Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Resumen

Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.

Resumen

El diagnóstico de la actual pandemia de SARS-CoV-2 es una prioridad para todos los países del mundo. Actualmente, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es el estándar de oro para el diagnóstico del SARS-CoV-2, ya que no hay una solución permanente disponible. Por muy efectiva que pueda ser esta técnica, han surgido investigaciones que muestran sus limitaciones en la detección y el diagnóstico, especialmente cuando se trata de objetivos poco abundantes. Por el contrario, se ha demostrado que la PCR digital por gotas (ddPCR), una tecnología emergente reciente con ventajas superiores a la qPCR, supera los desafíos de la RT-qPCR en el diagnóstico del SARS-CoV-2 a partir de muestras objetivo poco abundantes. Prospectivamente, en este artículo, las capacidades de RT-ddPCR se amplían aún más al mostrar los pasos sobre cómo desarrollar ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruples utilizando un sistema de detección de dos colores. Usando cebadores y sondas dirigidas a sitios específicos del genoma del SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 y RBD2), se demuestra que el desarrollo de estos ensayos es posible. Además, se proporcionan protocolos detallados paso a paso, notas y sugerencias sobre cómo mejorar el flujo de trabajo de ensayos y analizar datos. La adaptación de este flujo de trabajo en trabajos futuros garantizará que el número máximo de objetivos se pueda detectar con sensibilidad en una muestra pequeña, lo que mejorará significativamente el costo y el rendimiento de la muestra.

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica bien reconocida, ha sufrido varias transformaciones desde su advenimiento para convertirse en una técnica poderosa capaz de proporcionar respuestas a la investigación de ácidos nucleicos. Estas transformaciones han sido una mejora constante de la vieja técnica. Estas transformaciones se pueden resumir en tres generaciones¹. La primera generación es la PCR convencional que se basa en la electroforesis en gel para cuantificar y detectar objetivos amplificados. La segunda generación es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que puede detectar muestras en tiempo real y basarse en una curva estándar para cuantificar directamente los objetivos en una muestra. La tercera generación, la PCR digital (dPCR), puede realizar tanto la detección como la cuantificación absoluta de objetivos de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La dPCR también se ha mejorado aún más a partir de cámaras de reacción separadas por los pozos de una pared en emulsiones de aceite, agua y productos químicos estabilizadores dentro del mismo pozo, como se ve en la^{PCR digital} 2 basada en gotas. En la PCR digital de gotas (ddPCR), una muestra se divide en miles de gotas de tamaño nanolitro que contienen objetivos individuales que luego se cuantificarán utilizando las estadísticas de Poisson ^2,3,4. Esta técnica le da a ddPCR una ventaja en la cuantificación de objetivos poco abundantes en comparación con las otras generaciones de PCR.

Recientemente, múltiples aplicaciones han puesto de relieve la superioridad de la ddPCR sobre la qPCR comúnmente utilizada al detectar y cuantificar objetivos de baja abundancia ^1,5,6. El SARS-CoV-2 no es una excepción a estas aplicaciones 7,8,9,10,11,12. Desde el brote de SARS-CoV-2, los científicos han estado trabajando en todos los frentes para encontrar soluciones sobre cómo diagnosticar el virus y detectarlo de manera eficiente. El estándar de oro actual sigue siendo qPCR¹³. Sin embargo, se ha demostrado que la RT-ddPCR es más precisa en la detección de objetivos de SARS-CoV-2 de baja abundancia tanto en muestras ambientales como clínicas en comparación con RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La mayoría de los trabajos publicados de ddPCR del SARS-CoV-2 dependen de ensayos simples, y los multiplexores dependen de ensayos comerciales. Por lo tanto, se debe hacer más para explicar cómo desarrollar ensayos RT-dPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2.

En un diseño de ensayo adecuado, la multiplexación se puede utilizar para ahorrar costos, aumentar el rendimiento de la muestra y maximizar el número de objetivos que se pueden detectar con sensibilidad dentro de una muestra pequeña. Al multiplexar con ddPCR, se debe tener en cuenta cuántos fluoróforos se pueden detectar en un sistema en particular. Algunas plataformas ddPCR pueden admitir hasta tres canales, mientras que otras solo admiten dos canales. Por lo tanto, cuando se multiplexa con dos canales, uno tiene que usar diferentes enfoques, incluida la multiplexación de orden superior para detectar más de dos objetivos^14,15,16. En este trabajo, se utiliza un sistema de detección ddPCR de dos colores para mostrar los pasos sobre cómo desarrollar diferentes ensayos RT-ddPCR del SARS-CoV-2 que se pueden adaptar para diferentes aplicaciones de investigación.

Protocolo

Declaración ética
El Instituto de Virología de Wuhan (WHIOV) se encuentra entre los laboratorios e institutos aprobados por los CDC de China de la ciudad de Wuhan para realizar investigaciones sobre el SARS-CoV-2 y detectar COVID-19 a partir de muestras clínicas. La investigación sobre el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico para COVID-19 utilizando muestras clínicas también ha sido aprobada por el comité ético del Instituto de Virología de Wuhan (2020FCA001).

1. Flujo de trabajo de procesamiento de muestras (Figura 1A)

NOTA: En todo el protocolo, es importante utilizar salas separadas con pipetas dedicadas para la manipulación de muestras (extracción y almacenamiento), preparación y almacenamiento de reactivos/mastermix, preparación de mezclas de reacción (muestra más mastermix) y detección, para evitar la contaminación cruzada. Los ensayos a desarrollar se pueden utilizar en la detección de muestras clínicas o muestras de investigación. Todas las muestras deben tratarse como si pudieran transmitir agentes infecciosos, incluso cuando se utilizan procedimientos de laboratorio seguros. Los pasos de procesamiento de muestras deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) siguiendo las estrictas reglas BSL-2, incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado.

1. Inactivación de la muestra
   1. Lleve 1 ml de muestra de SARS-CoV-2 a un laboratorio BSL-2. Inactivar las muestras por calor a 65 °C durante 30 min.
      NOTA: Las muestras pueden provenir de varias fuentes, por lo tanto, uno debe asegurarse de que el volumen a inactivar sea suficiente para asegurar la extracción posterior de ARN. La mayoría de los kits de extracción requieren un pequeño volumen de muestra de hasta 200 μL, por lo tanto, un volumen de muestra de aproximadamente 1 ml sería suficiente para la inactivación. Los surfactantes, kits y tampones de lisis también se pueden usar para la inactivación directa y la extracción de ARN de acuerdo con el propio POE de laboratorio.
   2. Lleve las muestras a un gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelas reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que los aerosoles potenciales se asienten. Almacenar las muestras a 4 °C durante un máximo de 24 h si no se procesan inmediatamente.
      NOTA: No se requiere ningún contenedor específico para el almacenamiento de muestras. Las muestras pueden almacenarse en los tubos o recipientes utilizados durante la inactivación. Para este trabajo, la mayoría de las muestras se almacenaron en tubos de medios de transporte viral (VTM) o tubos de 1,5 ml.
2. Extracción de ARN
   NOTA: Muchos instrumentos y kits de extracción de ARN con protocolos específicos están disponibles para su uso inmediato. Aquí, se presenta un procedimiento automatizado siguiendo las instrucciones del fabricante.
   1. Saque la placa de orificio de pozo precargada de 96 profundidades; Invierta suavemente boca abajo para mezclar las perlas magnéticas. Después de mezclar, agite suavemente la placa sobre una superficie plana para concentrar el reactivo y las perlas magnéticas que puedan estar en la pared hasta la parte inferior de la placa.
   2. Arranque con cuidado la película de sellado de papel de aluminio para evitar la vibración de la placa y el derrame de líquido. Añadir 20 μL de proteinasa K y 200 μL de la muestra por pocillo en las filas 2 y 8 de la placa de 96 pocillos. Luego, coloque la placa de 96 pocillos en la base del instrumento automático de extracción automática de ácidos nucleicos de 32 canales.
      Nota : ejecute el programa en el equipo dentro de 1 h después de agregar el ejemplo.
   3. Inserte la funda de la barra magnética en la ranura para tarjetas del instrumento de extracción automática de ácidos nucleicos de 32 canales. Seleccione el programa GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (versión rápida) y ejecútelo.
   4. Una vez completada la extracción, extraer las muestras de ácido nucleico en las filas 6 y 12 (aproximadamente 100 μL/muestra) y distribuir en una placa limpia de 96 pocillos libre de nucleasas. Conservar las muestras a 4 °C durante un máximo de 24 h hasta su uso o a -20 °C durante más tiempo.
      NOTA: Se recomienda utilizar una pipeta multicanal de 100 μL para transferir muestras a una nueva placa de 100-200 μL, ya que puede coincidir directamente con las columnas de la placa de muestra.
3. Generación de ADNc
   NOTA: Para muestras almacenadas durante mucho tiempo, evite múltiples ciclos de congelación/descongelación. Realice la generación de ADNc utilizando un kit de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante.
   1. En un tubo de PCR de 100 o 200 μL colocado sobre hielo/bloque de enfriamiento, agregue 2 μL de mezcla maestra 5x RT (por ejemplo, Perfect Real Time), 5 μL de ARN de muestra y 3 μL de ddH2O libre de RNasa por reacción (volumen total 10 μL).
   2. Coloque el tubo de PCR en un termociclador configurado para funcionar a 37 °C durante 15 min (transcripción inversa), 85 °C durante 5 s (inactivación térmica de la transcriptasa inversa) y 4 °C durante un tiempo infinito.
      NOTA: Procese las muestras inmediatamente o guárdelas a 4 °C durante un máximo de 24 h hasta su uso o a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

2. Optimización del ensayo y flujo de trabajo de ddPCR

NOTA: Optimice los ensayos antes/después de leer las gotas. Dependiendo de los resultados, se pueden optimizar en cualquier punto del trabajo para lograr mejores resultados. A continuación se presentan algunos factores comunes a considerar al optimizar los experimentos de ddPCR.

1. Validar los cebadores y sondas ddPCR (Tabla 1).
   NOTA: Los cebadores ORF1ab y N fueron adaptados de China CDC¹⁷, el gen de control endógeno humano (RPP30) de Lu et al.18, y RBD2 de Nyaruaba et ^al.13. Todos los cebadores y sondas, excepto RBD2, ya habían sido probados y optimizados por ddPCR 7,8,18.
2. Ejecute los controles de muestra de prueba ddPCR que comprenden un control positivo (una muestra con los cuatro objetivos), Sin control de plantilla (NTC; Agua libre de nucleasa o muestra sin objetivos), y extracción/control negativo (ácido nucleico total extraído de una célula humana cultivada no infecciosa o muestras agrupadas de voluntarios sanitarios).
   NOTA: Se prefieren las muestras de control estándar con copias conocidas de genes diana. Sin embargo, en ausencia de estándares, utilice las muestras disponibles para definir sus controles o matriz de muestras. Ejecute los controles junto con muestras de prueba.
3. Optimice la temperatura de recocido (Figura 2D) insertando un gradiente de temperatura de 55 °C a 65 °C en la etapa de recocido de la PCR (paso 3.2).
   NOTA: La optimización de la temperatura de recocido ayuda a encontrar la mejor temperatura donde la separación de gotas es máxima (fácil identificación del objetivo) con una lluvia mínima. Después de obtener los resultados, reduzca el rango de temperatura para una mejor optimización, por ejemplo, de 55 °C a 60 °C.
4. Optimice las concentraciones de cebador y sonda. Si no se logra una separación óptima entre gotitas positivas y negativas en los ensayos, varíe las concentraciones de cebador (300-900 nM) y/o sonda (100-400 nM).
   NOTA: La reducción de las concentraciones de cebador/sonda da como resultado una menor amplitud de gota objetivo y aumentarla también aumenta la amplitud del objetivo. Esto puede ser útil en la multiplexación basada en amplitud.
5. Pruebe la sensibilidad analítica teniendo en cuenta diferentes parámetros, incluidos, límite de espacio en blanco (LoB), límite de detección (LoD), especificidad y sensibilidad utilizando muestras estándar y de prueba, según se prefiera.

3. flujo de trabajo de ddPCR (Figura 1B) y desarrollo del ensayo (Tabla 2)

NOTA: Al igual que otros sistemas de detección de ddPCR, este flujo de trabajo también consta de cuatro pasos (Figura 1B), que incluyen la preparación de la mezcla de reacción, la generación de gotas, la amplificación por PCR y la lectura de gotas.

1. Preparación de la mezcla de reacción
   NOTA: Prepare todos los ensayos en una habitación limpia y separada y dentro de un BSC. Observe las precauciones estándar, incluido el uso de guantes limpios, pipetas limpias, agua libre de nucleasas y desinfectantes. Reactivos alícuotas en tubos separados y almacenar a -20 ^oC para evitar ciclos repetidos de descongelación por congelación. Prepare los ensayos como se muestra en la Tabla 2. Las soluciones madre de cebador y sonda deben almacenarse en altas concentraciones de 100 μM. Las soluciones de trabajo pueden almacenarse en alícuotas de 20-40 μM (diluidas en agua libre de nucleasas).
   1. Pasos comunes en todos los ensayos
      NOTA: Antes de preparar los ensayos, calcule el volumen total de mastermix necesario en función del número de muestras. Aquí, cada volumen de componente de mastermix se multiplicó por 1,05 para tener en cuenta cualquier error de pipeteo.
      1. Descongelar y equilibrar los materiales de reacción a temperatura ambiente. Vortex los componentes de las reacciones brevemente (30 s) para asegurar la homogeneidad, y centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.
      2. Prepare una mezcla de cebador-sonda (PP) por ensayo mezclando volúmenes de reacción específicos como se detalla en la Tabla 2 de las soluciones de trabajo.
      3. Prepare la mezcla maestra mezclando 11 μL (1x) de supermezcla 2x ddPCR para sondas (sin dUTP), mezcla de PP (dependiendo del ensayo como se muestra en la Tabla 2 de la solución de trabajo) y agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 19.8 μL por pocillo. Distribuya la mezcla maestra en los pocillos de una placa ddPCR de 96 pocillos libre de nucleasas en función del número de muestras.
         NOTA: Para la placa de muestra, asegúrese de que los 8 pocillos en una columna tengan la solución. Si solo se usan unos pocos pozos, por ejemplo, 5 muestras, llene los otros 3 pocillos con 22 μL de agua libre de nucleasas o controle cada uno.
      4. Para obtener el volumen de la mezcla de reacción final (22 μL), agregue 2.2 μL de muestra de ADNc por pocillo que contenga mastermix. Selle la placa con un sellador de placas de PCR desechable.
         NOTA: Realice las adiciones de muestra en la sala designada. Incluya los controles, es decir, positivo, NTC y extracción. Además, si las muestras de ARN son de baja concentración, reduzca el volumen de agua en la mezcla maestra y aumente el volumen de la muestra en consecuencia hasta 5,5 uL.
      5. Una vez que la mezcla de reacción se distribuye por pozo, vórtice brevemente (15-30 s) y centrifuga (10-15 s) para recoger el contenido en el fondo de la placa. Proceda a la generación de gotas.
2. Generación automatizada de gotas (Figura suplementaria 1)
   NOTA: Se pueden utilizar diferentes generadores de gotas; sin embargo, este estudio se realizó con un generador automático de gotas (AutoDG). Para evitar la contaminación del amplicón, asegúrese de que el generador de gotas y los lectores tengan espacio dedicado en áreas separadas. Al cargar consumibles, se recomienda comenzar a cargar desde la parte posterior del instrumento trabajando hacia el frente para evitar mover las manos sobre los consumibles para evitar la contaminación cruzada.
   1. Obtenga todos los consumibles necesarios para configurar el AutoDG, incluido el aceite AutoDG para sondas, los cartuchos DG32, las puntas de pipeta, el bloque de refrigeración, la placa de muestra, la placa de gotas (nueva placa ddPCR limpia) y un contenedor de basura.
   2. En la pantalla táctil de AutoDG, toque Configurar placa de muestra y seleccione las columnas donde se encuentran las muestras en la placa de muestra y pulse OK.
      NOTA: La pantalla se volverá amarilla indicando LOAD donde se deben cargar los consumibles.
   3. Abra la puerta de AutoDG y cargue los consumibles en sus respectivos lugares.
      NOTA: Los respectivos lugares donde se deben cargar los consumibles tendrán un indicador amarillo que luego se volverá verde si se cargan los consumibles. Esto es similar a la pantalla táctil.
   4. Cargue la placa de muestra y la placa de generación de gotas.
      NOTA: La placa de generación de gotas debe colocarse en el bloque de enfriamiento. Asegúrese de que el bloque de enfriamiento sea púrpura (listo para usar) y no rosa (debe mantenerse en un congelador hasta que el color vuelva a ser púrpura).
   5. Cierre la puerta de AutoDG, asegúrese de que la pantalla esté verde (consumibles cargados) y seleccione/asegúrese de que el tipo de aceite sea Aceite para sondas antes de pulsar Iniciar generación de gotas.
   6. Espere a que se generen las gotas. Abra la puerta una vez que la pantalla muestre Droplets Ready y retire la placa que contiene las gotas.
   7. Selle la placa con un sello de lámina perforable utilizando un sellador de placas configurado para funcionar a 185 ^oC durante 5 s. Proceda a la amplificación por PCR.
      NOTA: La amplificación por PCR debe iniciarse dentro de los 30 minutos posteriores a la generación de gotas.
3. Amplificación por PCR
   1. Inserte la placa de gotas sellada en un termociclador de pozo de 96 profundidades, ajuste el volumen de muestra a 40 μL y la temperatura de la tapa a 105 °C.
   2. La PCR amplifica las gotitas utilizando el programa: 95 °C durante 10 min (activación enzimática), 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s y 1 min de recocido/extensión a 57 °C, desactivación enzimática a 98 °C durante 10 min, y paso de retención a 4 °C indefinidamente. Después de la PCR, leer las gotitas o almacenar a 4 °C durante un máximo de 24 h.
      NOTA: Utilice una velocidad de rampa de 2 °C / s en todos los pasos, ya que las tasas de rampa pueden diferir para diferentes termocicladores. Mantenga la placa durante al menos 30 minutos a 4 °C para permitir la estabilización de las gotas antes de leer las gotas.
4. Lectura de gotitas
   1. Transfiera la placa de 96 pocillos con ciclo térmico a un lector de gotas y, en una computadora conectada al lector de gotas, abra / inicie el software que lo acompaña.
   2. En el modo de configuración, seleccione Nuevo y, a continuación, haga doble clic en cualquier pozo para abrir el cuadro de diálogo Editor de pozos . Seleccione los pocillos a leer y elija Experimento: ABS, Supermix: ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP), Tipo de objetivo 1: Ch1 desconocido, Tipo de objetivo 2: Ch2 desconocido.
      NOTA: Se puede seleccionar negativo, en blanco, NTC o positivo en el menú desplegable de tipo 1/2 de destino para las muestras de control.
   3. Asigne los nombres de destino o de muestra según el diseño de la placa y seleccione Aplicar. Cuando haya terminado, seleccione Aceptar y guarde la plantilla creada. Haga clic en Ejecutar y, cuando se le solicite, elija el color correcto (FAM / HEX).
      NOTA: Se recomienda preparar el sistema antes de correr antes de la primera ejecución del día. Además, compruebe si todas las luces del lector son verdes y, si no, siga la aplicación recomendada en el estado de la información sobre herramientas.
   4. Una vez finalizada la adquisición de datos, retire la placa del lector. Analice los datos según sea necesario.
      NOTA: Dado que los resultados preliminares se pueden ver en la pantalla, la ejecución de las muestras positivas en los primeros pozos se puede utilizar para el control de calidad en tiempo real.

4. Análisis de datos (figuras complementarias 2 y 3)

1. Verifique los datos de todos los pozos para ver el número total de gotas. Si el recuento de gotitas es <10,000, descarte los resultados y repita el ensayo. Establezca un corte para aceptar resultados positivos y negativos. Por ejemplo, un recuento de gotitas de hasta 3 o más gotitas positivas puede considerarse como el límite para obtener resultados positivos.
   NOTA: Los datos de todos los ensayos, incluidos los ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruplex, se generan utilizando el software adjunto. Sin embargo, este software solo es adecuado para ensayos simplex y dúplex. Para ensayos multiplexores de alto orden (>3 objetivos), se necesita un software externo.
2. Ensayos símplex y dúplex
   NOTA: El software externo también puede analizar datos símplex y dúplex. Sin embargo, el uso del software que lo acompaña es más fácil para estos ensayos, por lo tanto, se utiliza en este artículo.
   1. Haga doble clic en el archivo .qlp a analizar para abrirlo y seleccione Analizar.
   2. Utilice las herramientas de umbral en Amplitud 1D y Amplitud 2D para distinguir entre gotas positivas y negativas para cada pocillo en el canal correcto. Las muestras NTC y de control positivo se pueden utilizar como guía para el establecimiento de umbrales.
      NOTA: Los resultados de FAM se ven en el Canal 1, mientras que HEX/VIC en el canal 2.
   3. Después de establecer el umbral, los resultados se pueden exportar como un archivo .csv y analizarse en Excel o grabarse leyendo directamente en la ventana de resultados.
3. Mezcla de sondas triplex (Figura complementaria 2) y ensayos cuádruples (Figura complementaria 2)
   NOTA: Antes de analizar la mezcla de sondas triplex y el ensayo cuádruple, descargue el software externo. Consulte los requisitos mínimos del sistema antes de realizar la instalación.
   1. Abra el archivo .qlp haciendo clic derecho sobre él y eligiendo Abrir con el software externo, o abriendo el software externo y haciendo clic en la opción Examinar para localizar el archivo .qlp en su carpeta, o simplemente arrastrando el archivo .qlp y soltándolo en el software externo ya abierto.
   2. En la pestaña del editor de placas, seleccione los pozos que se analizarán en el lado derecho de la pestaña.
      1. Para la mezcla de sondas triplex, seleccione Cuantificación directa (DQ) como tipo de experimento, seleccione Probe Mix Triplex como información de ensayo e ingrese los nombres de los objetivos en consecuencia, y luego haga clic en Aplicar.
      2. Para cuádruplex, seleccione Cuantificación directa (DQ) como tipo de experimento, seleccione Multiplex de amplitud como información de ensayo e ingrese los nombres de los objetivos en consecuencia, y luego haga clic en Aplicar.
   3. En el lado izquierdo de la pestaña Amplitud 2D, utilice las Herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino siguiendo las sugerencias emergentes de la ventana Seleccionar para asignar clúster .
      NOTA: El modo de clúster preferido se puede aplicar según las preferencias de los usuarios.
   4. Una vez que se asignan los colores objetivo, los datos de cuantificación se pueden leer en la ventana de datos de pozo en la parte inferior derecha. Exporte datos a Excel / csv para su posterior análisis utilizando el icono de triple barra en la parte superior derecha de la tabla de datos del pozo.

Resultados

En un estudio de prueba de concepto, el rendimiento analítico de los ensayos multiplex se probó en muestras clínicas y de investigación¹⁹. El rendimiento de los ensayos multiplex fue superior al de una RT-PCR¹⁹. Dado que un número bajo de gotitas puede indicar un problema durante la generación de gotas, en este artículo se estableció un límite de 10,000 gotas por pocillo basado en datos empíricos.

Una buena separación entre gotas posit...

Discusión

Hay pocos recursos disponibles sobre cómo desarrollar ensayos RT-ddPCR para la detección del SARS-CoV-2. Aunque no se utiliza en este artículo, las muestras estándar con copias conocidas se pueden utilizar para desarrollar y optimizar ensayos. Sin embargo, en este trabajo, las muestras de SARS-CoV-2 cultivadas en células Vero-E6 se enriquecieron en un fondo de ARN genómico humano y se utilizaron como muestras estándar para desarrollar los ensayos. Las secuencias adecuadas de cebadores y sondas son esenciales al de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation