции почек. Почка является органом с высокой скоростью метаболизма и восприимчива к ишемии. Высоковоспроизводимая модель почечной ИРИ на крупных животных необходима для получения лучшего представления о патофизиологии ОПН и ее потенциальных терапевтических подходах^5.

Для имитации клинического сценария периоперфузии почек периоперативно считается подходящей модель двусторонней окклюзии почечной артерии. Ранее описанные модели, влекущие за собой одностороннюю окклюзию почечной артерии с резекцией контралатеральной почки или без нее, не обеспечивают достаточной клинической применимости^7,8. Хотя этих моделей достаточно для возникновения ОКИ, они не похожи на реальные клинические сценарии ни с точки зрения типа, ни продолжительности травмы.

Целью данной работы является представление свиной модели чрескожной двусторонней временной окклюзии почечных артерий баллонно-катетерной окклюзией при ангиографии. Двусторонняя окклюзия почечной артерии имитирует клинический сценарий почечной гипоперфузии с последующим удалением баллона для реперфузии^9,10. Описаны технические этапы, включая катетеризацию, катетерное руководство, ангиографию и гемодинамический мониторинг. Этот метод не только позволяет осуществлять строго контролируемую и воспроизводимую окклюзию почечных артерий, но и чрескожный подход минимизирует влияние воспалительной реакции, ограничивая количество оскорблений для организма по сравнению с открытым подходом.

протокол

Все исследования in vivo были проведены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения по уходу за животными и их использованию и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Бостонской детской больницы (Протокол 18-06-3715). Все животные получали гуманую заботу в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию. На рисунке 1 показана временная шкала, включая анестезию, хирургическую подготовку и временные точки для измерения первичных результатов этого исследования.

1. Индукция, анестезия и интубация

1. Для предотвращения ненужного стресса и дискомфорта успокойте свиней внутримышечной инъекцией смеси тилитамина/золазепама 4-6 мг/кг и ксилазина 1,1-2,2 мг/кг, а также изофлурана 3% с помощью маски для лица.
2. Каннулировать ушную вену для получения венозного доступа с помощью канюли 20 г внутривенно после дезинфекции области 95% этанолом. Начинают поддерживающую инфузию (0,9% NaCl при 5 мл/кг/ч).
3. Интубировать свинью эндотрахеальной трубкой (размер 7 для свиней весом 40-50 кг) после подтверждения адекватности анестезии. Выполняют баллон-вентиляцию с частотой 12 вдохов/мин и транспортируют свинью в операционную.
4. Поместите животное на операционный стол в лежачем положении. Немедленно запустите механическую вентиляцию с положительным давлением с FiO₂ 0,50, приливным объемом 10 мл / кг и частотой 12 вдохов / мин при непрерывной капнографии.
5. Поместите пульсоксиметр на ухо или нижнюю губу для непрерывного мониторинга.
6. Поддерживайте нормотермию (37 °C) с помощью воздушной нагретой подушки.
7. Для поддержания общей анестезии сохраняют введение изофлурана на уровне 0,5-4% через эндотрахеальную трубку. На протяжении всей процедуры непрерывно контролируйте ЭКГ, артериальное давление, температуру и капнографию для измерения глубины анестезии.
8. Вставьте катетер Фолея, чтобы проверить состояние жидкости животного и контролировать выход мочи, собирая мочу в дренажный мешок.
   ПРИМЕЧАНИЕ:Самки свиней предпочтительнее самцов из-за анатомических особенностей их уретры, что позволяет легче катетеризацию.

2. Хирургическая подготовка и сосудистый доступ

1. Задрапировщик животного стерильным способом.
2. Дезинфицируйте правую боковую область шеи, применяя бетадин, а затем 95% этанол в течение 3 раз.
3. Выполняют разрезание для катетеризации правой сонной артерии и правой яремной веной. Втягивайте грудино-клитоплоидную мышцу латерально и рассекают ее вниз до правой сонной артерии и правой яремной вены.
4. Вставьте 5F ангиографическую оболочку как в артерию, так и в вену. Закрепите его шелковым швом 2-0.
5. Вставьте оболочку ангиографии 5F по методике Зельдингера в левую бедренную артерию.
   1. Для выполнения техники Селдингера проколоть бедренную артерию используют полую иглу. Вставьте мягкий наконечник направляющей проволоки через просвет и продвините его в бедренную артерию.
   2. Держите направляющую рукой зажатой рукой, снимая иглу. Пропустите ангиографическую оболочку через направляющую проволоку в бедренную артерию и выньте направляющую проволоку. При необходимости используйте ультразвуковое руководство.

3. Индукция почечной ишемии-реперфузионного повреждения

1. Вводят 200 МЕ/кг гепарина натрия внутривенно для достижения системной антикоагуляции (целевое время свертывания крови (ACT) > 300 с).
2. Выполните ангиографию путем введения йодированного контрастного вещества под рентгеноскопией для выявления почечных артерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ:Чтобы снизить риск контрастно-индуцированной нефротоксичности, разбавьте йодированное контрастное вещество в растворе 1:1 с нормальным физиологическим раствором. Сравняйте дозировку для всех животных, чтобы обеспечить эквивалентное дозирование.
3. Определите почечные артерии, вручную выдвините направляющую проволоку в направляющий катетер.
4. Расположите направляющий катетер 5F JL4 в левой почечной артерии через правую сонную артерию(рисунок 1A).
5. Расположите второй направляющий катетер 5F JL4 в правой почечной артерии через левую бедренную артерию(рисунок 1А).
6. Используйте направляющие провода для направления чрескожного транслюминальной ангиопластики (ПТА) дилатационного катетера 5F в каждую почечную артерию.
   ПРИМЕЧАНИЕ:Предпочтительно располагать баллон на проксимальной почечной артерии таким образом, чтобы после раздувания баллона не оставалось никаких ветвей или коллатерали почечной артерии.
7. Поместите каждый баллонный катетер на место и подключите напорную линию к каждому катетеру.
8. Проверьте наличие сигналов артериального пульса в мониторе давления, чтобы обеспечить правильное позиционирование катетера.
9. Надувайте каждый воздушный шар и стремитесь к давлению примерно 2,5 атм внутри воздушногошара (рисунок 1B).
10. Для подтверждения прекращения притока крови к почкам наблюдают уплощение пульсовой формы на кончике баллонного катетера.
11. Вводят йодированное контрастное вещество (разведение 1:1) и проверяют на помутнение почечных сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно заполнение баллона йодированным контрастным веществом для визуализации надутого баллона. Однако этот метод не так чувствителен, как уплощение пульсовой волны для подтверждения окклюзии почечных артерий.
12. После 60 мин окклюзии осторожно сдуть и удалить баллонные катетеры из почечных артерий.
13. Выполнить ангиографию (с использованием разбавленного контрастного вещества 1:1) для подтверждения проходимости почечной артерии и установления реперфузии почек(рисунок 1С).
14. Удалите оболочку ангиографии 5F из левой бедренной артерии.
15. Применяют твердое давление в месте катетеризации в течение 30 мин.
16. Обратить вспять эффект гепарина путем введения протамина (3 мг/кг) до нормализации ACT.
17. Для отбора проб мочи в послеоперационный период прикрепите трубку к катетеру Фоли шелковым швом 2-0 с помощью прерванного шва на коже.
18. Оставьте ангиографические оболочки в правой сонной артерии и правой яремной вене на месте и закрепите их шелковым швом 2-0, используя прерванный стежок, чтобы обеспечить забор крови на протяжении всего исследования.
19. Закройте разрез шеи шелковым швом 2-0 с помощью непрерывного шва в 2 слоя.
20. Вводите бупивакаин (3 мг/кг) в месте разреза, чтобы свести к минимуму боль.
21. Продолжайте гидратировать животное с 0,9% NaCl при 5 мл / кг / ч в общей сложности 2 ч после окончания ишемии.
22. Поместите фентаниловый пластырь (25-50 мкг/ч) на спину животного, чтобы свести к минимуму послеоперационную боль.
23. Ввести внутримышечную инъекцию бупренорфина (0,005-0,1 мг/кг) для минимизации послеоперационной боли.
24. Следите за животным и поддерживайте его на механической вентиляции до пробуждения.

4. Восстановление животных

1. После пробуждения разместяют животное в помещении с контролируемой температурой.
2. Продолжайте поворачивать животное с одной боковой стороны на другую, пока оно не придет в полное сознание и способность к амбулированию.
3. Обеспечьте водой и пищей ad libitum.

5. Функциональная оценка

1. Соберите образцы крови и мочи в соответствии с желаемым протоколом.
   ПРИМЕЧАНИЕ:В этом исследовании были обозначены следующие временные точки: исходный уровень (1 ч после начала протокола гидратации и до окклюзии почечных артерий), конец ишемии и реперфузия (2 ч, 6 ч, 24 ч).
2. Соберите образцы артериальной и венозной крови. Храните их в литий-гепариновом или вакутайнах с эдтаиновым покрытием для последующего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ:Забор крови непосредственно из катетеров в сонной артерии и яремной вене.
3. Соберите образцы мочи из катетера Фоли и храните их в пробирках по 15 мл для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ:Соберите мочу из дренажного мешка, подключенного к катетеру Фоли.
4. Для определения диуреза опорожняют дренажный мешок и собирают мочу в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ:В течение 6-часовой точки, в которой дренажный мешок не подключен к катетеру Фолея, закройте трубку, подключенную к катетеру Фоли, на 30 минут, а затем соберите мочу с помощью шприца 60 мл для определения диуреза.

6. Эвтаназия

1. После окончания периода реперфузии выполните анестезию и контролируйте, как описано выше.
2. Продолжайте гидратацию с 0,9% NaCl при 5 мл/кг/ч.
3. Используйте артериальные и венозные катетеры для забора крови и катетер Фолея для определения диуреза. Соберите окончательные образцы крови и мочи и рассчитайте выход мочи.
4. Выполните 15-сантиметровый разрез лапаротомии средней линии с использованием лезвия размером 10 от кифоидного до среднего таза.
5. Используйте прямой боковой втягиватель для втягивки кожи живота.
6. Рассеките боковые перитонеальные прикрепления брюшной стенки, чтобы обнажить правое и левое забрюшинное.
7. Выявляют и тупо рассеклают как почечные артерии, так и вены.
8. Обжигайте как почечные артерии, так и вены шелковым швом 2-0 и выполняйте двустороннюю нефрэктомию для сбора образцов целых тканей для гистологического и метаболического анализа.
9. Усыпить животное предпочтительным методом эвтаназии (например, экссангинация, пентобарбитал)

Результаты

Функциональный анализ
Репрезентативные результаты этого исследования получены от 6 животных, и показанные данные являются средними ± стандартной погрешности среднего значения. Функция почек оценивается путем определения диуреза, оценки скорости клубочковой фильтрации (eGF...

Обсуждение

ОКИ является распространенным клиническим расстройством, затрагивающим до 50% госпитализированных взрослых пациентов во всем мире^6,12. Клинически релевантная животная модель необходима для дальнейшего изучения патофизиологии заболевания и потенциальн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM