SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

要約

この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2 RT-ddPCRアプリケーションに使用できます。

要約

進行中のSARS-CoV-2パンデミックの診断は、世界中のすべての国にとって優先事項です。現在、逆転写定量PCR(RT-qPCR)は、恒久的な解決策が利用できないため、SARS-CoV-2診断のゴールドスタンダードです。この手法がどれほど効果的であっても、特に存在量の少ないターゲットに関しては、検出と診断の限界を示す研究が浮上しています。対照的に、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、qPCRよりも優れた利点を持つ最近の新興技術であり、低量のターゲットサンプルからのSARS-CoV-2の診断におけるRT-qPCRの課題を克服することが示されています。この記事では、2色検出システムを使用してシンプレックス、デュプレックス、トリプレックスプローブミックス、およびクワッドプレックスアッセイを開発する方法の手順を示すことで、RT-ddPCRの機能をさらに拡張します。SARS-CoV-2ゲノムの特定の部位(N、ORF1ab、RPP30、およびRBD2)を標的とするプライマーとプローブを使用して、これらのアッセイの開発が可能であることが示されています。さらに、アッセイワークフローを改善し、データを分析する方法に関する詳細なプロトコル、メモ、および提案を段階的に提供します。このワークフローを将来の作業に適応させることで、小さなサンプルで最大数のターゲットを高感度に検出できるようになり、コストとサンプルスループットが大幅に向上します。

概要

よく知られている技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、その登場以来、核酸研究に答えを提供できる強力な技術になるためにいくつかの変革を遂げてきました。これらの変換は、古い手法の絶え間ない改善でした。これらの変換は、3世代に要約できます¹。第1世代は、増幅されたターゲットを定量および検出するためにゲル電気泳動に依存する従来のPCRです。第2世代は定量的リアルタイムPCR(qPCR)で、サンプルをリアルタイムで検出し、標準曲線に依存してサンプル中のターゲットを直接定量することができます。第3世代のデジタルPCR(dPCR)は、標準曲線を必要とせずに核酸標的の検出と絶対定量の両方を実行できます。dPCRはまた、液滴ベースのデジタルPCR²に見られるように、壁のウェルによって分離された反応チャンバーから、同じウェル内の油、水、および安定化化学物質のエマルジョンにさらに改善されました。液滴デジタルPCR(ddPCR)では、サンプルは個々のターゲットを含む数千のナノリットルサイズの液滴に分割され、後でポア^{ソン統計2,3,4}を使用して定量されます。この手法により、ddPCRは、他の世代のPCRと比較して、存在量の少ないターゲットを定量する上で優位に立つことができます。

最近、複数のアプリケーションが、低存在量のターゲットを検出および定量する際に、一般的に使用されるqPCRに対するddPCRの優位性を強調しています^1,5,6。SARS-CoV-2は、^{これらのアプリケーション7}、^8、9、^10、11、12の例外ではありません。SARS-CoV-2の発生以来、科学者たちはウイルスを診断し、効率的に検出する方法に関する解決策を考え出すためにあらゆる面で取り組んできました。現在のゴールドスタンダードはまだ^qPCR13です。ただし、RT-ddPCRは、RT-qPCR⁷、⁸、^{9、10、11、12}と比較して、環境サンプルと臨床サンプルの両方から低存在量のSARS-CoV-2ターゲットをより正確に検出できることが示されています。SARS-CoV-2 ddPCRで発表された研究のほとんどはシンプレックスアッセイに依存しており、マルチプレックスアッセイは市販のアッセイに依存しています。したがって、SARS-CoV-2検出のためのマルチプレックスRT-dPCRアッセイを開発する方法を説明するために、さらに多くのことを行う必要があります。

適切なアッセイデザインでは、マルチプレックスを使用してコストを節約し、サンプルスループットを向上させ、小さなサンプル内で高感度に検出できるターゲットの数を最大化できます。ddPCRでマルチプレックス化する場合、特定のシステムで検出できる蛍光色素の数を考慮する必要があります。ddPCRプラットフォームには、最大3つのチャネルをサポートできるものもあれば、2つのチャネルのみをサポートするものもあります。したがって、2つのチャネルで多重化する場合、2つ以上のターゲットを検出するための高次多重化を含む異なるアプローチを使用する必要があります^14、15、16。この研究では、2色ddPCR検出システムを使用して、さまざまな研究アプリケーションに適応できるさまざまなSARS-CoV-2RT-ddPCRアッセイを開発する方法の手順を示します。

プロトコル

倫理声明
武漢ウイルス学研究所(WHIOV)は、武漢市の中国CDCによってSARS-CoV-2の研究を実施し、臨床サンプルからCOVID-19を検出することを承認された研究所の1つです。臨床サンプルを使用したCOVID-19の新しい診断技術の開発に関する研究は、武漢ウイルス学研究所の倫理委員会(2020FCA001)によっても承認されています。

1. サンプル処理ワークフロー(図1A)

注:プロトコル全体を通して、クロスコンタミネーションを避けるために、サンプルの取り扱い(抽出と保管)、試薬/マスターミックスの調製と保管、反応ミックスの調製(サンプルとマスターミックス)、および検出のために、専用のピペットを備えた別々の部屋を使用することが重要です。開発するアッセイは、臨床サンプルまたは研究サンプルの検出に使用できます。すべてのサンプルは、安全な実験室手順を使用している場合でも、感染性病原体を感染させる可能性があるかのように処理する必要があります。サンプル処理ステップは、適切な個人用保護具(PPE)の着用を含む厳格なBSL-2規則に従って、バイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボで実行する必要があります。

1. サンプルの不活性化
   1. 1 mLのSARS-CoV-2サンプルをBSL-2ラボに持ち込みます。サンプルを65°Cで30分間熱不活性化します。
      注:サンプルはさまざまなソースから得られる可能性があるため、不活性化する量がその後のRNA抽出を確実にするのに十分であることを確認する必要があります。ほとんどの抽出キットは、最大200 μLの少量のサンプルを必要とするため、不活性化には約1 mLのサンプル容量で十分です。界面活性剤、キット、および溶解バッファーは、ラボ独自のSOPに従って直接不活性化およびRNA抽出にも使用できます。
   2. サンプルをバイオセーフティキャビネット(BSC)に持ち込み、室温で10分間放置して、潜在的なエアロゾルを沈降させます。すぐに処理しない場合は、サンプルを4°Cで最大24時間保存します。
      注:サンプルの保存に特定の容器は必要ありません。試料は、失活中に使用されるチューブまたは容器に貯蔵され得る。この作業では、ほとんどのサンプルをウイルス輸送媒体(VTM)チューブまたは1.5 mLチューブに保存しました。
2. RNA抽出
   注:特定のプロトコルを備えた多くのRNA抽出装置およびキットがすぐに使用できます。ここでは、製造元の指示に従って自動化された手順を示します。
   1. 事前に充填された深さ96のウェルオリフィスプレートを取り出します。それを穏やかに逆さまにして、磁気ビーズを混ぜます。混合後、平らな面でプレートを静かに振って、プレートの底部の壁にある可能性のある試薬と磁気ビーズを濃縮します。
   2. プレートの振動や液体のこぼれを防ぐために、アルミホイルのシーリングフィルムを慎重にはがします。96ウェルプレートの2行目と8列目に、ウェルあたり20 μLのプロテイナーゼKと200 μLのサンプルを追加します。次に、96ウェルプレートを32チャンネル自動核酸抽出装置のベースに置きます。
      注: サンプルを追加してから 1 時間以内にコンピューターでプログラムを実行してください。
   3. 磁気バースリーブを32チャンネル自動核酸抽出装置のカードスロットに挿入します。選択 プログラム GF-FM502T5-TR"1" GF-FM502T5YH (クイックバージョン)それを実行します。
   4. 抽出が完了したら、6行目と12行目の核酸サンプル(約100 μL/サンプル)を取り出し、清潔なヌクレアーゼフリーの96ウェルプレートに分配します。サンプルは、使用するまで4°Cで最大24時間、または-20°Cで長期間保管してください。
      注:サンプルプレートのカラムに直接一致する可能性があるため、100 μLマルチチャンネルピペットを使用してサンプルを新しい100〜200 μLプレートに移すことをお勧めします。
3. cDNAの生成
   注意: 長期間保存されるサンプルの場合は、複数回の凍結/解凍サイクルを避けてください。製造元の指示に従って、cDNAキットを使用してcDNA生成を実行します。
   1. 氷/冷却ブロック上に置いた100または200 μLのPCRチューブに、反応ごとに2 μLの5x RTマスターミックス(パーフェクトリアルタイムなど)、5 μLのサンプルRNA、および3 μLのRNaseフリーddH2Oを加えます(総容量10 μL)。
   2. PCRチューブを、37°Cで15分間(逆転写)、85°Cで5秒間(逆転写酵素の熱不活性化)、4°Cで無限の時間稼働するように設定されたサーマルサイクラーに入れます。
      注意: サンプルをすぐに処理するか、使用するまで4°Cで最大24時間、または-20°Cで最大6か月間保管してください。

2. ddPCRアッセイとワークフローの最適化

注:液滴を読み取る前後のアッセイを最適化します。結果に応じて、作業の任意の時点で最適化して、より良い結果を得ることができます。以下は、ddPCR実験を最適化する際に考慮すべきいくつかの一般的な要因です。

1. ddPCRプライマーとプローブを検証します(表1)。
   注:プライマーORF1abおよびNはChina CDC 17から、ヒト内在性制御遺伝子(RPP30)はLuら¹⁸から、RBD2はNyaruabaらから^13から適応されました。RBD2を除くすべてのプライマーとプローブはすでにddPCRテストされ^、最適化されています⁷、^8、18。
2. ポジティブコントロール(4つのターゲットすべてを含むサンプル)、テンプレートコントロールなし(NTC;ヌクレアーゼを含まない水または標的のないサンプル)、および抽出/陰性対照(非感染性培養ヒト細胞から抽出された全核酸、または医療ボランティアからのプールサンプル)。
   注:標的遺伝子の既知のコピーを含む標準対照サンプルが好ましい。ただし、標準がない場合は、使用可能なサンプルを使用して、コントロールまたはサンプルマトリックスを定義します。テスト サンプルと共にコントロールを実行します。
3. PCRのアニーリングステップ(ステップ3.2)に55°Cから65°Cの温度勾配を挿入することにより、アニーリング温度を最適化します(図2D)。
   注:アニーリング温度の最適化は、最小限の雨で液滴分離が最大になる最適な温度を見つけるのに役立ちます(ターゲットの識別が容易)。結果が得られたら、55°Cから60°Cなど、より良い最適化のために温度範囲を絞り込みます。
4. プライマーとプローブの濃度を最適化します。アッセイで陽性液滴と負液滴の最適な分離が達成されない場合は、プライマー(300-900 nM)および/またはプローブ(100-400 nM)の濃度を変えてください。
   注:プライマー/プローブ濃度を下げるとターゲット液滴の振幅が小さくなり、それを増やすとターゲットの振幅も大きくなります。これは、振幅ベースの多重化に役立ちます。
5. ブランクの限界(LoB)、検出限界(LoD)、特異度、および標準サンプルとテストサンプルの両方を使用して感度など、さまざまなパラメーターを考慮して分析感度をテストします。

3. ddPCRワークフロー(図1B)およびアッセイ開発(表2)

注:他のddPCR検出システムと同様に、このワークフローも、反応ミックスの準備、液滴の生成、PCR増幅、液滴の読み取りを含む4つのステップ(図1B)で構成されています。

1. 反応ミックス調製
   注:すべてのアッセイは、清潔な別の部屋とBSC内で準備してください。清潔な手袋、清潔なピペット、ヌクレアーゼのない水、消毒剤の使用など、標準的な注意事項を守ってください。試薬を別々のチューブに分注し、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために-20 ^°Cで保存します。 表2に示すようにアッセイを調製する。プライマーおよびプローブストック溶液は、100 μMの高濃度で保存する必要があります。作業溶液は、20〜40μMのアリコート(ヌクレアーゼ遊離水で希釈)で保存できます。
   1. すべてのアッセイで共通のステップ
      注:アッセイを調製する前に、サンプル数に基づいて必要なマスターミックスの総量を計算してください。ここでは、各マスターミックスコンポーネントボリュームに1.05を掛けて、ピペッティングエラーを考慮しました。
      1. 反応物質を解凍し、室温まで平衡化します。均一性を確保するために反応成分を短時間(30秒)ボルテックスし、短時間遠心分離してチューブの底に内容物を集めます。
      2. 作業溶液から 表2 に詳述されているように特定の反応量を混合することにより、アッセイごとにプライマー-プローブ(PP)ミックスを調製します。
      3. プローブ用2x ddPCRスーパーミックス(dUTPなし)、PPミックス(作業溶液からの 表2 に示すようにアッセイに依存)、およびヌクレアーゼフリー水を1ウェルあたり19.8 μLの最終容量まで混合して、マスターミックスを調製します。サンプル数に基づいて、マスターミックスをヌクレアーゼフリーの96ウェルddPCRプレートのウェルに分配します。
         注:サンプルプレートの場合、1つのカラムの8つのウェルすべてに溶液があることを確認してください。5サンプルなど、少数のウェルのみを使用する場合は、他の3つのウェルにそれぞれ22 μLのヌクレアーゼフリーウォーターまたはコントロールバッファーを充填します。
      4. 最終反応ミックス容量(22 μL)を得るには、マスターミックスを含むウェルあたり2.2 μLのcDNAサンプルを追加します。使い捨てPCRプレートシーラーでプレートを密封します。
         注意: 指定された部屋でサンプルの追加を実行します。コントロール、つまりポジティブ、NTC、および抽出を含めます。さらに、RNAサンプルの濃度が低い場合は、マスターミックス中の水の量を減らし、それに応じてサンプル量を最大5.5 uLまで増やします。
      5. 反応混合物がウェルごとに分配されたら、短時間(15〜30秒)、遠心分離機(10〜15秒)してプレートの下部に内容物を収集します。液滴生成に進みます。
2. 液滴自動生成(補足図1)
   注意: さまざまな液滴発生器を使用できます。ただし、この研究は自動液滴発生器(AutoDG)を使用して実施されました。アンプリコンの汚染を避けるために、液滴発生器とリーダーが別々の領域に専用のスペースを持っていることを確認してください。消耗品をロードするときは、クロスコンタミネーションを避けるために消耗品の上に手を動かさないように、機器の背面から前面に向かってロードを開始することをお勧めします。
   1. プローブ用のAutoDGオイル、DG32カートリッジ、ピペットチップ、冷却ブロック、サンプルプレート、液滴プレート(新しいクリーンddPCRプレート)、ゴミ箱など、AutoDGのセットアップに必要なすべての消耗品を入手してください。
   2. AutoDGタッチスクリーンで、[サンプルプレート の構成] をタッチし、サンプルプレート上のサンプルが配置されている列を選択して、[ OK]を押します。
      注意: 画面が黄色に変わり、消耗品をロードする場所がLOADことを示します。
   3. AutoDGドアを開き、消耗品をそれぞれの場所にロードします。
      注意: 消耗品をロードする必要があるそれぞれの場所には黄色のインジケーターがあり、消耗品がロードされると後で緑色に変わります。これはタッチスクリーンに似ています。
   4. サンプルプレートと液滴生成プレートをセットします。
      注意: 液滴生成プレートは冷却ブロックに配置する必要があります。冷却ブロックがピンクではなく紫色(すぐに使用できる)であることを確認してください(色が紫色に戻るまで冷凍庫に保管する必要があります)。
   5. AutoDGドアを閉じ、画面が緑色(消耗品がロードされている)であることを確認し、液滴生成の開始を押す前に、オイルタイプがプローブ用オイルであることを選択/確認します。
   6. 液滴が生成されるのを待ちます。画面に「液滴の準備ができました」と表示されたらドアを開き、 液滴 が入っているプレートを取り外します。
   7. 185 ^oCで5秒間稼働するように設定されたプレートシーラーを使用して、穴の開いたホイルシールでプレートをシールします。PCR増幅に進みます。
      注:PCR増幅は、液滴生成後30分以内に開始する必要があります。
3. PCR増幅
   1. 密封した液滴プレートを深さ96ウェルサーマルサイクラーに挿入し、サンプル量を40 μL、蓋の温度を105°Cに設定します。
   2. PCRは、プログラムを使用して液滴を増幅します:95°Cで10分間(酵素活性化)、94°Cで30秒間40サイクルの変性、57°Cで1分間のアニーリング/伸長、98°Cで10分間酵素失活、および4°Cでの無期限の保持ステップ。PCR後、液滴を読み取るか、4°Cで最大24時間保存します。
      注意: ランプレートはサーマルサイクラーによって異なる可能性があるため、すべてのステップで2°C / sのランプレートを使用してください。液滴を読み取る前に、液滴を安定化させるためにプレートを4°Cで少なくとも30分間保持します。
4. 液滴読み取り
   1. サーマルサイクルされた96ウェルプレートを液滴リーダーに移し、液滴リーダーに接続されたコンピューターで、付属のソフトウェアを開く/起動します。
   2. セットアップ モードで、[ 新規 ]を選択し、任意のウェルをダブルクリックして[ ウェル エディタ ]ダイアログ ボックスを開きます。読み取るウェルを選択し、実験:ABS、スーパーミックス: プローブ用ddPCRスーパーミックス(dUTPなし)、ターゲット1タイプ:Ch1不明、ターゲット2タイプ:Ch2不明を選択します。
      注:ネガティブ、ブランク、NTC、またはポジティブは、コントロールサンプルのターゲット1/2タイプのドロップダウンメニューから選択できます。
   3. プレートレイアウトに基づいてターゲット名またはサンプル名を割り当て、[ 適用]を選択します。完了したら、 [ OK] を選択し、作成したテンプレートを保存します。[ 実行 ]をクリックし、プロンプトが表示されたら適切な色(FAM / HEX)を選択します。
      メモ: その日の最初の実行の前に、実行前にシステムを準備することをお勧めします。また、リーダーのすべてのライトが緑色になっているかどうかを確認し、緑色でない場合は、ツールチップのステータスで推奨アプリケーションに従ってください。
   4. データ取得が終了したら、リーダーからプレートを取り外します。必要に応じてデータを分析します。
      注:予備的な結果は画面に表示されるため、最初のウェルで陽性サンプルを実行することで、リアルタイムの品質チェックを行うことができます。

4. データ解析(補足図2、3)

1. 液滴の総数については、すべてのウェルのデータを確認してください。液滴数が10,000<の場合は、結果を破棄してアッセイを繰り返します。正の結果と否定的な結果を受け入れるようにカットオフを設定します。例えば、最大3つ以上の陽性液滴の液滴数は、陽性結果のカットオフと見なすことができる。
   注:シンプレックス、デュプレックス、トリプレックスプローブミックス、およびクワッドプレックスアッセイを含むすべてのアッセイのデータは、付属のソフトウェアを使用して生成されます。ただし、このソフトウェアはシンプレックスアッセイおよびデュプレックスアッセイにのみ適しています。高次マルチプレックスアッセイ(>3ターゲット)には、外部ソフトウェアが必要です。
2. シンプレックスおよびデュプレックスアッセイ
   メモ: 外部ソフトウェアは、シンプレックスおよびデュプレックスデータを解析することもできます。ただし、付属のソフトウェアを使用すると、これらのアッセイの方が簡単であるため、この記事で使用します。
   1. 分析する .qlp ファイルをダブルクリックして開き、[ 分析] を選択します。
   2. 1D 振幅および 2D 振幅のしきい値ツールを使用して、正しいチャネル内の各ウェルの正液滴と負液滴を区別します。NTCおよびポジティブコントロールサンプルは、しきい値設定のガイダンスとして使用できます。
      メモ: FAM の結果はチャネル 1 で表示され、HEX/VIC はチャネル 2 に表示されます。
   3. しきい値を設定した後、結果を.csvファイルとしてエクスポートし、Excelでさらに分析したり、結果ウィンドウで直接読み取って記録したりできます。
3. トリプレックスプローブミックス(補足図2)およびクワッドプレックスアッセイ(補足図2)
   注:トリプレックスプローブミックスとクワッドプレックスアッセイを分析する前に、外部ソフトウェアをダウンロードしてください。インストールする前に、最小システム要件を参照してください。
   1. .qlp ファイルを右クリックし、[外部ソフトウェアで 開く ] を選択するか、外部ソフトウェアを開いて [参照 ] オプションをクリックしてフォルダー内の .qlp ファイルを見つけるか、.qlp ファイルをドラッグして既に開いている外部ソフトウェアにドロップします。
   2. プレートエディタタブで、タブの右側で分析するウェルを選択します。
      1. トリプレックスプローブミックスの場合、実験タイプとして 直接定量(DQ) を選択し、アッセイ情報として プローブミックストリプレックス を選択し、それに応じてターゲット名を入力してから、[ 適用]をクリックします。
      2. 四重鎖の場合は、実験タイプとして 直接定量(DQ) を選択し、アッセイ情報として 振幅マルチプレックス を選択し、それに応じてターゲット名を入力してから、 適用をクリックします。
   3. [2D 振幅]タブの左側で、[ グラフツール ]を使用して、クラスターの割り当て選択ウィンドウのポップアップ提案に従って、さまざまなターゲット クラスター に特定の色を割り当てます。
      注: 優先クラスタ モードは、ユーザーの設定に基づいて適用できます。
   4. ターゲットカラーが割り当てられると、右下の ウェルデータウィンドウで 定量データを読み込むことができます。データをExcel/csvにエクスポートし、井戸データテーブルの右上にあるトリプルバーアイコンを使用してさらに分析します。

結果

概念実証研究において、マルチプレックスアッセイの分析性能を臨床および研究サンプル¹⁹で試験した。マルチプレックスアッセイの性能はRT-PCR¹⁹よりも優れていました。液滴数が少ない場合は液滴生成中の問題を示している可能性があるため、この記事では、経験的データに基づいてウェルあたり10,000液滴のカットオフを設定しました。

ディスカッション

SARS-CoV-2検出のためのRT-ddPCRアッセイの開発方法に関するリソースはほとんどありません。この記事では使用しませんが、既知のコピーを含む標準サンプルを使用して、アッセイを開発および最適化できます。ただし、この研究では、Vero-E6細胞で増殖したSARS-CoV-2サンプルをヒトゲノムRNAのバックグラウンドでスパイクし、アッセイを開発するための標準サンプルとして使用しました。適切な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation