用于SARS-CoV-2检测和定量的两步逆转录液滴数字PCR方案

摘要

这项工作总结了使用双色ddPCR系统开发SARS-CoV-2检测的不同检测方法的步骤。这些步骤很详细，并且已经包括有关如何改进测定和实验性能的说明。这些检测可用于多种SARS-CoV-2 RT-ddPCR应用。

摘要

诊断正在进行的SARS-CoV-2大流行是全球所有国家的优先事项。目前，逆转录定量PCR（RT-qPCR）是SARS-CoV-2诊断的金标准，因为没有永久的解决方案可用。无论这种技术多么有效，研究表明其在检测和诊断方面的局限性，特别是在涉及低丰度靶标时。相比之下，微滴数字PCR（ddPCR）是一种与qPCR相比具有优越优势的最新新兴技术，已被证明可以克服RT-qPCR在诊断低丰度目标样本SARS-CoV-2方面的挑战。展望未来，在本文中，RT-ddPCR的功能通过展示如何使用双色检测系统开发单工、双链、三链探针混合物和四链体测定的步骤来进一步扩展。使用靶向SARS-CoV-2基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30和RBD2）的引物和探针，这些测定的开发被证明是可能的。此外，还提供了有关如何改进检测工作流程和分析数据的分步详细方案、注释和建议。在未来的工作中调整该工作流程将确保在小样品中灵敏地检测到最大数量的靶标，从而显著降低成本和样品通量。

引言

聚合酶链反应（PCR）是一种公认的技术，自问世以来经历了几次转变，成为一种能够为核酸研究提供答案的强大技术。这些转变是对旧技术的不断改进。这些转变可以概括为三代¹。第一代是传统的PCR，依靠凝胶电泳来定量和检测扩增的靶标。第二代是实时定量PCR（qPCR），可以实时检测样品，并依靠标准曲线直接量化样品中的靶标。第三代数字PCR（dPCR）可以同时进行核酸靶标的检测和绝对定量，而无需标准曲线。dPCR也得到了进一步改进，从反应室被壁孔分离成油，水和稳定化学品的乳液，在同一孔内看到的，如基于液滴的数字PCR²所示。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样品被分成数千个纳升大小的液滴，其中包含单个靶标，稍后将使用泊松统计量²，^3，4进行定量。与其他几代PCR相比，该技术使ddPCR在定量低丰度靶标方面具有优势。

最近，多项应用强调了ddPCR在检测和定量低丰度靶标¹，^5，6时优于常用的qPCR。SARS-CoV-2也不例外7，⁸，⁹，¹⁰，^11，12。自SARS-CoV-2爆发以来，科学家们一直在各个方面开展工作，以提出如何诊断病毒并有效检测病毒的解决方案。目前的黄金标准仍然是qPCR¹³。然而，与^{RT-qPCR 7}、⁸、⁹、¹⁰、^11、12 相比，RT-ddPCR 在检测环境和临床样本中的低丰度 SARS-CoV-2 靶标方面被证明更准确。大多数SARS-CoV-2 ddPCR发表的工作都依赖于单纯形检测，多重检测则取决于商业检测。因此，应该做更多的工作来解释如何开发用于SARS-CoV-2检测的多重RT-dPCR检测。

在适当的检测设计中，多重检测可用于节省成本，提高样品通量，并最大限度地增加小样品中可灵敏检测的靶标数量。使用ddPCR进行多重检测时，必须考虑在特定系统中可以检测到多少荧光团。一些 ddPCR 平台最多可以支持三个通道，而其他平台仅支持两个通道。因此，当使用两个通道进行多路复用时，必须使用不同的方法，包括高阶多路复用来检测两个以上的目标¹⁴，^15，16。在这项工作中，使用双色ddPCR检测系统来展示如何开发不同的SARS-CoV-2 RT-ddPCR检测的步骤，这些检测方法可以适应不同的研究应用。

研究方案

道德声明
武汉病毒研究所（WHIOV）是武汉市中国疾病预防控制中心批准的实验室和研究所之一，可以进行SARS-CoV-2研究并从临床样本中检测COVID-19。利用临床样本开发COVID-19新诊断技术的研究也已获得武汉病毒研究所伦理委员会（2020FCA001）的批准。

1. 样品处理工作流程（图1A）

注意:在整个方案中，重要的是使用带有专用移液器的单独房间进行样品处理（提取和储存）、试剂/预混液制备和储存、反应混合物制备（样品加预混液）和检测，以避免交叉污染。待开发的检测方法可用于检测临床样品或研究样品。即使使用安全的实验室程序，所有样本也应被视为可以传播传染性病原体。样品处理步骤应在生物安全2级（BSL-2）实验室按照严格的BSL-2规则进行，包括穿戴适当的个人防护设备（PPE）。

1. 样品灭活
   1. 取 1 mL SARS-CoV-2 样本至 BSL-2 实验室。在65°C下热灭活样品30分钟。
      注意:样品可能来自各种来源，因此，应确保要灭活的体积足以确保随后的RNA提取。大多数提取试剂盒需要高达 200 μL 的小样品体积，因此，约 1 mL 的样品体积足以灭活。表面活性剂、试剂盒和裂解缓冲液也可用于根据实验室自己的SOP直接灭活和RNA提取。
   2. 将样品带到生物安全柜（BSC）中，让它们在室温下静置10分钟，以使潜在的气溶胶沉淀。如果不立即处理，则将样品在4°C中储存长达24小时。
      注意:样品储存不需要特定的容器。样品可以储存在灭活期间使用的管或容器中。对于这项工作，大多数样品储存在病毒运输培养基（VTM）管或1.5 mL管中。
2. 核糖核酸提取
   注意:许多具有特定方案的RNA提取仪器和试剂盒可供随时使用。在这里，介绍了遵循制造商说明的自动化程序。
   1. 取出预填充的96深孔板;轻轻倒置以混合磁珠。混合后，在平坦的表面上轻轻摇动板，以将可能位于壁上的试剂和磁珠浓缩到板底部。
   2. 小心地撕下铝箔密封膜，以避免板振动和液体溢出。在 96 孔板的第 2 行和第 8 行中，每孔加入 20 μL 蛋白酶 K 和 200 μL 样品。然后，将96孔板放在32通道自动核酸提取仪的底座上。
      注意:添加示例后 1 小时内在计算机上运行该程序。
   3. 将磁条套插入32通道自动核酸提取仪的卡槽中。选择程序GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH（快速版）并运行。
   4. 提取完成后，取出第 6 行和第 12 行（约 100 μL/样品）中的核酸样品，并分布在干净的无核酸酶 96 孔板中。将样品在4°C下储存长达24小时直至使用或在-20°C下储存更长的时间。
      注意:建议使用 100 μL 多通道移液器将样品转移到新的 100-200 μL 板中，因为它可以直接匹配样品板的色谱柱。
3. cDNA生成
   注意:对于长时间储存的样品，请避免多次冻融循环。按照制造商的说明使用 cDNA 试剂盒进行 cDNA 生成。
   1. 在放置在冰块/冷却块上的 100 或 200 μL PCR 管中，每次反应加入 2 μL 5x RT 预混液（例如，完美实时）、5 μL 样品 RNA 和 3 μL 无 RNase ddH 2 O（总体积 10 μL）。
   2. 将PCR管置于热循环仪中，设置为在37°C下运行15分钟（逆转录），85°C运行5秒（逆转录酶的热失活），4°C无限时间。
      注意:立即处理样品，或在4°C下储存长达24小时直至使用或在-20°C下储存长达6个月。

2. 优化 ddPCR 检测和工作流程

注意:在读取液滴之前/之后优化测定。根据结果，可以在工作的任何阶段对其进行优化，以获得更好的结果。以下是优化ddPCR实验时需要考虑的一些常见因素。

1. 验证ddPCR引物和探针（表1）。
   注:引物ORF1ab和N改编自中国CDC¹⁷、Lu等人¹⁸的人类内源性对照基因（RPP30）和Nyaruaba等人¹³的RBD2。除RBD2外，所有引物和探针都已经过ddPCR测试和优化⁷，^8，18。
2. 运行ddPCR测试样品对照，包括阳性对照（具有所有四个靶标的样品），无模板对照（NTC;无核酸酶水或无靶标样本）和提取/阴性对照（从非感染性培养的人类细胞中提取的总核酸或来自卫生志愿者的混合样本）。
   注意:优选具有已知靶基因拷贝的标准对照样品。但是，在没有标准的情况下，请使用可用样本来定义其对照或样本矩阵。将控件与测试示例一起运行。
3. 通过在PCR的退火步骤（步骤3.2）中插入55°C至65°C的温度梯度来优化退火温度（图2D）。
   注意:退火温度优化有助于找到液滴分离最大（易于识别目标）且雨量最少的最佳温度。获得结果后，缩小温度范围以获得更好的优化，例如，55 °C 至 60 °C。
4. 优化引物和探针浓度。如果在测定中未实现正液滴和阴液滴之间的最佳分离，请改变引物（300-900nM）和/或探针（100-400nM）浓度。
   注意:降低引物/探针浓度会导致目标液滴振幅降低，增加它也会增加靶标的振幅。这在基于幅度的多路复用中很有帮助。
5. 根据需要使用标准样品和测试样品，考虑不同的参数，包括空白限 （LoB）、检测限 （LoD）、特异性和灵敏度，测试分析灵敏度。

3. ddPCR工作流程（图1B）和检测开发（表2）

注意:与其他ddPCR检测系统一样，该工作流程还包括四个步骤（图1B），包括反应混合物制备、液滴生成、PCR扩增和液滴读数。

1. 反应混合物制备
   注意:在干净的独立房间和平衡计分卡内准备所有检测。遵守标准预防措施，包括使用干净的手套、干净的移液器、不含核酸酶的水和消毒剂。将试剂分装在单独的试管中并储存在-20 ^°C，以避免重复冻融循环。制备测定，如 表2所示。引物和探针储备溶液应以100μM的高浓度储存。工作溶液可以以20-40μM的等分试样储存（在无核酸酶水中稀释）。
   1. 所有检测中的常见步骤
      注意:在准备测定之前，根据样品数量计算所需的预混液总量。在这里，将每个预混液组分体积乘以1.05，以解决任何移液错误。
      1. 将反应材料解冻并平衡至室温。短暂涡旋反应组分（30秒）以确保均匀性，并短暂离心以收集管底部的内容物。
      2. 通过从工作溶液中混合表 2 中详述的特定反应体积，每次测定制备引物 - 探针（PP）混合物。
      3. 通过将 11 μL （1x） 2x ddPCR 超级混合物用于探针（无 dUTP）、PP 混合物（取决于工作溶液中表 2 所示的测定）和无核酸酶水混合至每孔 19.8 μL 的最终体积来制备预混液。根据样品数量将预混液分配到无核酸酶 96 孔 ddPCR 板的孔中。
         注意:对于样品板，请确保一列中的所有8个孔都有溶液。如果仅使用几个孔，例如 5 个样品，则向其他 3 个孔中填充 22 μL 无核酸酶的水或对照缓冲液。
      4. 要获得最终反应混合物体积 （22 μL），每孔中加入 2.2 μL cDNA 样品，含预混液。用一次性PCR板封口机密封板。
         注意:在指定的房间进行样品添加。包括对照，即阳性、NTC 和提取。此外，如果RNA样品浓度低，请减少预混液中的水量，并相应地将样品体积增加到5.5 uL。
      5. 一旦反应混合物分布在每孔中，短暂涡旋（15-30秒），然后离心（10-15秒）以收集板底部的内容物。继续生成液滴。
2. 自动产生液滴（补充图1）
   注意:可以使用不同的液滴发生器;然而，这项研究是用自动液滴发生器（AutoDG）进行的。为避免扩增子污染，请确保液滴发生器和读数仪在单独的区域有专用空间。装载耗材时，建议从仪器背面开始向前装载，以避免将手移到耗材上，以免交叉污染。
   1. 获取设置 AutoDG 所需的所有耗材，包括用于探头的 AutoDG 油、DG32 墨盒、移液器吸头、冷却块、样品板、液滴板（新的清洁 ddPCR 板）和垃圾箱。
   2. 在AutoDG触摸屏上，触摸配置样品板并选择样品 板上样品 所在的色谱柱，然后按 OK键。
      注意:屏幕将变为黄色，指示应装载耗材的LOAD。
   3. 打开 AutoDG 门并将耗材装载到各自的位置。
      注意:应装载耗材的相应位置将有一个黄色指示器，如果装载耗材，该指示器稍后将变为绿色。这类似于触摸屏。
   4. 加载样品板和液滴发生板。
      注意: 液滴发生板应放置在冷却块上。确保冷却块是紫色的（准备使用）而不是粉红色的（应保存在冰箱中，直到颜色变回紫色）。
   5. 关闭AutoDG门，确保屏幕为绿色（已装入耗材），并选择/确保油类型为探头油 ，然后再按 开始液滴生成。
   6. 等待液滴生成。屏幕显示液滴就绪后打开门，然后取出装有 液滴 的板。
   7. 使用设置为在185 ^oC下运行5秒的板密封剂，用可刺穿的箔密封密封板。进行PCR扩增。
      注意:PCR扩增应在液滴产生后30分钟内开始。
3. 聚合酶链反应扩增
   1. 将密封的液滴板插入 96 深孔热循环仪中，将样品体积设置为 40 μL，盖子温度设置为 105 °C。
   2. PCR使用该程序扩增液滴:95°C变性10分钟（酶活化），40个循环在94°C变性30秒和1分钟在57°C下退火/延伸，酶在98°C下失活10分钟，并在4°C下无限期保持步骤。PCR后，读取液滴或在4°C下储存长达24小时。
      注意:在所有步骤中使用2°C / s的升温速率，因为不同的热循环仪的升降温速率可能不同。在读取液滴之前，将板在4°C下保持至少30分钟以使液滴稳定。
4. 液滴读取
   1. 将热循环的96孔板转移到液滴读数器中，并在连接到液滴读数器的计算机上，打开/启动随附的软件。
   2. 在设置模式下，选择" 新建 "，然后双击任何孔以打开" 井编辑器 "对话框。选择要读取的孔，然后选择实验:ABS，超级混合物: 用于探针的ddPCR超级混合物（无dUTP），靶标1类型:通道1未知，靶标2类型:通道2未知。
      注意:可以从对照样品的目标 1/2 类型下拉菜单中选择负、空白、NTC 或正。
   3. 根据孔板布局分配目标或样品名称，然后选择 应用。完成后，选择" 确定"，然后保存创建的模板。单击 "运行 "，并在出现提示时选择正确的颜色（FAM/HEX）。
      注意:建议在当天第一次运行之前在运行之前启动系统。此外，检查阅读器中的所有指示灯是否均为绿色，如果不是，请按照工具提示状态上的推荐应用程序进行操作。
   4. 数据采集完成后，从读数器上取下板。根据需要分析数据。
      注意:由于初步结果可以在屏幕上看到，因此在第一个孔中运行阳性样品可用于实时质量检查。

4. 数据分析（补充图2和图3）

1. 检查所有孔的数据以了解液滴总数。如果液滴计数为<10，000，则丢弃结果并重复测定。设置一个截止点以接受正面和负面结果。例如，最多 3 个或更多阳性液滴的液滴计数可被视为阳性结果的截止值。
   注意:所有检测的数据，包括单工、双链、三链探针混合物和四链体检测，均使用随附的软件生成。但是，该软件仅适用于单工和双链分析。对于高阶多重检测（>3 个靶标），需要外部软件。
2. 单纯和双链检测
   注:外部软件还可以分析单工和双工数据。然而，对于这些测定，使用随附的软件更容易，因此在本文中使用。
   1. 双击要分析的 .qlp 文件以将其打开，然后选择 "分析"。
   2. 使用 1D振幅 和 2D振幅 中的阈值工具区分正确通道中每个孔的正液滴和负液滴。NTC和阳性对照样品可用作阈值设置的指导。
      注意:FAM 结果显示在通道 1 中，而十六进制/VIC 显示在通道 2 中。
   3. 设置阈值后，结果可以导出为.csv文件，并在Excel中进一步分析或通过直接在结果窗口中读取来记录。
3. 三链体探针混合物（补充图2）和四链体测定（补充图2）
   注意:在分析三链体探针混合物和四链体测定之前，请下载外部软件。在安装之前，请参阅最低系统要求。
   1. 打开 .qlp 文件，方法是右键单击该文件并选择"使用外部软件 打开 "，或者打开外部软件并单击" 浏览 "选项以在文件夹中找到 .qlp 文件，或者只需将 .qlp 文件拖放到已打开的外部软件上。
   2. 在板编辑器选项卡中，在选项卡右侧选择要分析的孔。
      1. 对于三重探针混合物，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 探针混合物三重 作为测定信息并相应地输入靶标名称，然后单击 应用。
      2. 对于四链体，选择 直接定量（DQ） 作为实验类型，选择 幅度多重 作为检测信息并相应地输入靶标名称，然后单击 应用。
   3. 在 2D 振幅选项卡的左侧，使用 图形工具 根据选择以分配聚类窗口弹出的建议为不同的目标 聚类分配 特定颜色。
      注意:可以根据用户的偏好应用首选群集模式。
   4. 分配目标颜色后，可以在右下角的 "井数据"窗口中 读取定量数据。将数据导出到 Excel/csv，以便使用孔数据表右上角的三条形图标进行进一步分析。

结果

在一项概念验证研究中，对临床和研究样品进行了多重分析分析性能测试¹⁹。多重检测的性能优于RT-PCR¹⁹。由于液滴数量少可能表明液滴生成过程中存在问题，因此在本文中，根据经验数据设定了每孔10，000个液滴的截止值。

正负液滴之间的良好分离以及最小的雨水干扰有助于数据分析。因此，在一个好的实验中，分析优化是关键

讨论

关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源很少。虽然本文未使用，但具有已知拷贝的标准样品可用于开发和优化测定。然而，在这项工作中，在Vero-E6细胞中生长的SARS-CoV-2样品在人类基因组RNA的背景中加标，并用作开发测定的标准样品。在开发检测方法时，正确的引物和探针序列至关重要。由于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的大多数初步工作都使用了中国CDC的引物和靶向ORF1ab和N基因的探针，因此他...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation