Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Resumen

Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.

Resumen

El diagnóstico de la actual pandemia de SARS-CoV-2 es una prioridad para todos los países del mundo. Actualmente, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es el estándar de oro para el diagnóstico del SARS-CoV-2, ya que no hay una solución permanente disponible. Por muy efectiva que pueda ser esta técnica, han surgido investigaciones que muestran sus limitaciones en la detección y el diagnóstico, especialmente cuando se trata de objetivos poco abundantes. Por el contrario, se ha demostrado que la PCR digital por gotas (ddPCR), una tecnología emergente reciente con ventajas superiores a la qPCR, supera los desafíos de la RT-qPCR en el diagnóstico del SARS-CoV-2 a partir de muestras objetivo poco abundantes. Prospectivamente, en este artículo, las capacidades de RT-ddPCR se amplían aún más al mostrar los pasos sobre cómo desarrollar ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruples utilizando un sistema de detección de dos colores. Usando cebadores y sondas dirigidas a sitios específicos del genoma del SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 y RBD2), se demuestra que el desarrollo de estos ensayos es posible. Además, se proporcionan protocolos detallados paso a paso, notas y sugerencias sobre cómo mejorar el flujo de trabajo de ensayos y analizar datos. La adaptación de este flujo de trabajo en trabajos futuros garantizará que el número máximo de objetivos se pueda detectar con sensibilidad en una muestra pequeña, lo que mejorará significativamente el costo y el rendimiento de la muestra.

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica bien reconocida, ha sufrido varias transformaciones desde su advenimiento para convertirse en una técnica poderosa capaz de proporcionar respuestas a la investigación de ácidos nucleicos. Estas transformaciones han sido una mejora constante de la vieja técnica. Estas transformaciones se pueden resumir en tres generaciones¹. La primera generación es la PCR convencional que se basa en la electroforesis en gel para cuantificar y detectar objetivos amplificados. La segunda generación es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que puede detectar muestras en tiempo real y basarse en una curv....

Protocolo

Declaración ética
El Instituto de Virología de Wuhan (WHIOV) se encuentra entre los laboratorios e institutos aprobados por los CDC de China de la ciudad de Wuhan para realizar investigaciones sobre el SARS-CoV-2 y detectar COVID-19 a partir de muestras clínicas. La investigación sobre el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico para COVID-19 utilizando muestras clínicas también ha sido aprobada por el comité ético del Instituto de Virología de Wuhan (2020FCA001).

1. Flujo de trabajo de procesamiento de muestras (Figura 1A)

NOTA: En todo el protocolo, es importa....

Resultados

En un estudio de prueba de concepto, el rendimiento analítico de los ensayos multiplex se probó en muestras clínicas y de investigación¹⁹. El rendimiento de los ensayos multiplex fue superior al de una RT-PCR¹⁹. Dado que un número bajo de gotitas puede indicar un problema durante la generación de gotas, en este artículo se estableció un límite de 10,000 gotas por pocillo basado en datos empíricos.

Una buena separación entre gotas posit.......

Discusión

Hay pocos recursos disponibles sobre cómo desarrollar ensayos RT-ddPCR para la detección del SARS-CoV-2. Aunque no se utiliza en este artículo, las muestras estándar con copias conocidas se pueden utilizar para desarrollar y optimizar ensayos. Sin embargo, en este trabajo, las muestras de SARS-CoV-2 cultivadas en células Vero-E6 se enriquecieron en un fondo de ARN genómico humano y se utilizaron como muestras estándar para desarrollar los ensayos. Las secuencias adecuadas de cebadores y sondas son esenciales al de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation