SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

要約

この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2 RT-ddPCRアプリケーションに使用できます。

要約

進行中のSARS-CoV-2パンデミックの診断は、世界中のすべての国にとって優先事項です。現在、逆転写定量PCR(RT-qPCR)は、恒久的な解決策が利用できないため、SARS-CoV-2診断のゴールドスタンダードです。この手法がどれほど効果的であっても、特に存在量の少ないターゲットに関しては、検出と診断の限界を示す研究が浮上しています。対照的に、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、qPCRよりも優れた利点を持つ最近の新興技術であり、低量のターゲットサンプルからのSARS-CoV-2の診断におけるRT-qPCRの課題を克服することが示されています。この記事では、2色検出システムを使用してシンプレックス、デュプレックス、トリプレックスプローブミックス、およびクワッドプレックスアッセイを開発する方法の手順を示すことで、RT-ddPCRの機能をさらに拡張します。SARS-CoV-2ゲノムの特定の部位(N、ORF1ab、RPP30、およびRBD2)を標的とするプライマーとプローブを使用して、これらのアッセイの開発が可能であることが示されています。さらに、アッセイワークフローを改善し、データを分析する方法に関する詳細なプロトコル、メモ、および提案を段階的に提供します。このワークフローを将来の作業に適応させることで、小さなサンプルで最大数のターゲットを高感度に検出できるようになり、コストとサンプルスループットが大幅に向上します。

概要

よく知られている技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、その登場以来、核酸研究に答えを提供できる強力な技術になるためにいくつかの変革を遂げてきました。これらの変換は、古い手法の絶え間ない改善でした。これらの変換は、3世代に要約できます¹。第1世代は、増幅されたターゲットを定量および検出するためにゲル電気泳動に依存する従来のPCRです。第2世代は定量的リアルタイムPCR(qPCR)で、サンプルをリアルタイムで検出し、標準曲線に依存してサンプル中のターゲットを直接定量することができます。第3世代のデジタルPCR(dPCR)は、標準曲線を必要とせずに核酸標的の検出と絶対定量の両方を実行できます。dPCRはまた、液滴ベースのデジタルPCR²に見られるように、壁のウェルによって分離された反応チャンバーから、同じウェル内の油、水、および安定化化学物質のエマルジョンにさらに改善されました。液滴デジタルPCR(ddPCR)では、サンプルは個々のターゲットを含む数千のナノリットルサイズの液滴に分割され、後でポア^{ソン統計2,3,4}を使用して定量されます。この手法により、ddPCRは、他の世代のPCRと比較して、存在量の少ないターゲットを定量する上で優位に立つことができ....

プロトコル

倫理声明
武漢ウイルス学研究所(WHIOV)は、武漢市の中国CDCによってSARS-CoV-2の研究を実施し、臨床サンプルからCOVID-19を検出することを承認された研究所の1つです。臨床サンプルを使用したCOVID-19の新しい診断技術の開発に関する研究は、武漢ウイルス学研究所の倫理委員会(2020FCA001)によっても承認されています。

1. サンプル処理ワークフロー(図1A)

注:プロトコル全体を通して、クロスコンタミネーションを避けるために、サンプルの取り扱い(抽出と保管)、試薬/マスターミックスの調製と保管、反応ミックスの調製(サンプルとマスターミックス)、および検出のために、専用のピペットを備えた別々の部屋を使用することが重要です。開発するアッセイは、臨床サンプルまたは研究サンプルの検出に使用できます。すべてのサンプルは、安全な実験室手順を使用している場合でも、感染性病原体を感染させる可能性があるかのように処理する必要があります。サンプル処理ステップは、適切な個人用保護具(PPE)の着用を含む厳格なBSL-2規則に従って、バイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボで実行する必要があります。

1. サンプルの不活性化
   1. 1 mLのSARS-CoV....

結果

概念実証研究において、マルチプレックスアッセイの分析性能を臨床および研究サンプル¹⁹で試験した。マルチプレックスアッセイの性能はRT-PCR¹⁹よりも優れていました。液滴数が少ない場合は液滴生成中の問題を示している可能性があるため、この記事では、経験的データに基づいてウェルあたり10,000液滴のカットオフを設定しました。

ディスカッション

SARS-CoV-2検出のためのRT-ddPCRアッセイの開発方法に関するリソースはほとんどありません。この記事では使用しませんが、既知のコピーを含む標準サンプルを使用して、アッセイを開発および最適化できます。ただし、この研究では、Vero-E6細胞で増殖したSARS-CoV-2サンプルをヒトゲノムRNAのバックグラウンドでスパイクし、アッセイを開発するための標準サンプルとして使用しました。適切な?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Automated extractor for RNA
AutoDG Oil for Probes	BioRad	12003017	QX200 AutoDG consumable
ddPCR 96-Well Plates	BioRad	12003185
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	BioRad	1863024	Making ddPCR assay mastermix
DG32 AutoDG Cartridges	BioRad	1864108	QX200 AutoDG consumable
Electronic thermostatic water bath pot	Beijing Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Heat inactivation of samples
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit	Genfine Biotech	FMY502T5	Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples
Pierceable Foil Heat Seals	BioRad	1814040
Pipet Tips for the AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG consumable
Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG consumable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	cDNA generation
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	1814000	Seal the droplet plate from AutoDG
QuantaSoft 1.7 Software	BioRad	10026368	Data acquisition and analysis
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Data analysis
QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 AutoDG consumable
QX200 Droplet Reader	BioRad	1864003	Droplet reading and data acquisition
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096	Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation