מודל בעלי חיים גדול לפגיעה חריפה בכליות על ידי אומת עורק כליות דו-צדדית זמנית

Summary

מחקר זה מציג מודל בעלי חיים גדול מאוד לשחזור של איסכמיה-reperfusion כליות פגיעה חזירים באמצעות בלין-צנתר בלון עורי זמני של עורקי הכליה במשך 60 דקות reperfusion עבור 24 שעות.

Abstract

פגיעה חריפה בכליות (AKI) קשורה לסיכון גבוה יותר לתחלואה ולתמותה לאחר ניתוח. פציעת איסכמיה-רפרפוזיה (IRI) היא הגורם הנפוץ ביותר של AKI. כדי לחקות תרחיש קליני זה, מחקר זה מציג מודל בעלי חיים גדול מאוד לשחזור של IRI כליות חזירים באמצעות בלינתר בלון-צנתר עורית זמנית של עורקי הכליות. עורקי הכליות חסומים למשך 60 דקות על ידי החדרת צנתרי הבלון דרך העורק הירך והתרכול וקידוםם לחלק הפרוקסימלי של העורקים. ניגודיות יוד מוזרק בבוט"ש כדי להעריך כל אטימה של כלי הכליות ולאשר את ההצלחה של החסימה בעורק. זה מאושר עוד יותר על ידי שיטוח צורת גל הדופק בקצה צנתרים הבלון. הבלונים מנוטרלים ומוסרים לאחר 60 דקות של סתירה עורק כליות דו צדדי, ובעלי החיים מורשים להתאושש במשך 24 שעות. בסוף המחקר, קריאטינין פלזמה וחנקן אוריאה בדם להגדיל באופן משמעותי, בעוד eGFR ותפוקת שתן להקטין באופן משמעותי. הצורך בניגודיות יוד הוא מינימלי ואינו משפיע על תפקוד הכלייתי. כריתת עורק הכליה הדו-צדדית מחקה טוב יותר את התרחיש הקליני של תת-פרופלוזיה כליות פריופרטיבית, והגישה העורית ממזערת את ההשפעה של התגובה הדלקתית ואת הסיכון לזיהום שנראה בגישה פתוחה, כגון לפרוסטומיה. היכולת ליצור ולשכפל מודל חזירים רלוונטי קלינית זה מקלה על התרגום הקליני לבני אדם.

Introduction

פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא מצב מאובחן בקרב חולים כירורגיים הקשורים לתחלואה ותמותה משמעותית^1,2. הנתונים הזמינים מראים כי AKI יכול להשפיע אפילו על מחצית מכלל החולים המאושפזים ברחבי העולם ומוביל לשיעור תמותה של 50% בחולים ביחידה לטיפול נמרץ^1,3. למרות שכיחותו הגבוהה, הטיפול הנוכחי ב- AKI נותר מוגבל לאסטרטגיות מניעה, כגון ניהול נוזלים ודיאליזה. לכן, יש עניין מתמשך לחקור טיפולים אלטרנטיביים עבור AKI^4,5,6.

AKI מסווג בדרך כלל טרום כליות, מהותי, ולאחר כליות מבוסס על האטיולוגיה שלה^4,5,6. רוב החולים הכירורגיים עם AKI קשורים לגורמים טרום כליות עקב היפובולמיה, וכתוצאה מכך פגיעה איסכמיה-reperfusion (IRI) של הכליות². מבחינה קלינית, תפוקת השתן פוחתת, ורמות קריאטינין להגדיל עקב ירידה בתפקוד הכלייתי. הכליה היא איבר בעל קצב חילוף חומרים גבוה ורגיש לאיסכמיה. מודל בעלי חיים גדול מאוד לשחזור של IRI כליות יש צורך להשיג תובנה טובה יותר לתוך הפתופיזיולוגיה של AKI ואת הגישות הטיפוליות הפוטנציאליות שלה⁵.

כדי לחקות את התרחיש הקליני של hypoperfusion כליות peri-operatively, מודל של נעילת עורק כליות דו צדדי נחשב מתאים. מודלים שתוארו בעבר הכרוכים בחסימה חד-צדדית של עורק הכליה עם או בלי כריתה של הכליה הנגדית אינם מספקים ישימות קלינית מספקת^7,8. למרות מודלים אלה מספיקים לגרימת AKI, הם אינם דומים תרחישים קליניים בחיים האמיתיים לא במונחים של סוג ולא משך של פגיעה.

מטרתו של נייר זה היא להציג מודל חזירי של חסימה זמנית דו-צדדית עורית של עורקי הכליה על ידי חסימת צנתר בלון תחת אנגיוגרפיה. אותיקה עורק כליות דו צדדי מחקה את התרחיש הקליני של hypoperfusion כליות, ואחריו הסרה מאוחרת יותר של הבלון עבור reperfusion^9,10. השלבים הטכניים מתוארים, כולל צנתור, הדרכת צנתר, אנגיוגרפיה וניטור המודינמי. שיטה זו לא רק מאפשרת חסם מבוקר מאוד לשכפול של עורקי הכליות, אלא הגישה העורית ממזערת את ההשפעה של התגובה הדלקתית על ידי הגבלת כמות העלבון לגוף בהשוואה לגישה פתוחה.

Protocol

כל המחקרים נערכו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות בנושא טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים לילדים בבוסטון (פרוטוקול 18-06-3715). כל בעלי החיים קיבלו טיפול אנושי בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. איור 1 מציג את ציר הזמן הכולל הרדמה, הכנה כירורגית ונקודות זמן למדידות התוצאה העיקריות של מחקר זה.

1. אינדוקציה, הרדמה וצנרר

1. כדי למנוע מתחים ואי נוחות מיותרים, לרדם את החזיר על ידי הזרקה תוך שרירית של תערובת של tiletamine/zolazepam 4-6 מ"ג/ק"ג וקסילאצין 1.1-2.2 מ"ג/ק"ג, כמו גם איזופלוראן 3% באמצעות מסכת פנים.
2. ניתן לתמצת את וריד האוזן כדי לקבל גישה ורידית עם צינורית 20 G IV לאחר חיטוי האזור עם 95% אתנול. התחל עירוי תחזוקה (0.9% NaCl ב 5 מ"ל / קילוגרם / שעה).
3. צנרר את החזיר עם צינור אנדוטראצ'אל (גודל 7 עבור חזירים במשקל 40-50 ק"ג) לאחר התאוות הרדמה מאושרת. לבצע אוורור בלון בתדירות של 12 נשימות / דקות ולהעביר את החזיר לחדר הניתוח.
4. הנח את החיה על שולחן הניתוחים בתנוחה העגולה. מיד להתחיל אוורור לחץ חיובי מכני עם FiO₂ 0.50, 10 מ"ל / קילוגרם נפח גאות ושפל, ותדירות של 12 נשימות / דקה תחת קנוגרפיה רציפה.
5. מניחים אוקסימטר דופק על האוזן או על השפה התחתונה לניטור רציף.
6. שמור על נורמוטריה (37 °C (37 °F) באמצעות כרית מחוממת אוויר.
7. כדי לשמור על הרדמה כללית, לשמור על ניהול איזופלוריין ב 0.5-4% דרך הצינור אנדוטראצ'אל. לאורך כל ההליך, לפקח ברציפות אק"ג, לחץ דם עורקי, טמפרטורה, קנוגרפיה כדי למדוד את עומק ההרדמה.
8. הכנס קטטר פולי כדי לבדוק את מצב הנוזל של החיה ולעקוב אחר תפוקת השתן על ידי איסוף שתן בשקית ניקוז.
   הערה:חזירים נקבות עדיפים על פני זכרים בשל התכונות האנטומיות של השופכה שלהם המאפשר צנתור קל יותר.

2. הכנה כירורגית וגישה לכלי הדם

1. לעטוף את החיה בצורה סטרילית.
2. לחטא את האזור לרוחב הימני של הצוואר על ידי החלת betadine ולאחר מכן 95% אתנול עבור 3 פעמים.
3. בצע חתך עבור הצנתור של העורק הראשי הנכון ואת הווריד הצוואר הימני. לסגת השריר sternocleidomastoid לרוחב ולנתק אותו עד העורק הראשי הימני ואת הווריד הצוואר הימני.
4. הכנס נדן אנגיוגרפיה 5F הן בעורק והן בווריד. אבטחו אותו עם תבר משי 2-0.
5. הכנס נדן אנגיוגרפיה 5F באמצעות טכניקת סלדינגר לתוך עורק הירך השמאלי.
   1. כדי לבצע את טכניקת סלדינגר לנקב את עורק הירך באמצעות מחט חלולה. הכנס מדריך קצה רך דרך הלומן ולקדם אותו לתוך עורק הירך.
   2. החזק את חוט המדריך מאובטח עם היד תוך הסרת המחט. מעבירים את נדן האנגיוגרפיה מעל המדריך לעורק הירך ונסוגים את חוט המדריך. השתמש הדרכת אולטרסאונד, במידת הצורך.

3. אינדוקציה של פציעת איסכמיה-רפרפוזיה כליות

1. יש לנהל 200 IU/kg נתרן הפרין תוך ורידי כדי להשיג קרישה מערכתית (זמן קרישה מופעל היעד (ACT) > 300 s).
2. בצע אנגיוגרפיה על ידי הזרקת סוכן ניגוד יוד תחת פלואורוסקופיה כדי לזהות את עורקי הכליות.
   הערה: כדי להפחית את הסיכון לנפרוטוקסיות הנגרמת על ידי ניגודיות, לדלל את חומר הניגודיות יוד בתמיסה 1:1 עם תמיסת מלח רגילה. Tabulate המינון עבור כל בעלי החיים כדי להבטיח מינון שווה ערך.
3. זהה את עורקי הכליה, לקדם באופן ידני את מדריך בצנתר המנחה.
4. מקם את הצנתר המנחה 5F JL4 בעורק הכליה השמאלי דרך העורק הראשי הימני(איור 1A).
5. מקם את הצנתר המנחה השני של 5F JL4 בעורק הכליות הימני דרך עורק הירך השמאלי(איור 1A).
6. השתמש במדריך כדי לכוון צנתר ההרחבה של אנגיופלסטיקה טרנסלומינלית (PTA) 5F לכל עורק כליות.
   הערה: עדיף למקם את הבלון בעורק הכליות הפרוקסימלי כך שלא נותרו ענפים או בטחונות של עורק הכליה לאחר אינפלציית הבלונים.
7. מקם כל קטטר בלון במקום וחבר קו לחץ לכל קטטר.
8. בדוק את נוכחותם של צורות גל דופק עורקי בצג הלחץ כדי להבטיח את המיקום הנכון של הצנתר.
9. לנפח כל בלון ולכוון ללחץ של כ 2.5 קמ"ש בתוך הבלון(איור 1B).
10. כדי לאשר את הפסקת זרימת הדם לכליות להתבונן שיטוח של צורת גל הדופק בקצה צנתר הבלון.
11. הזריקו מדיום ניגודיות יוד (דילול 1:1) ובדקו אם יש אטימות של כלי הכליה.
    הערה: ניתן גם למלא את הבלון עם סוכן ניגודיות יוד להדמיה של הבלון המנופח. עם זאת, שיטה זו אינה רגישה כמו שיטוח צורת גל הדופק כדי לאשר את החסימה של עורקי הכליות.
12. לאחר 60 דקות של חסם, בזהירות לנפח ולהסיר את צנתרים הבלון מן העורקים הכליות.
13. בצע אנגיוגרפיה (באמצעות בינוני ניגודיות מדוללת 1:1) כדי לאשר טפיחה בעורק הכליות והקמת רפרפוזיה כליות(איור 1C).
14. הסר את נדן אנגיוגרפיה 5F מעורק הירך השמאלי.
15. החל לחץ מוצק באתר של צנתור במשך 30 דקות.
16. הפוך את ההשפעה של הפרין על ידי הממשל של פרוטמין (3 מ"ג/ קילוגרם) עד ACT מנרמל.
17. כדי לדגום שתן במהלך התקופה שלאחר הניתוח, לאבטח צינור צנתר פולי עם תפר משי 2-0 באמצעות תפר מופרע על העור.
18. השאירו את נדן האנגיוגרפיה בעורק הראשי הימני וריד הצוואר הימני במקום ואבטחו אותם עם תפר משי 2-0 באמצעות תפר מופרע כדי לאפשר דגימת דם לאורך המחקר.
19. סוגרים את חתכת הצוואר בתפר משי 2-0 באמצעות תפר רציף ב-2 שכבות.
20. יש לנהל bupivacaine (3 מ"ג/ק"ג) באתר ההסתה כדי למזער את הכאב.
21. המשך לחות החיה עם 0.9% NaCl ב 5 מ"ל / קילוגרם / שעה בסך הכל 2 שעות לאחר סוף איסכמיה.
22. מניחים מדבקת פנטניל (25-50 מיקרוגרם/שעה) על גב החיה כדי למזער כאב לאחר הניתוח.
23. לנהל זריקה תוך שרירית של buprenorphine (0.005-0.1 מ"ג/ק"ג) כדי למזער את הכאב לאחר הניתוח.
24. לפקח על החיה ולשמור אותו על אוורור מכני עד לעורר.

4. התאוששות בעלי חיים

1. לאחר ההתעוררות, יש לארח את החיה בחדר מבוקר טמפרטורה.
2. המשיכו להפוך את החיה מצד רוחבי אחד לשני עד שהיא חוזרת להכרה מלאה וליכולת לטבול.
3. לספק מים ומזון ad libitum.

5. הערכה פונקציונלית

1. לאסוף את הדם ואת דגימות השתן על פי הפרוטוקול הרצוי.
   הערה: במחקר זה, נקודות הזמן הבאות הוגדרו: בסיסי (1 שעות לאחר תחילת פרוטוקול הידרציה ולפני החסימה של עורקי הכליה), סוף איסכמיה, ורפרפוזיה (2 שעות, 6 שעות, 24 שעות).
2. לאסוף את דגימות הדם ורידים. לאחסן אותם ליתיום הפרין או EDTA מצופה vacutainers לניתוח הבא.
   הערה: שאב דם ישירות מהקטטרים בעורק הראשי וריד הצוואר.
3. לאסוף את דגימות השתן מן קטטר פולי ולאחסן אותם בצינורות 15 mL לניתוח.
   הערה:לאסוף את השתן משקית הניקוז מחובר קטטר פולי.
4. כדי לקבוע את תפוקת השתן, לרוקן את שקית הניקוז ולאסוף שתן במשך 1 שעה.
   הערה: עבור נקודת הזמן 6 h שבה שקית ניקוז אינה מחוברת קטטר פולי, לסגור את הצינור מחובר קטטר פולי במשך 30 דקות ולאחר מכן לאסוף את השתן עם מזרק 60 מ"ל כדי לקבוע את תפוקת השתן.

6. המתת חסד

1. לאחר תום תקופת ההפרטה, בצע הרדמה ונטר כמתואר לעיל.
2. המשך הידרציה עם 0.9% NaCl ב 5 מ"ל / קילוגרם / שעה.
3. השתמש בקטטרים העורקיים והווריריים לדגימה בדם ובקטטר פולי כדי לקבוע את תפוקת השתן. לאסוף את דגימות הדם והשתן הסופי ולחשב את תפוקת השתן.
4. בצע 15 ס"מ 15 ס"מ תיקון לפרוסטומיה בקו האמצע באמצעות להב בגודל 10 מן xiphoid עד לאגן האמצעי.
5. השתמש מפסק לרוחב ישר כדי לבטל את עור הבטן.
6. לנתח את ההחזקות לרוחב צפק של דופן הבטן כדי לחשוף את retroperitoneum ימין ושמאל.
7. זהה ותתחו בבוטות גם עורקי כליות וגם ורידים.
8. ליגת הן עורקי כליות והן ורידים עם תפירת משי 2-0 ולבצע כריתת נפרקטומיות דו-צדדיות כדי לאסוף דגימות רקמות שלמות לניתוח היסתולוגי ומטבולי.
9. המתת חסד את החיה בשיטה המועדפת של המתת חסד (למשל, דממה, פנטוברביטל)

תוצאות

ניתוח פונקציונלי
התוצאות הייצוגיות של מחקר זה נובעות מ -6 בעלי חיים והנתונים המוצגים הם ממוצעים ± הטעות הסטנדרטית של הממוצע. תפקוד הכלייתי מוערך על ידי קביעת תפוקת השתן, קצב סינון גלומרולרי משוער (eGFR), קריאטין פלזמה, וחנקן אוריאה בדם (BUN). סמנים ביולוגיים של תפקוד הכליות מוערכים בא...

Discussion

AKI היא הפרעה קלינית נפוצה המשפיעה על עד 50% מהחולים הבוגרים המאושפזים ברחבי העולם^6,12. מודל בעלי חיים רלוונטי קלינית נדרש כדי לחקור עוד יותר את הפתופיזיולוגיה של המחלה ויעדים טיפוליים פוטנציאליים. למרות שישנם מספר מודלים מורים המשכפלים AKI, אלה אינם מחקים לחלוט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM