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Resumen

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Resumen

Las bicapas lipídicas forman la matriz principal de las membranas celulares y son la plataforma principal para el intercambio de nutrientes, las interacciones proteína-membrana y la brotación viral, entre otros procesos celulares vitales. Para una actividad biológica eficiente, las membranas celulares deben ser lo suficientemente rígidas como para mantener la integridad de la célula y sus compartimentos, pero lo suficientemente fluidas como para permitir que los componentes de la membrana, como las proteínas y los dominios funcionales, se difundan e interactúen. Este delicado equilibrio de las propiedades de la membrana elástica y fluida, y su impacto en la función biológica, requieren una mejor comprensión de la dinámica colectiva de la membrana en escalas de tiempo y duración mesoscópicas de procesos biológicos clave, por ejemplo, deformaciones de membrana y eventos de unión a proteínas. Entre las técnicas que pueden sondear eficazmente este rango dinámico se encuentra la espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE). Combinado con el etiquetado de deuterio, NSE se puede utilizar para acceder directamente a las fluctuaciones de flexión y espesor, así como a la dinámica mesoscópica de características de membrana seleccionadas. Este documento proporciona una breve descripción de la técnica NSE y describe los procedimientos para realizar experimentos de NSE en membranas liposomales, incluidos los detalles de la preparación de muestras y los esquemas de deuteración, junto con instrucciones para la recopilación y reducción de datos. El documento también presenta métodos de análisis de datos utilizados para extraer parámetros clave de la membrana, como el módulo de rigidez de flexión, el módulo de compresibilidad del área y la viscosidad en el plano. Para ilustrar la importancia biológica de los estudios de NSE, se discuten ejemplos seleccionados de fenómenos de membrana sondeado por NSE, a saber, el efecto de los aditivos en la rigidez de flexión de la membrana, el impacto de la formación de dominios en las fluctuaciones de la membrana y la firma dinámica de las interacciones membrana-proteína.

Introducción

La comprensión de las membranas celulares y su función ha evolucionado notablemente en las últimas décadas. La visión anterior de las membranas celulares como bicapas lipídicas pasivas que definen los límites celulares y albergan proteínas de membrana1 se ha transformado gradualmente en un modelo dinámico en el que las bicapas lipídicas desempeñan un papel importante en la regulación de los procesos biológicos vitales, incluida la señalización celular, el intercambio molecular y la función de las proteínas, por nombrar algunos2,3,4,5,6. Esta comprensión de que las membranas celulares son altamente dinámicas, en constante remodelación y redistribución molecular, ha impulsado exploraciones científicas más allá de las estructuras de equilibrio de las membranas7,8,9. En consecuencia, se han desarrollado múltiples enfoques para estudiar los diversos modos dinámicos en las membranas lipídicas biológicas y bioinspiradas. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado principalmente en los movimientos moleculares difusivos10,11,12,13 y las fluctuaciones macroscópicas de la forma14,15,16,dejando un vacío significativo en la comprensión de la dinámica intermedia de la membrana, es decir, las fluctuaciones colectivas de los conjuntos de lípidos que consisten en unos pocos 10-100 de moléculas de lípidos. Estas dinámicas ocurren en escalas de longitud de pocas decenas a pocas 100 Å y en escalas de tiempo de sub-ns a unos pocos cientos de ns (ver Figura 1),referidas aquí como escalas mesoscópicas. De hecho, es en estas escalas que la actividad biológica clave tiene lugar a nivel de membrana17. Esto incluye la brotación viral18,la canalización19y las interacciones membrana-proteína20. También es importante señalar que el panorama energético de las proteínas de membrana21,22 muestra que los cambios conformacionales en las proteínas, necesarios para su papel regulador, ocurren en las escalas de tiempons 23 de fluctuaciones colectivas de la membrana, enfatizando aún más la importancia de la dinámica mesoscópica en la función biológica de las membranas celulares y sus análogos bioinspirados20. Este artículo se centra en los dos modos dinámicos mesoscópicos primarios en las membranas lipídicas, a saber, las fluctuaciones de flexión y las fluctuaciones de espesor.

El principal desafío al sondear directamente estos modos de fluctuación es la dificultad de acceder simultáneamente a sus escalas espaciales y temporales utilizando métodos de espectroscopia estándar. El otro desafío es que las técnicas de contacto directo podrían afectar las mismas fluctuaciones que se supone que miden16. Esto se ve agravado por la complejidad composicional y estructural de las membranas biológicas24,25,lo que resulta en características de membrana no homogéneas, incluida la formación de dominios lipídicos26,27,28,29,30 y la asimetría de membrana31,32,33, que exigen sondas selectivas para comprender la dinámica de diferentes características de la membrana. Afortunadamente, estos desafíos pueden superarse con métodos de espectroscopia de neutrones no invasivos, como el eco de espín de neutrones (NSE), que inherentemente accede a las escalas de longitud y tiempo requeridas, y permiten además estudios de características selectivas de la membrana sin cambiar su entorno fisicoquímico34. De hecho, en los últimos años la espectroscopia NSE se ha convertido en una sonda única y poderosa de dinámica colectiva demembranas 35. Los resultados de los estudios de NSE sobre membranas lipídicas han producido nuevos conocimientos sobre las propiedades mecánicas36,37 y viscoelásticas38,39 de las membranas lipídicas y han arrojado nueva luz sobre su papel potencial en la función biológica40,41.

La técnica de espectroscopia NSE se basa en un diseño de instrumento interferométrico, propuesto por primera vez por Mezei42,utilizando una serie de aletas de espín y bobinas magnéticas para controlar la precesión del espín de neutrones a medida que los neutrones atraviesan el instrumento. El diseño se basa en el reflejo magnético de los elementos del campo magnético con respecto a la posición de la muestra (Figura 1A). Esto implica que en ausencia de intercambio de energía entre el neutrón y la muestra, el neutrón realiza el mismo número de precesiones de espín, en direcciones opuestas, en la primera y segunda mitad del instrumento (nótese el π-flipper entre las dos bobinas de precesión). Como resultado, el estado de espín final del neutrón permanece sin cambios en relación con el estado inicial, un fenómeno conocido como espín-eco (ver neutrón transparente en la Figura 1A). Sin embargo, cuando el neutrón interactúa energéticamente con la muestra, el intercambio de energía modifica el número de precesiones de espín en la segunda mitad del instrumento, lo que lleva a un estado de espín final diferente (ver Figura 1A). Esto se detecta experimentalmente como una pérdida en la polarización, como se mostrará más adelante en este artículo. Para obtener más detalles sobre la técnica NSE, se remite al lector a los documentos técnicos dedicados42,43,44,45.

Aquí, se presenta una descripción simplificada para proporcionar una estimación aproximada de la longitud y las escalas de tiempo accesibles con NSE. Las escalas de longitud están determinadas por el rango de transferencias de vector de onda alcanzables, Q = 4π sin θ/λ, donde 2θ es el ángulo de dispersión y λ es la longitud de onda del neutrón. Se puede ver que Q está establecido por el rango de longitud de onda y la extensión de rotación del segundo brazo del espectrómetro (ver Figura 1A). Un rango Qtípico en los espectrómetros NSE es ~ 0.02-2 Å-146,47y hasta 0.01-4 Å-1 con actualizaciones recientes48,49, correspondientes a escalas espaciales de ~ 1-600 Å. Por otro lado, la escala de tiempo accesible se calcula a partir del ángulo de precesión total (o fase) adquirido por el neutrón dentro de las bobinas de precesión magnética, y se encuentra que esde 50: figure-introduction-7895 . En esta expresión, t es el tiempo de Fourier definido como figure-introduction-8035 , donde es la relación figure-introduction-8128 giromagnética de neutrones, figure-introduction-8226 es la longitud de la bobina y es la fuerza del campo magnético de figure-introduction-8362 la bobina. Vale la pena señalar que el tiempo de Fourier es una cantidad que depende estrictamente de la geometría del instrumento, la intensidad del campo magnético y la longitud de onda de los neutrones. Por ejemplo, utilizando neutrones de longitud de onda figure-introduction-8692 = 8 Å y ajustes del instrumento de figure-introduction-8797   = 1,2 m y figure-introduction-8888 = 0,4 T, el tiempo de Fourier se calcula en t ~ 50 ns. Experimentalmente, el tiempo de Fourier se ajusta cambiando la corriente en las bobinas de precesión (es decir, la intensidad del campo magnético) o utilizando diferentes longitudes de onda de neutrones, lo que resulta en escalas de tiempo típicas de NSE de ~ 1 ps a 100 ns. Sin embargo, las actualizaciones recientes en los espectrómetros NSE han permitido el acceso a tiempos Fourier más largos, hasta ~ 400 ns en el espectrómetro J-NSE-Phoenix en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 y el espectrómetro SNS-NSE en el Laboratorio Nacional Oak Ridge48,y hasta ~ 1,000 ns en el espectrómetro IN15 NSE en el Institut Laue-Langevin (ILL)49. 

Además del acceso directo a la escala de tiempo y longitud de la dinámica de membranas, NSE tiene las capacidades inherentes de la sensibilidad a los isótopos de neutrones52. Específicamente, la capacidad de los neutrones para interactuar de manera diferente con los isótopos del hidrógeno, el elemento más abundante en los sistemas biológicos, da como resultado una densidad de longitud de dispersión de neutrones diferente,34 o NSLD (el equivalente al índice óptico de refracción50),cuando el protio es sustituido por deuterio. Esto permite un enfoque conocido como variación de contraste, que se usa comúnmente para resaltar características específicas de la membrana u ocultar otras; este último escenario se conoce como coincidencia de contraste. Una aplicación frecuente de variación/coincidencia de contraste es la sustitución de agua (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) por agua pesada o D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å -2) para amplificar la señal de neutrones de las membranas lipídicas protiatadas (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). Este enfoque es altamente efectivo en estudios de estructura de membrana porque la penetración de D2O en la región del grupo de cabeza de la membrana permite la determinación precisa de los espesores de la membrana (ver Figura 2A,panel izquierdo) y de la ubicación de diferentes subgrupos lipídicos cuando se aplican modelos más sofisticados53,54. Este artículo destaca algunos ejemplos sobre el uso de la variación de contraste para estudios de dinámica colectiva en membranas biomiméticas y características de membrana seleccionadas.

Aquí, la efectividad de NSE para proporcionar información única sobre las propiedades dinámicas y funcionales de la membrana se ilustra a través de ejemplos tangibles de estudios de NSE en sistemas de membrana lipídica modelo y biológicamente relevantes con énfasis en la dinámica de mesoescala en membranas independientes, en forma de suspensiones liposomales. Para las mediciones de NSE de la dinámica de la membrana en el plano, se remite al lector a publicaciones dedicadas a la espectroscopia de espín-eco de neutrones de incidencia de pastoreo (GINSES)55,56 y otros estudios de pilas de membrana multilamelar alineadas57,58,59,60.

Para simplificar, este artículo destaca tres esquemas diferentes de deuteración de membrana ilustrados en un sistema de bicapa lipídica de formación de dominios o separación de fases bien estudiado de mezclas de 1,2-ditiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)61,62. Los dos lípidos se caracterizan por un desajuste en la longitud de su cadena de hidrocarburos (14 carbonos/cola en DMPC vs 18 carbonos/cola en DSPC) y su temperatura de transición gel-fluido (Tm, DMPC = 23 °C vs Tm, DSPC = 55 °C). Esto da como resultado la separación de fases laterales en membranas DMPC:DSPC a temperaturas entre las temperaturas de transición superior e inferior de la mezcla63. Los esquemas de deuteración considerados aquí se eligen para demostrar los diferentes modos dinámicos accesibles en las mediciones de NSE en membranas liposomales, a saber, fluctuaciones de flexión, fluctuaciones de espesor y fluctuaciones selectivas de flexión / espesor de dominios laterales. Todas las composiciones lipídicas se informan para las bicapas DMPC:DSPC preparadas a una fracción molar de 70:30, utilizando variantes protiated y perdeuteradas disponibles comercialmente de DMPC y DSPC. Todos los pasos de preparación de la muestra se basan en 4 mL de suspensión liposomal, en D2O, con una concentración de lípidos de 50 mg/mL, para una masa lipídica total de Mtot = 200 mg por muestra.

Protocolo

1. Esquema de deuteración requerido para el experimento

  1. Para las mediciones de fluctuación de flexión, realice liposomas completamente protiated en D2O (D 99.9%) o D2O-buffer (por ejemplo, tampón de fosfato preparado con D2O en lugar de H2O). Utilice DMPC (C36H72NO8P) y DSPC (C44H88NO8P) totalmente protiados con figure-protocol-459 133,4 mg, donde XDMPC y XDSPC son las fracciones molares de DMPC y DSPC, aquí establecidas en 0,7 y 0,3, respectivamente, y MwDMPC y MwDSPC son los pesos molares dados por 677,9 g/mol y 790,1 g/mol, respectivamente. Del mismo modo, mDSPC = 66,6 mg. Este esquema de deuteración aumenta el contraste de dispersión entre la membrana (NSLD ~ 0 × 10-6 Å -2) y el tampón deuterado (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å -2) y amplifica la señal de las ondulaciones de membrana (ver Figura 2A panel izquierdo).
  2. Para medir la dinámica de flexión de características seleccionadas de la membrana lateral, por ejemplo, dinámica de la matriz en membranas DMPC:DSPC de separación de fase, use DMPC protiatado (C36H72NO8P) y deuterado, DSPC-d83 (C44H5NO8PD83, Mw 873.7 g / mol), de modo que mDMPC = 128.8 mg y mDSPC-d83 = 71.2 mg. Este esquema de deuteración minimiza la dispersión de los dominios ricos en DSPC no deseados, lo que permite mediciones selectivas de las fluctuaciones de flexión de la matriz rica en DMPC (consulte la Figura 2B del medio).
    NOTA: Para encontrar la deuteración lipídica óptima requerida para un esquema específico de coincidencia de contraste, utilice calculadoras de densidad de longitud de dispersión (SLD) disponibles basadas en la web, como la desarrollada por el Centro NIST para la Investigación de Neutrones64. Estas interfaces basadas en la web están equipadas con herramientas fáciles de usar para facilitar el cálculo del SLD de lípidos con varios grados de deuteración, así como el de las mezclas de lípidos.
  3. Para las mediciones de NSE de las fluctuaciones medias del espesor de la membrana (sin contraste lateral), utilice variantes deuteradas de la cola de los lípidos constituyentes, es decir, DMPC-d54 (C36H18NO8PD54, 732,3 g/mol) y DSPC-d70 (C44H18NO8PD70, 860,1 g/mol)35,38, tal que mDMPC-d54 = 133,0 mg y mDSPC-d70 = 67,0 mg. Este esquema de contraste(Figura 2A,panel derecho) amplifica la señal de dispersión de los grupos de cabeza de lípidos (NSLD ~ 4.5 × 10-6 Å -2) haciendo coincidir el grupo de cola (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å -2) con el tampón deuterado que permite la detección de fluctuaciones en el espesor de la membrana.
  4. Para los estudios de fluctuación de espesor de compartimentos de membrana seleccionados, por ejemplo, matriz rica en DMPC, utilice la misma estrategia descrita en el paso 1.2 sustituyendo los lípidos DMPC protiados con sus análogos deuterados de cola, es decir, DMPC-d54, de modo que los dominios ricos en DSPC se emparejen con contraste con el tampón deuterado y la señal de dispersión primaria provenga de la región del grupo de cabeza de la matriz rica en DMPC deuterada en cola.

2. Preparación de suspensión lipídica para extrusión

  1. Calcule la masa de cada componente de la muestra, dependiendo de la composición de la muestra. Como regla general, para muestras con múltiples componentes moleculares, la masa de un componente está dada por su masa molar, Mwi,ponderada por su fracción molar, Xi,y normalizada sobre todos los componentes de tal manera que: figure-protocol-4226 donde Mtot es la masa total, establecida aquí en 200 mg. Vea el ejemplo anterior para las bicapas lipídicas DMPC-DSPC con diferentes esquemas de deuteración.
  2. Usando una semimicrapalanza digital, sopese las masas calculadas de lípidos (y otros componentes de la muestra, por ejemplo, proteínas, nanopartículas, etc.) y agréguelas a un vial o matraz de fondo redondo; recuerde pesar el vial o matraz de antemano. Agregue 1 ml de disolvente para disolver los componentes pesados mezclando manualmente dentro de una campana. Para muestras de lípidos puros, use cloroformo o etanol. Para muestras con componentes adicionales no lipídicos (por ejemplo, nanopartículas), elija un disolvente común que disperse todos los componentes.
    1. Para pequeñas cantidades de lípidos (<10 mg), prepare una solución de caldo y pipetee el volumen requerido en la mezcla.
      NOTA: No agregue cantidades excesivas de solvente, ya que ralentizará significativamente el paso de secado con solvente que se describe a continuación.
  3. Seque la solución lipídica, dentro de una campana, transmitiendo suavemente un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno, argón) en el vial mientras gira lentamente el vial en ángulo. Mantenga los viales en posición inclinada para crear una película delgada de lípidos secos en las paredes del vial, lo que permitirá un secado uniforme. Coloque intermitentemente el vial en un baño de agua a 35 °C para evitar el enfriamiento mediado por evaporación, lo que ralentizará la evaporación del disolvente.
  4. Coloque los viales durante la noche en un horno al vacío a ~ 35 ° C para eliminar completamente el disolvente residual. Para los lípidos insaturados, purgue el vacío con un gas inerte para minimizar la oxidación.
  5. Para garantizar la eliminación completa del disolvente, pese el vial después del secado de lípidos y confirme que no hay exceso de masa más allá de las cantidades medidas de materiales. Haga esto restando la masa del vial de la masa medida después del secado. Si hay exceso de masa, seque la muestra al vacío durante otras 6 h. Repita este proceso según sea necesario.
  6. Hidratar la película lipídica con 4 mL de D2O o D2O-buffer para obtener una concentración lipídica de 50 mg/mL. Para lípidos con altas temperaturas de transición, como las mezclas DMPC-DSPC, caliente el tampón por encima de la temperatura de transición (60 ° C) para garantizar una mezcla uniforme.
    NOTA: Dado que los experimentos con NSE requieren volúmenes de muestra relativamente grandes (~4 ml), considere la posibilidad de hidratar la muestra utilizando la mitad del tampón requerido, es decir, 2 ml, para minimizar el número de extrusiones por muestra (ver sección 3). En este caso, agregue la mitad restante del búfer después de la extrusión. Tenga en cuenta que la capacidad de las jeringas utilizadas en la extrusión está limitada a 1 ml. Por lo tanto, hidratarse con 4 ml de tampón requeriría cuatro series de extrusión.
  7. Mezcle con vórtice la solución lipídica hidratada hasta que la película lipídica se disuelva por completo y ya no sea visible en las paredes del vial. En esta etapa, los lípidos hidratados forman vesículas multilamelares y pilas multilamelares de tamaño micrométrico y la suspensión aparece de color blanco lechoso.
  8. Para facilitar la rotura de las pilas de lípidos y reducir la multilamelaridad, realice cinco ciclos de congelación/descongelación colocando el vial de solución lipídica hidratada en un congelador de grado de laboratorio (preferiblemente congelador de -80 °C) hasta que esté completamente congelado y luego transfiriendo el vial a un baño de agua de 35 °C hasta que la solución lipídica se descongele por completo. Vórtice la solución descongelada hasta que sea homogénea. Repetir cuatro veces más.
    NOTA: Alternativamente, se puede preparar un baño de hielo seco para una congelación rápida combinando acetona y hielo seco.

3. Extrusión de la solución lipídica hidratada

  1. Ensamble la configuración de la extrusora utilizando una membrana de policarbonato entre dos soportes de membrana y agregando dos filtros de papel en cada lado para proporcionar un soporte adicional. Use una membrana de policarbonato con un tamaño de poro que coincida con el tamaño liposomal objetivo (los tamaños de poro comunes para los experimentos de NSE son 50 nm y 100 nm; por lo general, los liposomas de 100 nm de diámetro permiten fluctuaciones de membrana menos restringidas, pero se podrían usar liposomas más pequeños de 50 nm para estudios de curvatura). Asegúrese de que la membrana de policarbonato esté completamente estirada antes de completar el ensamblaje y apretar la carcasa externa del extrusor.
  2. Hidrate la membrana de policarbonato pasando ~ 0.3 mL de D2O o D2O-buffer varias veces a través del conjunto de membrana usando jeringas de vidrio herméticas. Utilice el mismo búfer utilizado en la preparación de muestras. Déjelo durante al menos 10 minutos, luego succione completamente el búfer antes de introducir la muestra.
  3. Llene una jeringa hermética al gas de 1 ml con la solución lipídica preparada e insértela en un extremo del aparato extrusor. Luego, inserte una jeringa vacía en el extremo opuesto. Una vez que las jeringas estén conectadas al conjunto de la extrusora, colóquela en el bloque de la extrusora.
  4. Si se necesitan temperaturas elevadas para la extrusión, como en el caso de los lípidos saturados con altas temperaturas de transición (por ejemplo, DSPC, Tm = 55 °C), precaliente el bloque de calentamiento del extrusor por encima de la temperatura de transición lipídica (por ejemplo, 60 °C), colocando el bloque calefactor en una placa caliente o utilizando un baño de circulación como se muestra en la Figura 3A.
    NOTA: Este paso es crucial para garantizar una mezcla homogénea de lípidos y para evitar ejercer una presión extrema durante la extrusión, lo que podría romper la membrana de policarbonato. Para muestras de lípidos con bajas temperaturas de transición (<25 °C), realice la extrusión a temperatura ambiente.
  5. Para extruir la solución lipídica, conecte el conjunto de extrusoras a una bomba de jeringa programable con un marco de aluminio/acero como se muestra en la Figura 3A. Para extrusiones con temperatura controlada, agregue una base de extrusora personalizada con un canal de fluido y conéctela a un baño de agua circulante.
  6. Programe la bomba de jeringa para realizar 15-20 ciclos de extrusión siguiendo el manual del fabricante. Cuando se extruye, el color de la solución lipídica cambia de blanco lechoso a azul ópalo transparente(Figura 3B,C),lo que indica un tamaño liposomal final que es más pequeño que la longitud de onda de la luz visible, como se esperaba. Para el tipo de bomba de jeringa que se muestra en la Figura 3A,siga los pasos a continuación.
    1. Comience ajustando la configuración de la bomba. Mantenga pulsado el botón Velocidad e introduzca la velocidad de extrusión (50,99 ml/h), pulse el botón Diámetro e introduzca el diámetro de la jeringa (4,606 mm). Use las flechas hacia arriba debajo de cada dígito en la pantalla para cambiar ese valor de dígito.
    2. Coloque el juego de extrusoras con la jeringa de muestra a la derecha (consulte la Figura 3A). Pulse el botón Retirar hasta que se encienda la luz de retirada. Presione Inicio y espere a que la muestra se dispense en la jeringa izquierda (vacía).
    3. Presione el botón Detener justo antes de que la jeringa de muestra (derecha) esté completamente vacía. Registre el volumen dispensado y utilítelo para programar el ciclo de extrusión. Mantenga pulsado el botón Tasa hasta que aparezca la fase 1 (PH:01) en la pantalla. Pulse el botón Volumen para introducir el volumen dispensado registrado anteriormente. En esta fase, asegúrese de que la luz De extracción esté apagada, lo que dispensa la muestra en la dirección correcta.
    4. Pulse de nuevo el botón Tasa y utilice la flecha hacia arriba más a la derecha para acceder a la fase 2 (PH:02). Pulse Volumen para introducir el mismo valor del volumen dispensado registrado anteriormente. En esta fase, presione el botón Retirar hasta que la luz Retirar esté encendida, lo que dispensa la muestra hacia la izquierda.
    5. Para repetir este ciclo, presione el botón Tasa nuevamente y use la flecha hacia arriba más a la derecha para acceder a la fase 3 (PH: 03). Presione el botón Volumen hasta que LP: SE aparezca en la pantalla y configátelo en 20. Este es el número de bucles o repeticiones que realizará la bomba. Finalmente, presione el botón Tasa, acceda a la fase 4 (PH: 04) y presione el botón Volumen para llegar a la función Detener. La bomba ahora está configurada para la extrusión automatizada.
    6. Pulse Inicio para iniciar el ciclo de extrusión.
  7. Vacíe la jeringa que contiene la suspensión de lípidos extruidos en un vial limpio y prepárela para el almacenamiento o las mediciones. Para muestras de lípidos con alta temperatura de fusión, almacene la muestra por encima de la transición de fase fluida hasta que se mida. De lo contrario, mantenga las muestras a temperatura ambiente.
  8. No congele las muestras extruidas, ya que la congelación hará que las vesículas se rompan (la suspensión volverá a ser de color blanco lechoso).

4. Mediciones de NSE para la(s) muestra(s) y reducción de los datos recogidos

  1. Antes del experimento NSE, caracterizar la muestra liposomal extruida del paso 3.7 utilizando los métodos disponibles para garantizar una calidad de muestra adecuada. En la sección de discusión se incluye una lista de posibles métodos de charcaterización que se pueden utilizar para evaluar la calidad de las suspensiones liposomales para experimentos de NSE, por ejemplo, distribución de tamaño, multilamelaridad, estructura de membrana lateral.
  2. Determine el rango Q y la configuración del instrumento correspondiente requerida para el experimento. Para las mediciones de rigidez de flexión de bicapas lipídicas, use un rango Q de ~(0.04 - 0.2) Å-1. Para estudios de fluctuaciones de espesor de membrana, use un rango Q de ~(0.04 - 0.2) Å-1 correspondiente al espesor de membrana35,66,67.
    NOTA: Discuta la configuración experimental con el científico del instrumento antes del inicio del experimento. Como se mencionó anteriormente, la caracterización SANS de la muestra es necesaria, especialmente si no se dispone de información previa de la señal de dispersión, como en las membranas deuteradas selectivamente. Alternativamente, ejecute mediciones estáticas (también conocidas como difracción) en un rango Q limitado en el instrumento NSE, con la advertencia de que tales mediciones toman mucho más tiempo en comparación con SANS.
  3. Usando una jeringa o una pipeta de transferencia, cargue la(s) suspensión(es) liposomal(es) extruida(s) en las células de muestra designadas disponibles en las líneas de haz de NSE. Tenga en cuenta que las células de muestra NSE estándar vienen en espesores de 1, 2, 3 y 4 mm. Elija el grosor de la celda de tal manera que optimice la señal de dispersión mientras mantiene la señal de fondo incoherente a una intensidad razonable.
    NOTA: Como regla general, use células de muestra con una longitud de ruta de 1 o 2 mm para liposomas protiados en tampón deuterado: las células más gruesas podrían provocar múltiples efectos de dispersión que son difíciles de corregir. Para los liposomas con niveles más altos de deuteraciones (por ejemplo, liposomas con contraste de cola o liposomas asimétricos con valvas protiadas únicas), considere el uso de una célula de muestra más gruesa (por ejemplo, longitud de ruta de 3 o 4 mm) para mejorar las estadísticas de conteo si la muestra está disponible en cantidades más grandes, a veces esto puede ser prohibitivo.
  4. Prepare una celda de muestra idéntica para el búfer. Use el mismo tampón que en la suspensión liposomal. Las mediciones en el búfer son necesarias para la normalización de la intensidad y las correcciones de fondo (BKG).
  5. Coloque la(s) celda(s) de muestra en el soporte de muestra del espectrómetro NSE, programe las ejecuciones de medición y recopile datos de eco. Consulte con el científico del instrumento sobre la programación de las mediciones si es la primera vez que se usuario de NSE.
  6. Realice dos conjuntos adicionales de mediciones necesarias para la reducción de datos: mediciones de resolución (R) y transmisión (T).
    1. Realizar la medición de resolución(R)en una referencia de dispersión elástica (por ejemplo, carbono), que se ejecutará bajo la misma configuración; es decir, el mismo vector de onda y las mismas veces que las mediciones de muestra y tampón.
    2. Realizar mediciones de transmisión(T)en la muestra y el búfer para calcular la intensidad del haz de neutrones transmitido (véase el paso 4.9. a continuación). La transmisión se calcula como la relación de recuentos de neutrones de la muestra o tampón dividida por los recuentos de neutrones para un haz abierto (es decir, con una posición de muestra vacía).
  7. Utilice el software de reducción de datos dedicado para el espectrómetro NSE en el que se realizan las mediciones para reducir los datos recopilados.
    NOTA: Diferentes espectrómetros pueden utilizar diferentes software o interfaces de usuario. A continuación se muestra un ejemplo de reducción de datos NSE utilizando el Entorno de Análisis y Visualización de Datos (DAVE)68 software escrito específicamente para el espectrómetro NSE en el Centro de Investigación de Neutrones del NIST.
    1. Abra el software DAVE y seleccione Reducir datos NSE en el menú de reducción de datos. Aparecerán varias ventanas emergentes.
    2. Cargue los archivos de datos sobre diferentes valores Q utilizando el menú Abrir archivos .echo del menú archivo. Estos archivos corresponden a los archivos de datos sin procesar con las señales de eco de giro y tienen la extensión .echo en el nombre del archivo. Una vez que se complete la carga de archivos, los archivos se mostrarán debajo de los conjuntos de datos disponibles.
    3. Haga clic derecho en el archivo seleccionado y etiquételo de acuerdo con la medida a la que corresponde; es decir, Muestra, Celda (para celda vacía o búfer) o Resolución.
    4. Agrupo los pixles del detector en 2 x 2 para mejorar la relación señal-ruido utilizando la pestaña Conjunto de datos. Aplicar el mismo binning a todos los archivos; es decir, Resolución, Celda y Muestra.
    5. Inspeccione los datos en todos los grupos de píxeles y enmascare aquellos con señales deficientes (consulte la Figura 4B)presionando la tecla m en el teclado. Presione Entrar para acceder a una ventana emergente para aplicar la misma máscara a todas las veces de Fourier o posteriores de Fourier. Esto también se puede aplicar a píxeles individuales en cualquier punto durante la reducción de datos. Los píxeles enmascarados se volverán verdes.
    6. Asegúrese de que los datos recopilados estén en forma de una señal de eco, es decir, una función de coseno en términos de la corriente de fase, sobre cada píxel del detector (consulte la Figura 4A).
      NOTA: La corriente de fase es proporcional al ángulo de precesión del espín de neutrones; por lo tanto, es común representar la corriente de fase como un ángulo de fase como se muestra en la Figura 4A. Para las mediciones en fuentes pulsadas, se aplican cálculos adicionales de tiempo de vuelo a los datos para obtener las señales de eco en función de la longitud de onda de neutrones incidentes dentro de un pulso de neutrones.
    7. Comience por ajustar el archivo de resolución. Seleccione un archivo de resolución de la lista de archivos cargados y haga clic con el botón derecho en el archivo. Seleccione Operaciones de ajuste: Ajustar ecos (resolución) en el menú emergente.
    8. Asegúrese de que los ajustes de las señales de eco producen una serie de parámetros de ajuste, incluido el parámetro A, requerido en el paso 4.8. Los ajustes se realizan automáticamente utilizando la siguiente expresión.
      figure-protocol-21402
      Aquí, ζ es el período de la señal de eco (es decir, la función del coseno en la Figura 4A),σ es el ancho de la envoltura gaussiana determinado por la longitud de onda media y la extensión de la longitud de onda del haz de neutrones incidente, Φc es la corriente de fase y Φ0 es el punto de eco que depende de la trayectoria del campo experimentado por los neutrones50. La información física sobre la muestra está codificada en la amplitud, A, de la función coseno en la ecuación (1).
      NOTA: El ancho de la envolvente gaussiana se basa en valores predeterminados por el científico del instrumento y no debe cambiarse. Los otros parámetros son variables que se ajustan a la señal de eco específica sobre cada píxel.
    9. Inspeccione los resultados de ajuste haciendo clic en cada píxel para mostrar los parámetros de ajuste resultantes, la calidad del ajuste y la desviación cuadrada media del ajuste. Para inspeccionar el error asociado con cada parámetro de conexión en todo el detector, seleccione Opciones de imagen y, a continuación, seleccione el parámetro de conexión de interés. Esto generará un mapa con el valor del parámetro de ajuste sobre cada píxel. Haga clic con el botón derecho en la imagen del detector. Aparecerá una ventana emergente que muestra un mapa de barra de error del parámetro de conexión seleccionado.
    10. Si el ajuste sobre un píxel específico no es satisfactorio (por ejemplo, ajustar parameeters con barras de error grandes), reajuste la señal sobre ese píxel específico. Seleccione ese píxel, presione la ficha Conexión y, a continuación, presione Ajustar píxel. Introduzca nuevos parámetros de partida para la fase (Φ0) y el período (ζ) en la ficha Fitting para obtener un ajuste más satisfactorio.
      NOTA: Es útil trazar la fase ajustada en función del tiempo de Fourier. Para hacerlo, vaya a la ventana principal de la trama y seleccione Fit Phase v. Fourier Time. Esta trama debe ser lisa y continua. Inspeccione las discontinuidades en esta gráfica y reajuste los píxeles a los que corresponden.
  8. Reduzca el archivo de muestra o celda seleccionando el archivo correspondiente de la lista de archivos cargados y etiquetados.
    1. Inspeccione todos los píxeles y enmascare los que tienen estadísticas incorrectas como se describe en el paso 4.7.5.
    2. Haga clic con el botón derecho en el archivo y seleccione Operaciones de ajuste: Importar fases (muestra, celda). Esto importa las fases y la máscara aplicada desde el archivo de resolución.
    3. Ajuste las señales de eco utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente para el archivo de resolución (pasos 4.7.8-4.7.10). Al ajustar los archivos de muestra y celda, no cambie los valores del punto de fase de punto y fase de eco importados desde los ajustes de resolución. Estos parámetros dependen de la configuración instrumental y no deben variar con las muestras.
    4. Antes de proceder a la reducción de datos, ingrese el centro de haz para todos los archivos de datos. Seleccione el archivo de datos, vaya a la pestaña General e introduzca los valores del centro de haz X e Y. Estos valores se registran durante el experimento.
    5. Una vez que se completen los ajustes a los archivos de muestra, celda y resolución, calcule la función de dispersión intermedia normalizada que se utilizará más adelante en el análisis e interpretación de datos. Para hacer eso, haga clic derecho en el archivo de muestra que se reducirá de la lista de archivos ajustados y seleccione Calcular I (Q) en el menú emergente. Aparecerá una ventana con opciones de entrada para los archivos Resolución y Celda (es decir, búfer) y el número de Q-arcs (consulte el paso 4.9). Después de ingresar toda la información requerida, presione el botón OK. Los resultados aparecerán en una nueva ventana.
      NOTA: La reducción de datos se realiza de acuerdo con la siguiente ecuación para obtener la función de dispersión intermedia normalizada69.
      figure-protocol-25776
      donde t es el tiempo de Fourier, Narriba y Nabajo son los recuentos de neutrones en las configuraciones no spin-flip y spin-flip (medidas con las π/2-flippers apagados y el π-flipper apagado y encendido, respectivamente), y los superíndices, BKG y R,corresponden a las mediciones de fondo y resolución, respectivamente, como se define en los pasos 4.4 y 4.6. Nótese que la polarización del figure-protocol-26305 haz, por lo tanto, los cambios en el estado de espín debido al intercambio de energía entre el neutrón y la muestra se detecta como una caída en la polarización (desde la unidad).
  9. Finalmente, agrupo los píxeles del detector en Q-arcos como se muestra en la Figura 4B para obtener la Q-dependenciade la función de dispersión intermedia normalizada, S(Q,t) / S(Q,0). Esto se conoce técnicamente como agrupación de datos y debe hacerse juiciosamente, es decir, teniendo en cuenta las estadísticas de conteo de la muestra y la desviación estándar esperada de los datos sobre los píxeles agrupados.
  10. Para muestras de dispersión fuerte, divida el detector en más arcos Q mientras mantiene barras de error razonables en la función de dispersión intermedia resultante, S(Q,t) / S(Q,0). Esto produce más puntos de datos Q y es importante para el procedimiento de análisis de datos que se describe a continuación. Tenga en cuenta que para muestras de dispersión débil, el binning excesivo da como resultado señales de desintegración deficientes, es decir, grandes barras de error en S(Q,t) / S(Q, 0 ), lo que podría resultar en grandes incertidumbres.

5. Análisis e interpretación de datos

  1. Ajustar las funciones de dispersión intermedia normalizadas, S(Q,t) / S(Q,0 ), obtenidas de la reducción de datos anterior a una función exponencial estirada con un exponente de estiramiento de 2/370.
    figure-protocol-28084
    NOTA: Un ejemplo de estos ajustes se proporciona en la Figura 5B. Los ajustes de S(Q,t) / S(Q,0) a la ecuación (3) producen las tasas de relajación dependientes de Q Γ(Q).
  2. Trazar Γ(Q) en función de Q y ajustarse a un modelo adecuado para extraer los parámetros relevantes de la membrana.

Resultados

Los estudios de NSE que acceden a las fluctuaciones de flexión se realizan típicamente en un rango Q de ~ (0.04 - 0.2) Å-1. Este rango Q corresponde a escalas de longitud intermedia entre el grosor de la membrana y el radio liposomal, donde domina la dinámica de flexión. La medición en un rango Q extendido puede dar acceso a modos dinámicos adicionales, incluida la difusión liposomal y la dinámica intramembrana. Para obtener más detalles sobre el cruce en la dinámica de membranas a la que accede NSE...

Discusión

NSE es una técnica poderosa y única en la medición de la dinámica mesoscópica de las membranas lipídicas bajo diversas condiciones. La utilización efectiva de NSE depende de la calidad de la muestra, el contraste de neutrones y el rango de dinámica accesible que se puede sondear para una muestra determinada. Por lo tanto, se requieren varios pasos críticos para realizar experimentos exitosos de NSE y recopilar datos de alta calidad. Un paso clave para garantizar el uso efectivo del tiempo de haz de neutrones dur...

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses y no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

R. Ashkar gracias M. Nagao, L.-R. Stingaciu y P. Zolnierczuk por muchas discusiones útiles y por su frecuente asistencia con experimentos de NSE en sus respectivas líneas de haz. Los autores reconocen el uso de espectrómetros de eco de espín de neutrones en NIST y ORNL. El espectrómetro NSE en el NIST cuenta con el apoyo del Centro de Dispersión de Neutrones de Alta Resolución, una asociación entre el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología y la Fundación Nacional de Ciencias bajo el acuerdo no. DMR-1508249. El espectrómetro NSE en la fuente de neutrones de espalación de ORNL cuenta con el apoyo de la División de Instalaciones de Usuarios Científicos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. El Laboratorio Nacional de Oak Ridge es administrado por UT-Battelle, LLC bajo el Contrato No. DE-AC05-00OR22725.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloroform (biotech grade)Sigma Aldrich496189Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bathJulaboSE-12Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium OxideCambridge Isotopes LaboratoriesDLM-4Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-MicrobalanceMettler ToledoMS105Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)Sigma AldrichE7023200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass PipetsVWR36360-536Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass VialsThermo ScientificB7990-1Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezerFisher ScientificIU2886DUltra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)Avanti Polar Lipidsvaries by lipidLipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifierMillipore SigmaZRQSVP3USDirect-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder SetAvanti Polar Lipids610020Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect FittingsGrainger2YDA1 and 2YDA7Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe PumpSyringePump.comNew Era-1000Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bathFisher ScientificCPX2800Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum OvenThermo Scientific36080.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex MixerFisher Scientific02-215-414Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

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  94. Sharma, V. K., Mamontov, E., Anunciado, D. B., O'Neill, H., Urban, V. S. Effect of antimicrobial peptide on the dynamics of phosphocholine membrane: role of cholesterol and physical state of bilayer. Soft Matter. 11 (34), 6755-6767 (2015).
  95. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Collective dynamics in lipid membranes containing transmembrane peptides. Soft Matter. , (2021).
  96. Yu, J., et al. Structure and dynamics of lipid membranes interacting with antivirulence end-phosphorylated polyethylene glycol block copolymers. Soft Matter. 16 (4), 983-989 (2020).
  97. Stingaciu, L. -. R., et al. Revealing the dynamics of thylakoid membranes in living cyanobacterial cells. Scientific Reports. 6 (1), 19627 (2016).
  98. Stingaciu, L. -. R., O'Neill, H. M., Liberton, M., Pakrasi, H. B., Urban, V. S. Influence of chemically disrupted photosynthesis on cyanobacterial thylakoid dynamics in synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 9 (1), 5711 (2019).
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  100. Nagao, M. Observation of local thickness fluctuations in surfactant membranes using neutron spin echo. Physical Review E. 80 (3), 031606 (2009).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

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