Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Zusammenfassung

Diese Arbeit fasst Schritte zur Entwicklung verschiedener Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis unter Verwendung eines zweifarbigen ddPCR-Systems zusammen. Die Schritte sind ausgeklügelt und es wurden Hinweise zur Verbesserung der Assays und der Versuchsleistung beigefügt. Diese Assays können für mehrere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Anwendungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Diagnose der anhaltenden SARS-CoV-2-Pandemie hat für alle Länder auf der ganzen Welt Priorität. Derzeit ist die quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) der Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, da keine dauerhafte Lösung verfügbar ist. So effektiv diese Technik auch sein mag, es gibt Forschungsergebnisse, die ihre Grenzen bei der Erkennung und Diagnose aufzeigen, insbesondere wenn es um Ziele mit geringer Häufigkeit geht. Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR), eine neu aufstrebende Technologie mit überlegenen Vorteilen gegenüber der qPCR, die Herausforderungen der RT-qPCR bei der Diagnose von SARS-CoV-2 aus Zielproben mit geringer Abundanz überwindet. In diesem Artikel werden die Möglichkeiten der RT-ddPCR weiter ausgebaut, indem Schritte zur Entwicklung von Simplex-, Duplex-, Triplex-Sondenmischungs- und Quadruplex-Assays unter Verwendung eines Zweifarben-Detektionssystems gezeigt werden. Mit Hilfe von Primern und Sonden, die auf bestimmte Stellen des SARS-CoV-2-Genoms (N, ORF1ab, RPP30 und RBD2) abzielen, wird gezeigt, dass die Entwicklung dieser Assays möglich ist. Darüber hinaus werden Schritt für Schritt detaillierte Protokolle, Notizen und Vorschläge zur Verbesserung des Assay-Workflows und zur Analyse der Daten bereitgestellt. Durch die Anpassung dieses Arbeitsablaufs in zukünftigen Arbeiten wird sichergestellt, dass die maximale Anzahl von Targets in einer kleinen Probe empfindlich detektiert werden kann, was die Kosten und den Probendurchsatz erheblich verbessert.

Einleitung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine anerkannte Technik, hat seit ihrem Aufkommen mehrere Transformationen durchlaufen, um zu einer leistungsstarken Technik zu werden, die Antworten auf die Nukleinsäureforschung liefern kann. Diese Transformationen waren eine ständige Verbesserung der alten Technik. Diese Transformationen lassen sich in drei Generationen^{zusammenfassen 1}. Die erste Generation ist die konventionelle PCR, die auf der Gelelektrophorese beruht, um amplifizierte Ziele zu quantifizieren und nachzuweisen. Die zweite Generation ist die quantitative Real-Time-PCR (qPCR), die Proben in Echtzeit nachweisen kann und sich auf eine Standardkurve stützt, um Ziele in einer Probe direkt zu quantifizieren. Die dritte Generation, die digitale PCR (dPCR), kann sowohl den Nachweis als auch die absolute Quantifizierung von Nukleinsäurezielen durchführen, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist. Die dPCR wurde auch weiter verbessert, da Reaktionskammern durch die Vertiefungen einer Wand in Emulsionen aus Öl, Wasser und stabilisierenden Chemikalien innerhalb derselben Vertiefung getrennt werden, wie dies bei der tröpfchenbasierten digitalen PCR² der Fall ist. Bei der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) wird eine Probe in Tausende von nanolitergroßen Tröpfchen aufgeteilt, die einzelne Targets enthalten, die später mit Hilfe der Poisson-Statistik ^2,3,4 quantifiziert werden. Diese Technik verschafft der ddPCR im Vergleich zu den anderen PCR-Generationen einen Vorteil bei der Quantifizierung von Zielmolekülen mit geringer Abundanz.

In jüngster Zeit haben mehrere Anwendungen die Überlegenheit der ddPCR gegenüber der häufig verwendeten qPCR bei der Detektion und Quantifizierung von Zielen mit geringer Abundanz hervorgehoben ^1,5,6. SARS-CoV-2 ist keine Ausnahme von diesen Anwendungen 7,8,9,10,11,12. Seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 arbeiten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler an allen Fronten an Lösungen, wie das Virus diagnostiziert und effizient nachgewiesen werden kann. Der aktuelle Goldstandard ist nach wie vor die qPCR¹³. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die RT-ddPCR im Vergleich zur RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 genauer ist^, wenn es darum geht, SARS-CoV-2-Ziele mit geringer Häufigkeit sowohl aus Umwelt- als auch aus klinischen Proben nachzuweisen. Die meisten der veröffentlichten SARS-CoV-2-ddPCR-Arbeiten hängen von Simplex-Assays ab, wobei die Multiplex-Assays von kommerziellen Assays abhängen. Daher sollte mehr getan werden, um zu erklären, wie Multiplex-RT-dPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis entwickelt werden können.

In einem geeigneten Assay-Design kann Multiplexing verwendet werden, um Kosten zu sparen, den Probendurchsatz zu erhöhen und die Anzahl der Ziele zu maximieren, die innerhalb einer kleinen Probe empfindlich nachgewiesen werden können. Beim Multiplexing mit ddPCR muss berücksichtigt werden, wie viele Fluorophore in einem bestimmten System nachgewiesen werden können. Einige ddPCR-Plattformen können bis zu drei Kanäle unterstützen, während andere nur zwei Kanäle unterstützen. Daher muss man beim Multiplexing mit zwei Kanälen verschiedene Ansätze verwenden, einschließlich Multiplexing höherer Ordnung, um mehr als zwei Ziele zu erkennen^14,15,16. In dieser Arbeit wird ein zweifarbiges ddPCR-Nachweissystem verwendet, um Schritte zur Entwicklung verschiedener SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Assays zu zeigen, die für verschiedene Forschungsanwendungen angepasst werden können.

Protokoll

Ethische Erklärung
Das Wuhan Institute of Virology (WHIOV) gehört zu den Laboren und Instituten, die von der China CDC der Stadt Wuhan für die Erforschung von SARS-CoV-2 und den Nachweis von COVID-19 aus klinischen Proben zugelassen sind. Die Forschung zur Entwicklung neuer Diagnosetechniken für COVID-19 anhand klinischer Proben wurde auch von der Ethikkommission des Wuhan Institute of Virology genehmigt (2020FCA001).

1. Arbeitsablauf bei der Probenverarbeitung (Abbildung 1A)

HINWEIS: Während des gesamten Protokolls ist es wichtig, separate Räume mit speziellen Pipetten für die Probenhandhabung (Extraktion und Lagerung), die Vorbereitung und Lagerung von Reagenzien/Mastermix, die Vorbereitung der Reaktionsmischung (Probe plus Mastermix) und die Detektion zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die zu entwickelnden Assays können bei der Detektion von klinischen Proben oder Forschungsproben eingesetzt werden. Alle Proben sollten so behandelt werden, als ob sie Infektionserreger übertragen könnten, auch wenn sichere Laborverfahren verwendet werden. Die Schritte der Probenverarbeitung sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) nach strengen BSL-2-Regeln durchgeführt werden, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA).

1. Inaktivierung von Proben
   1. Bringen Sie 1 ml SARS-CoV-2-Probe in ein BSL-2-Labor. Proben bei 65 °C für 30 min hitzeinaktivieren.
      HINWEIS: Die Proben können aus verschiedenen Quellen stammen, daher sollte man sicherstellen, dass das zu inaktivierende Volumen ausreicht, um eine anschließende RNA-Extraktion zu gewährleisten. Die meisten Extraktionskits benötigen ein kleines Probenvolumen von bis zu 200 μl, daher wäre ein Probenvolumen von etwa 1 ml für die Inaktivierung ausreichend. Tenside, Kits und Lysepuffer können auch für die direkte Inaktivierung und RNA-Extraktion gemäß der laboreigenen SOP verwendet werden.
   2. Bringen Sie die Proben in eine Biosicherheitswerkbank (BSC) und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, damit sich potenzielle Aerosole absetzen können. Lagern Sie die Proben bis zu 24 h bei 4 °C, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden.
      Anmerkungen: Für die Probenlagerung ist kein spezieller Behälter erforderlich. Die Proben können in den Röhrchen oder Behältern aufbewahrt werden, die während der Inaktivierung verwendet werden. Für diese Arbeit wurden die meisten Proben in Röhrchen mit viralen Transportmedien (VTM) oder 1,5-ml-Röhrchen gelagert.
2. RNA-Extraktion
   HINWEIS: Viele RNA-Extraktionsinstrumente und -kits mit spezifischen Protokollen sind für den gebrauchsfertigen Einsatz erhältlich. Hier wird ein automatisiertes Verfahren nach Herstellerangaben vorgestellt.
   1. Nehmen Sie die vorgefüllte 96-tiefe Well-Blende heraus; Drehen Sie es vorsichtig auf den Kopf, um die magnetischen Perlen zu mischen. Schütteln Sie die Platte nach dem Mischen vorsichtig auf einer ebenen Fläche, um Reagenz und magnetische Kügelchen zu konzentrieren, die sich möglicherweise an der Wand zum Boden der Platte befinden.
   2. Reißen Sie die Siegelfolie aus Aluminiumfolie vorsichtig ab, um Vibrationen der Platte und das Verschütten von Flüssigkeit zu vermeiden. Fügen Sie 20 μl Proteinase K und 200 μl der Probe pro Well in die Reihen 2 und 8 der 96-Well-Platte hinzu. Legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Basis des automatischen 32-Kanal-Nukleinsäureextraktionsgeräts.
      HINWEIS: Führen Sie das Programm innerhalb von 1 Stunde nach dem Hinzufügen der Probe auf dem Computer aus.
   3. Setzen Sie die magnetische Stabhülse in den Kartensteckplatz des automatischen 32-Kanal-Nukleinsäureextraktionsgeräts ein. Wählen Sie das Programm GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (Kurzversion) aus und führen Sie es aus.
   4. Nach Abschluss der Extraktion werden die Nukleinsäureproben in den Reihen 6 und 12 entnommen (ca. 100 μL/Probe) und in einer sauberen nukleasefreien 96-Well-Platte verteilt. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bis zur Verwendung bis zu 24 h bei 4 °C oder bei -20 °C für längere Zeit.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine 100-μl-Mehrkanalpipette zu verwenden, um Proben in eine neue 100-200-μl-Platte zu übertragen, da diese direkt mit den Säulen der Probenplatte übereinstimmen kann.
3. cDNA-Generierung
   Anmerkungen: Vermeiden Sie bei Proben, die über einen längeren Zeitraum gelagert werden, mehrere Gefrier-/Auftauzyklen. Führen Sie die cDNA-Generierung mit einem cDNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   1. In ein 100- oder 200-μl-PCR-Röhrchen, das auf Eis/Kühlblock gestellt wird, fügen Sie 2 μl 5x RT-Mastermix (z. B. Perfect Real Time), 5 μl Proben-RNA und 3 μl RNase-freies ddH2O pro Reaktion hinzu (Gesamtvolumen 10 μl).
   2. Legen Sie das PCR-Röhrchen in einen Thermocycler, der so eingestellt ist, dass es 15 Minuten lang bei 37 °C (Reverse-Transkription), 5 s bei 85 °C (Hitzeinaktivierung der reversen Transkriptase) und 4 °C für unendliche Zeit läuft.
      Anmerkungen: Verarbeiten Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C bis zur Verwendung bis zu 24 Stunden oder bei -20 °C bis zu 6 Monate.

2. Optimierung des ddPCR-Assays und des Workflows

HINWEIS: Optimieren Sie die Assays vor/nach dem Lesen der Tröpfchen. Abhängig von den Ergebnissen können sie an jedem Punkt der Arbeit optimiert werden, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Im Folgenden sind einige häufige Faktoren aufgeführt, die bei der Optimierung von ddPCR-Experimenten zu berücksichtigen sind.

1. Validierung der ddPCR-Primer und -Sonden (Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Primer ORF1ab und N wurden von China CDC¹⁷, dem humanen endogenen Kontrollgen (RPP30) von Lu et al.18 und RBD2 von Nyaruaba et ^al.13 adaptiert. Alle Primer und Sonden mit Ausnahme von RBD2 waren bereits ddPCR-getestet und optimiert worden ^7,8,18.
2. Führen Sie die ddPCR-Testprobenkontrollen durch, die eine Positivkontrolle (eine Probe mit allen vier Zielen), keine Vorlagenkontrolle (NTC; Nukleasefreies Wasser oder Probe ohne Ziele) und Extraktion/Negativkontrolle (Gesamtnukleinsäure, die aus einer nicht-infektiösen kultivierten menschlichen Zelle extrahiert wurde, oder gepoolte Proben von freiwilligen Helfern).
   HINWEIS: Standard-Kontrollproben mit bekannten Kopien von Zielgenen werden bevorzugt. Wenn es jedoch keine Standards gibt, verwenden Sie die verfügbaren Stichproben, um die Kontrollen oder die Probenmatrix zu definieren. Führen Sie die Steuerelemente zusammen mit Testbeispielen aus.
3. Optimieren Sie die Annealing-Temperatur (Abbildung 2D), indem Sie einen Temperaturgradienten von 55 °C bis 65 °C in den Annealing-Schritt der PCR einfügen (Schritt 3.2).
   HINWEIS: Die Optimierung der Glühtemperatur hilft dabei, die beste Temperatur zu finden, bei der die Tröpfchenabscheidung maximal ist (einfache Zielidentifikation) bei minimalem Regen. Nachdem Sie die Ergebnisse erhalten haben, schränken Sie den Temperaturbereich zur besseren Optimierung ein, z. B. 55 °C bis 60 °C.
4. Optimieren Sie die Primer- und Sondenkonzentrationen. Wenn in den Assays keine optimale Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erreicht wird, variieren Sie die Primer- (300-900 nM) und/oder Sondenkonzentrationen (100-400 nM).
   HINWEIS: Die Verringerung der Primer-/Sondenkonzentrationen führt zu einer niedrigeren Amplitude der Zieltröpfchen, und eine Erhöhung erhöht auch die Amplitude des Ziels. Dies kann beim amplitudenbasierten Multiplexing hilfreich sein.
5. Testen Sie die analytische Sensitivität unter Berücksichtigung verschiedener Parameter, einschließlich Blind- (LoB), Nachweisgrenze (LoD), Spezifität und Sensitivität, sowohl mit Standard- als auch mit Testproben, je nach Präferenz.

3. ddPCR-Workflow (Abbildung 1B) und Assay-Entwicklung (Tabelle 2)

HINWEIS: Wie bei anderen ddPCR-Nachweissystemen besteht auch dieser Workflow aus vier Schritten (Abbildung 1B), einschließlich der Vorbereitung des Reaktionsmixes, der Tröpfchenerzeugung, der PCR-Amplifikation und der Tröpfchenmessung.

1. Herstellung der Reaktionsmischung
   HINWEIS: Bereiten Sie alle Assays in einem sauberen, separaten Raum und in einem BSC vor. Beachten Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, einschließlich der Verwendung von sauberen Handschuhen, sauberen Pipetten, nukleasefreiem Wasser und Desinfektionsmitteln. Aliquote Reagenzien in separaten Röhrchen und Lagerung bei -20 ^°C, um wiederholtes Auftauen zu vermeiden. Bereiten Sie die Assays wie in Tabelle 2 dargestellt vor. Primer- und Sondenstammlösungen sollten in hohen Konzentrationen von 100 μM gelagert werden. Die Arbeitslösungen können in Aliquots von 20-40 μM (verdünnt in nukleasefreiem Wasser) gelagert werden.
   1. Gemeinsame Schritte in allen Assays
      HINWEIS: Berechnen Sie vor der Vorbereitung der Assays das Gesamtvolumen des benötigten Mastermixes basierend auf der Anzahl der Proben. Hier wurde das Volumen jeder Mastermix-Komponente mit 1,05 multipliziert, um eventuelle Pipettierfehler zu berücksichtigen.
      1. Reaktionsmaterialien auftauen und auf Raumtemperatur ausgleichen. Wirbeln Sie die Reaktionskomponenten kurz (30 s), um die Homogenität zu gewährleisten, und zentrifugieren Sie kurz, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
      2. Bereiten Sie pro Assay ein Primer-Sonden-Gemisch (PP) vor, indem Sie spezifische Reaktionsvolumina, wie in Tabelle 2 beschrieben, aus den Arbeitslösungen mischen.
      3. Bereiten Sie den Mastermix vor, indem Sie 11 μl (1x) 2x ddPCR-Supermix für Sonden (kein dUTP), PP-Mischung (abhängig vom Assay, wie in Tabelle 2 gezeigt, aus der Arbeitslösung) und nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 19,8 μl pro Vertiefung mischen. Verteilen Sie den Mastermix basierend auf der Anzahl der Proben in die Vertiefungen einer nukleasefreien 96-Well-ddPCR-Platte.
         Anmerkungen: Stellen Sie für die Probenplatte sicher, dass alle 8 Vertiefungen in einer Spalte die Lösung enthalten. Wenn nur wenige Vertiefungen verwendet werden, z. B. 5 Proben, füllen Sie die anderen 3 Vertiefungen mit jeweils 22 μL nukleasefreiem Wasser oder Kontrollpuffer.
      4. Um das endgültige Volumen der Reaktionsmischung (22 μl) zu erhalten, fügen Sie 2,2 μl cDNA-Probe pro Well hinzu, die Mastermix enthält. Versiegeln Sie die Platte mit einem Einweg-PCR-Plattenversiegeler.
         HINWEIS: Führen Sie die Probezugaben im dafür vorgesehenen Raum durch. Schließen Sie die Steuerelemente ein, d. h. Positiv, NTC und Extraktion. Wenn die RNA-Proben eine niedrige Konzentration aufweisen, reduzieren Sie zusätzlich das Wasservolumen im Mastermix und erhöhen Sie das Probenvolumen entsprechend auf bis zu 5,5 μl.
      5. Sobald die Reaktionsmischung pro Vertiefung verteilt ist, wird kurz vorgewirbelt (15-30 s) und zentrifugiert (10-15 s), um den Inhalt am Boden der Platte zu sammeln. Fahren Sie mit der Tröpfchenerzeugung fort.
2. Automatisierte Tröpfchenerzeugung (ergänzende Abbildung 1)
   HINWEIS: Es können verschiedene Tröpfchengeneratoren verwendet werden. Diese Studie wurde jedoch mit einem automatisierten Tröpfchengenerator (AutoDG) durchgeführt. Um eine Kontamination mit Amplikon zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass der Tröpfchengenerator und die Lesegeräte in separaten Bereichen Platz haben. Beim Laden von Verbrauchsmaterialien wird empfohlen, mit dem Laden von der Rückseite des Geräts nach vorne zu beginnen, um zu vermeiden, dass die Hände über die Verbrauchsmaterialien bewegt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
   1. Besorgen Sie sich alle Verbrauchsmaterialien, die zum Einrichten des AutoDG benötigt werden, einschließlich AutoDG-Öl für Sonden, DG32-Kartuschen, Pipettenspitzen, Kühlblock, Probenplatte, Tröpfchenplatte (neue saubere ddPCR-Platte) und einen Abfallbehälter.
   2. Tippen Sie auf dem AutoDG-Touchscreen auf Probeplatte konfigurieren, wählen Sie die Spalten aus, in denen sich die Proben auf der Probenplatte befinden, und drücken Sie OK.
      HINWEIS: Der Bildschirm färbt sich gelb und zeigt LOAD an, wo Verbrauchsmaterialien geladen werden sollen.
   3. Öffnen Sie die AutoDG-Klappe und legen Sie die Verbrauchsmaterialien an ihren jeweiligen Plätzen ein.
      HINWEIS: Die jeweiligen Stellen, an denen Verbrauchsmaterialien geladen werden sollen, haben eine gelbe Anzeige, die später grün wird, wenn die Verbrauchsmaterialien geladen sind. Dies ist ähnlich wie beim Touchscreen.
   4. Legen Sie die Probenplatte und die Tröpfchenerzeugungsplatte ein.
      Anmerkungen: Die Tröpfchenerzeugungsplatte sollte auf dem Kühlblock platziert werden. Stellen Sie sicher, dass der Kühlblock lila (gebrauchsfertig) und nicht rosa ist (sollte in einem Gefrierschrank aufbewahrt werden, bis die Farbe wieder lila wird).
   5. Schließen Sie die AutoDG-Klappe, stellen Sie sicher, dass der Bildschirm grün leuchtet (Verbrauchsmaterialien eingelegt), und wählen Sie den Öltyp Oil for Probes (Öl für Sonden) aus/stellen Sie sicher, dass der Öltyp Oil for Probes (Öl für Sonden) ist, bevor Sie auf Start Droplet Generation drücken.
   6. Warten Sie, bis die Tröpfchen erzeugt wurden. Öffnen Sie die Tür, sobald auf dem Bildschirm "Tröpfchen bereit" angezeigt wird, und entfernen Sie die Platte mit den Tröpfchen .
   7. Versiegeln Sie die Platte mit einer durchstechbaren Folienversiegelung mit einem Plattenversiegeler, der 5 s lang bei 185 ^°C läuft. Fahren Sie mit der PCR-Amplifikation fort.
      HINWEIS: Die PCR-Amplifikation sollte innerhalb von 30 Minuten nach der Tröpfchenerzeugung begonnen werden.
3. PCR-Amplifikation
   1. Setzen Sie die versiegelte Tröpfchenplatte in einen Thermocycler mit 96 tiefen Vertiefungen ein, stellen Sie das Probenvolumen auf 40 μl und die Deckeltemperatur auf 105 °C ein.
   2. PCR amplifiziert die Tröpfchen mit dem Programm: 95 °C für 10 min (Enzymaktivierung), 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s und 1 min Glühen/Verlängern bei 57 °C, Enzymdeaktivierung bei 98 °C für 10 min und Halteschritt bei 4 °C auf unbestimmte Zeit. Nach der PCR die Tröpfchen ablesen oder bei 4 °C bis zu 24 h lagern.
      Anmerkungen: Verwenden Sie bei allen Schritten eine Rampenrate von 2 °C/s, da die Rampenraten für verschiedene Thermocycler unterschiedlich sein können. Halten Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C, um eine Tröpfchenstabilisierung zu ermöglichen, bevor Sie die Tröpfchen ablesen.
4. Tröpfchen-Ablesung
   1. Übertragen Sie die thermisch getaktete 96-Well-Platte in einen Tröpfchenleser und öffnen bzw. starten Sie auf einem Computer, der mit dem Tröpfchenlesegerät verbunden ist, die zugehörige Software.
   2. Wählen Sie im Setup-Modus " Neu" und doppelklicken Sie dann auf ein beliebiges Well, um das Dialogfeld "Well-Editor " zu öffnen. Wählen Sie die zu lesenden Wells aus und wählen Sie Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for Probes (no dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
      HINWEIS: Negativ, leer, NTC oder positiv kann aus dem Dropdown-Menü des Zieltyps 1/2 für die Kontrollproben ausgewählt werden.
   3. Weisen Sie die Ziel- oder Probennamen basierend auf dem Plattenlayout zu, und wählen Sie Anwenden aus. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie OK aus, und speichern Sie die erstellte Vorlage. Klicken Sie auf Ausführen und wählen Sie die richtige Farbe (FAM/HEX) aus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, das System vor dem ersten Lauf des Tages vor dem Betrieb vorzubereiten. Überprüfen Sie auch, ob alle Lichter im Lesegerät grün sind, und wenn nicht, befolgen Sie die empfohlene Anwendung im QuickInfo-Status.
   4. Entfernen Sie nach Abschluss der Datenerfassung die Platte aus dem Lesegerät. Analysieren Sie die Daten nach Bedarf.
      HINWEIS: Da die vorläufigen Ergebnisse auf dem Bildschirm zu sehen sind, können die positiven Proben in den ersten Vertiefungen für die Qualitätsprüfung in Echtzeit verwendet werden.

4. Datenanalyse (ergänzende Abbildungen 2 und 3)

1. Überprüfen Sie die Daten aus allen Vertiefungen auf die Gesamtzahl der Tröpfchen. Wenn die Tröpfchenzahl 10.000 <, verwerfen Sie die Ergebnisse und wiederholen Sie den Test. Legen Sie einen Grenzwert fest, um positive und negative Ergebnisse zu akzeptieren. Beispielsweise kann eine Tröpfchenzahl von bis zu 3 oder mehr positiven Tröpfchen als Grenzwert für positive Ergebnisse angesehen werden.
   HINWEIS: Die Daten für alle Assays, einschließlich Simplex-, Duplex-, Triplex-Sondenmix- und Quadruplex-Assays, werden mit der mitgelieferten Software generiert. Diese Software ist jedoch nur für Simplex- und Duplex-Assays geeignet. Für Multiplex-Assays hoher Ordnung (>3 Targets) wird eine externe Software benötigt.
2. Simplex- und Duplex-Assays
   HINWEIS: Die externe Software kann auch Simplex- und Duplexdaten analysieren. Die Verwendung der mitgelieferten Software ist für diese Assays jedoch einfacher und wird daher in diesem Artikel verwendet.
   1. Doppelklicken Sie auf die zu analysierende .qlp-Datei, um sie zu öffnen, und wählen Sie Analysieren.
   2. Verwenden Sie die Schwellenwertwerkzeuge in der 1D-Amplitude und der 2D-Amplitude, um zwischen positiven und negativen Tröpfchen für jedes Well im richtigen Kanal zu unterscheiden. Die NTC- und Positivkontrollproben können als Orientierungshilfe für die Festlegung des Schwellenwerts verwendet werden.
      HINWEIS: Die FAM-Ergebnisse werden in Kanal 1 angezeigt, während HEX/VIC in Kanal 2 angezeigt wird.
   3. Nach dem Setzen des Schwellenwerts können die Ergebnisse als .csv Datei exportiert und in Excel weiter analysiert oder durch Auslesen direkt im Ergebnisfenster aufgezeichnet werden.
3. Triplex-Sondenmischung (ergänzende Abbildung 2) und Quadruplex-Assays (ergänzende Abbildung 2)
   HINWEIS: Bevor Sie den Triplex-Sondenmix und den Quadruplex-Assay analysieren, laden Sie die externe Software herunter. Informieren Sie sich vor der Installation über die minimalen Systemanforderungen.
   1. Öffnen Sie die .qlp-Datei, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken und Mit der externen Software öffnen wählen, oder indem Sie die externe Software öffnen und auf die Option Durchsuchen klicken, um die .qlp-Datei in Ihrem Ordner zu finden, oder indem Sie einfach die .qlp-Datei ziehen und auf der bereits geöffneten externen Software ablegen.
   2. Wählen Sie auf der Registerkarte des Platteneditors die zu analysierenden Wells auf der rechten Seite der Registerkarte aus.
      1. Wählen Sie für Triplex-Sondenmischung Direct Quantification (DQ) als Experimenttyp aus, wählen Sie Sondenmischung Triplex als Assay-Informationen aus, geben Sie die Zielnamen entsprechend ein und klicken Sie dann auf Übernehmen.
      2. Wählen Sie für Quadruplex Direct Quantification (DQ) als Experimenttyp aus, wählen Sie Amplitudenmultiplex als Assay-Informationen aus, geben Sie die Zielnamen entsprechend ein und klicken Sie dann auf Übernehmen.
   3. Verwenden Sie auf der linken Seite der Registerkarte 2D-Amplitude die Diagrammwerkzeuge , um verschiedenen Zielclustern bestimmte Farben zuzuweisen, indem Sie den Popup-Vorschlägen im Fenster Cluster zuweisen auswählen folgen.
      HINWEIS: Der bevorzugte Cluster-Modus kann je nach Präferenz des Benutzers angewendet werden.
   4. Sobald die Zielfarben zugewiesen sind, können die Quantifizierungsdaten im Well-Datenfenster unten rechts gelesen werden. Exportieren Sie Daten zur weiteren Analyse nach Excel/CSV, indem Sie das Symbol mit drei Balken oben rechts in der Tabelle der Bohrlochdaten verwenden.

Ergebnisse

In einer Proof-of-Concept-Studie wurde die analytische Leistung der Multiplex-Assays an klinischen und Forschungsproben getestet¹⁹. Die Leistung der Multiplex-Assays war der einer RT-PCR¹⁹ überlegen. Da eine geringe Anzahl von Tröpfchen auf ein Problem bei der Tröpfchenerzeugung hindeuten kann, wurde in diesem Artikel auf der Grundlage empirischer Daten ein Grenzwert von 10.000 Tröpfchen pro Well festgelegt.

Eine gute Trennung zwischen positi...

Diskussion

Es gibt nur wenige Ressourcen zur Entwicklung von RT-ddPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis. Obwohl in diesem Artikel nicht verwendet, können Standardproben mit bekannten Kopien zur Entwicklung und Optimierung von Assays verwendet werden. In dieser Arbeit wurden SARS-CoV-2-Proben, die in Vero-E6-Zellen gezüchtet wurden, jedoch in einen Hintergrund aus humaner genomischer RNA versetzt und als Standardproben für die Entwicklung der Assays verwendet. Die richtigen Primer- und Sondensequenzen sind bei der Entwicklung v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation