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In diesem Artikel

  • Erratum Notice
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  • Protokoll
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  • Diskussion
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Erratum Notice

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Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle für die Probenvorbereitung, Datenreduktion und Datenanalyse in Neutronenspinechostudien (NSE) von Lipidmembranen. Eine umsichtige Deuteriummarkierung von Lipiden ermöglicht den Zugang zu unterschiedlichen Membrandynamiken auf mesoskopischen Längen- und Zeitskalen, über die lebenswichtige biologische Prozesse ablaufen.

Zusammenfassung

Lipiddoppelschichten bilden die Hauptmatrix der Zellmembranen und sind die primäre Plattform für Nährstoffaustausch, Protein-Membran-Interaktionen und virale Knospung, neben anderen lebenswichtigen zellulären Prozessen. Für eine effiziente biologische Aktivität sollten Zellmembranen starr genug sein, um die Integrität der Zelle und ihrer Kompartimente aufrechtzuerhalten, aber flüssig genug, um Membrankomponenten wie Proteine und funktionelle Domänen zu zerstreuen und interagieren zu lassen. Dieses empfindliche Gleichgewicht zwischen elastischen und flüssigen Membraneigenschaften und deren Einfluss auf die biologische Funktion erfordern ein besseres Verständnis der kollektiven Membrandynamik über mesoskopische Längen- und Zeitskalen wichtiger biologischer Prozesse, z. B. Membranverformungen und Proteinbindungsereignisse. Zu den Techniken, die diesen Dynamikbereich effektiv untersuchen können, gehört die Neutronenspinechospektroskopie (NSE). In Kombination mit der Deuterium-Markierung kann NSE verwendet werden, um direkt auf Biege- und Dickenschwankungen sowie auf die mesoskopische Dynamik ausgewählter Membranmerkmale zuzugreifen. Dieses Papier bietet eine kurze Beschreibung der NSE-Technik und beschreibt die Verfahren zur Durchführung von NSE-Experimenten an liposomalen Membranen, einschließlich Details zur Probenvorbereitung und Deuteration von Schemata sowie Anweisungen zur Datenerhebung und -reduktion. Das Papier stellt auch Datenanalysemethoden vor, die verwendet werden, um wichtige Membranparameter wie den Biegesteifigkeitsmodul, den Flächenkompressibilitätsmodul und die Viskosität in der Ebene zu extrahieren. Um die biologische Bedeutung von NSE-Studien zu veranschaulichen, werden ausgewählte Beispiele für Membranphänomene diskutiert, die von NSE untersucht wurden, nämlich die Wirkung von Additiven auf die Membranbiegesteifigkeit, den Einfluss der Domänenbildung auf Membranfluktuationen und die dynamische Signatur von Membran-Protein-Interaktionen.

Einleitung

Das Verständnis von Zellmembranen und ihrer Funktion hat sich in den letzten Jahrzehnten bemerkenswert weiterentwickelt. Die frühere Sichtweise von Zellmembranen als passive Lipiddoppelschichten, die Zellgrenzen definieren und Membranproteine1 beherbergen, hat sich allmählich in ein dynamisches Modell verwandelt, in dem Lipiddoppelschichten eine wichtige Rolle bei der Regulierung lebenswichtiger biologischer Prozesse spielen, einschließlich zellulärer Signalgebung, molekularer Austausch und Proteinfunktion - um nur einige zu nennen2,3,4,5,6. Diese Erkenntnis, dass Zellmembranen hochdynamisch sind und ständig umgestaltet und molekular umverteilt werden, hat wissenschaftliche Erkundungen jenseits der Gleichgewichtsstrukturen der Membranen7,8,9vorgeben. Dementsprechend wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die verschiedenen dynamischen Modi in biologischen und bioinspirierten Lipidmembranen zu untersuchen. Bisher konzentrierte sich die Mehrheit dieser Studien hauptsächlich auf diffusive molekulare Bewegungen10 , 11,12,13 und makroskopische Formfluktuationen14,15,16, die eine signifikante Lücke im Verständnis der mittleren Membrandynamik hinterlassen, d.h. kollektive Fluktuationen von Lipidanordnungen, die aus wenigen 10-100s Lipidmolekülen bestehen. Diese Dynamik tritt über Längenskalen von wenigen zehn bis wenigen 100 Å und über Zeitskalen von Sub-ns bis zu einigen hundert ns auf (siehe Abbildung 1),hier als mesoskopische Skalen bezeichnet. Auf diesen Skalen findet die biologische Schlüsselaktivität auf derMembranebene 17statt. Dazu gehören virale Knospen18, Kanal-Gating19und Membran-Protein-Interaktionen20. Es ist auch wichtig darauf hinzuweisen, dass die Energielandschaft der Membranproteine21,22 zeigt, dass Konformationsänderungen in Proteinen - notwendig für ihre regulatorische Rolle - über die ns-Zeitskalen23 kollektiver Membranfluktuationen stattfinden, was die Bedeutung der mesoskopischen Dynamik in der biologischen Funktion von Zellmembranen und ihren bioinspirierten Analoga weiter unterstreicht20. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die beiden primären mesoskopischen dynamischen Modi in Lipidmembranen, nämlich Biegeschwankungen und Dickenschwankungen.

Die größte Herausforderung bei der direkten Untersuchung dieser Fluktuationsmodi ist die Schwierigkeit, gleichzeitig auf ihre räumlichen und zeitlichen Skalen mit Standardspektroskopiemethoden zuzugreifen. Die andere Herausforderung besteht darin, dass direkte Kontakttechniken die gleichen Schwankungen beeinflussen könnten, die sie messen sollen16. Dies wird durch die kompositorische und strukturelle Komplexität der biologischen Membranen24,25nochverschärft,was zu inhomogenen Membranmerkmalen führt, einschließlich der Lipiddomänenbildung26,27,28,29,30 und Membranasymmetrie31,32,33- die selektive Sonden erfordern, um die Dynamik verschiedener Membranmerkmale zu verstehen. Glücklicherweise können diese Herausforderungen mit nicht-invasiven Neutronenspektroskopiemethoden wie Neutronenspinecho (NSE) überwunden werden, die von Natur aus auf die erforderlichen Längen- und Zeitskalen zugreifen und weitere Untersuchungen selektiver Membranmerkmale ermöglichen, ohne ihre physikalisch-chemische Umgebung zu verändern34. Tatsächlich hat sich die NSE-Spektroskopie in den letzten Jahren zu einer einzigartigen und leistungsstarken Sonde der kollektiven Membrandynamik entwickelt35. Ergebnisse aus NSE-Studien an Lipidmembranen haben neue Erkenntnisse über mechanische36,37 und viskoelastische38,39 Eigenschaften von Lipidmembranen geliefert und ein neues Licht auf ihre mögliche Rolle in der biologischen Funktion geworfen40,41.

Die NSE-Spektroskopietechnik basiert auf einem interferometrischen Instrumentendesign, das erstmals von Mezei42vorgeschlagen wurde und eine Reihe von Spin-Flippern und Magnetspulen verwendet, um die Präzession des Neutronenspins zu steuern, während Neutronen das Instrument durchqueren. Das Design beruht auf der magnetischen Spiegelung der Magnetfeldelemente in Bezug auf die Probenposition (Abbildung 1A). Dies bedeutet, dass das Neutron in Abwesenheit eines Energieaustauschs zwischen dem Neutron und der Probe in der ersten und zweiten Hälfte des Instruments die gleiche Anzahl von Spin-Präzessionen in entgegengesetzte Richtungen durchführt (beachten Sie den π-Flipper zwischen den beiden Präzessionsspulen). Infolgedessen bleibt der endgültige Spinzustand des Neutrons relativ zum Ausgangszustand unverändert - ein Phänomen, das als Spin-Echo bezeichnet wird (siehe transparentes Neutron in Abbildung 1A). Wenn das Neutron jedoch energetisch mit der Probe wechselwechselt, verändert der Energieaustausch die Anzahl der Spin-Präzessionen in der zweiten Hälfte des Instruments, was zu einem anderen endgültigen Spin-Zustand führt (siehe Abbildung 1A). Dies wird experimentell als Polarisationsverlust nachgewiesen, wie später in diesem Artikel gezeigt wird. Für weitere Einzelheiten zur NSE-Technik wird der Leser auf die speziellen technischen Papiere42,43,44,45verwiesen.

Hier wird eine vereinfachte Beschreibung präsentiert, um eine grobe Schätzung der Längen- und Zeitskalen zu liefern, die mit NSE zugänglich sind. Die Längenskalen werden durch den Bereich der erreichbaren Wellenvektortransfers bestimmt, Q = 4π sin θ/λ, wobei 2θ der Streuwinkel und λ die Neutronenwellenlänge ist. Man kann sehen, dass Q durch den Wellenlängenbereich und das Ausmaß der Rotation des zweiten Arms des Spektrometers eingestellt wird (siehe Abbildung 1A). Ein typischer Q-Bereichauf NSE-Spektrometern ist ~0,02-2 Å-146,47und bis zu 0,01-4 Å-1 mit den jüngsten Upgrades48,49, entsprechend räumlichen Skalen von ~ 1-600 Å. Auf der anderen Seite wird die zugängliche Zeitskala aus dem gesamten Präzessionswinkel (oder der Phase) berechnet, der vom Neutron innerhalb der magnetischen Präzessionsspulen erfasst wird, und es wird festgestellt, dasses 50: figure-introduction-7810 . In diesem Ausdruck ist t die Fourierzeit, definiert als figure-introduction-7947 , wobei das figure-introduction-8029 Neutronen-Gyromagnet-Verhältnis, figure-introduction-8132 die Spulenlänge und figure-introduction-8222 die Stärke des Magnetfeldes der Spule ist. Es ist erwähnenswert, dass die Fourierzeit eine Größe ist, die streng von der Instrumentengeometrie, der Magnetfeldstärke und der Neutronenwellenlänge abhängt. Zum Beispiel wird die Fourierzeit unter Verwendung von Neutronen mit einer Wellenlänge figure-introduction-8582 = 8 Å und Instrumenteneinstellungen von figure-introduction-8692   = figure-introduction-8775 1,2 m und = 0,4 T als t ~ 50 ns berechnet. Experimentell wird die Fourierzeit durch Änderung des Stroms in den Präzessionsspulen (d. H. Magnetfeldstärke) oder unter Verwendung verschiedener Neutronenwellenlängen abgestimmt, was zu typischen NSE-Zeitskalen von ~ 1 ps bis 100 ns führt. Jüngste Upgrades bei NSE-Spektrometern haben jedoch den Zugriff auf längere Fourier-Zeiten ermöglicht, bis zu ~ 400 ns auf dem J-NSE-Phoenix-Spektrometer am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 und dem SNS-NSE-Spektrometer am Oak Ridge National Lab48und bis zu ~ 1.000 ns am IN15 NSE-Spektrometer am Institut Laue-Langevin (ILL)49. 

Neben dem direkten Zugriff auf die Längen- und Zeitskala der Membrandynamik verfügt NSE über die inhärenten Fähigkeiten der Neutronenisotopenempfindlichkeit52. Insbesondere die Fähigkeit von Neutronen, unterschiedlich mit den Isotopen von Wasserstoff, dem am häufigsten vorkommenden Element in biologischen Systemen, zu interagieren, führt zu einer anderen Neutronenstreulängendichte,34 oder NSLD (das Äquivalent des optischen Brechungsindex50),wenn Protium durch Deuterium ersetzt wird. Dies ermöglicht einen Ansatz, der als Kontrastvariation bekannt ist und häufig verwendet wird, um bestimmte Membranmerkmale hervorzuheben oder andere zu verbergen - das letztere Szenario wird als Kontrastabgleich bezeichnet. Eine häufige Anwendung von Kontrastvariation/Matching ist die Substitution von Wasser (NSLD = -0,56 × 10-6 Å-2) durch schweres Wasser oderD2O (NSLD = 6,4 × 10-6 Å-2), um das Neutronensignal von protiierten Lipidmembranen (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) zu verstärken. Dieser Ansatz ist bei Untersuchungen der Membranstruktur sehr effektiv, da das Eindringen vonD2Oin den Kopfgruppenbereich der Membran eine genaue Bestimmung der Membrandicken (siehe Abbildung 2A, linkes Feld) und der Lage verschiedener Lipiduntergruppen ermöglicht, wenn anspruchsvollere Modelle angewendet werden53,54. Dieser Artikel hebt einige Beispiele für die Verwendung von Kontrastvariationen für Studien der kollektiven Dynamik in biomimetischen Membranen und ausgewählten Membranmerkmalen hervor.

Hier wird die Wirksamkeit von NSE bei der Bereitstellung einzigartiger Einblicke in dynamische und funktionelle Membraneigenschaften anhand konkreter Beispiele von NSE-Studien zu Modell- und biologisch relevanten Lipidmembransystemen mit Schwerpunkt auf mesoskaliger Dynamik in freistehenden Membranen in Form von liposomalen Suspensionen veranschaulicht. Für NSE-Messungen der In-Plane-Membrandynamik wird der Leser auf spezielle Publikationen zur Grazing-Incidence-Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (GINSES)55,56 und andere Studien von ausgerichteten multilamellaren Membranstapeln57,58,59,60verwiesen.

Der Einfachheit halber hebt dieser Artikel drei verschiedene Schemata der Membrandeuteration hervor, die auf einem gut untersuchten domänenbildenden oder phasenabtrennenden Lipiddoppelschichtsystem aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) -Mischungen61,62dargestellt werden. Die beiden Lipide zeichnen sich durch eine Diskrepanz in ihrer Kohlenwasserstoffkettenlänge (14 Kohlenstoffe / Schwanz in DMPC vs. 18 Kohlenstoffe / Schwanz in DSPC) und ihrer Gel-Fluid-Übergangstemperatur (Tm, DMPC = 23 ° C vs Tm, DSPC = 55 ° C) aus. Dies führt zu einer lateralen Phasentrennung in DMPC:DSPC-Membranen bei Temperaturen zwischen der oberen und unteren Übergangstemperatur des Gemisches63. Die hier betrachteten Deuterationsschemata werden ausgewählt, um die verschiedenen dynamischen Modi zu demonstrieren, die bei NSE-Messungen auf liposomalen Membranen verfügbar sind, nämlich Biegefluktuationen, Dickenschwankungen und selektive Biege-/Dickenschwankungen von lateralen Domänen. Alle Lipidzusammensetzungen werden für DMPC:DSPC-Doppelschichten berichtet, die mit einem Molanteil von 70:30 unter Verwendung handelsüblich erhältlicher protiated und perdeuterated Varianten von DMPC und DSPC hergestellt wurden. Alle Probenvorbereitungsschritte basieren auf 4 ml liposomaler Suspension inD2O mit einer Lipidkonzentration von 50 mg/ml für eine Gesamtlipidmasse von Mtot = 200 mg pro Probe.

Protokoll

1. Für das Experiment erforderliches Deuterationsschema

  1. Für Biegeschwankungsmessungen werden vollständig protiierte Liposomen inD2O(D 99,9%) oderD2O-Puffer (z. B. Phosphatpuffer mitD2Oanstelle vonH2Ohergestellt) hergestellt. Verwenden Sie vollständig protiierte DMPC (C36H72NO8P) und DSPC (C44H88NO8P) mit figure-protocol-451 133,4 mg, wobei XDMPC und XDSPC die Molfraktionen von DMPC und DSPC sind, hier auf 0,7 bzw. 0,3 festgelegt, und MwDMPC und MwDSPC sind die molaren Gewichte von 677,9 g / mol bzw. 790,1 g / mol. In ähnlicher Weise mDSPC = 66,6 mg. Dieses Deuterationsschema erhöht den Streukontrast zwischen der Membran (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) und dem deuterierten Puffer (NSLD ~ 6,4 × 10-6 Å-2) und verstärkt das Signal von Membranaufführungen (siehe Abbildung 2A linkes Feld).
  2. Zur Messung der Biegedynamik ausgewählter lateraler Membranmerkmale, z.B. Matrixdynamik in phasentrennenden DMPC:DSPC-Membranen, verwenden Sie protiiertes DMPC (C36H72NO8P) und deuteriertes, DSPC-d83 (C44H5NO8PD83,Mw 873,7 g/mol), so dass mDMPC = 128,8 mg und mDSPC-d83 = 71,2 mg. Dieses Deuterationsschema minimiert die Streuung aus den unerwünschten DSPC-reichen Domänen und ermöglicht so selektive Messungen von Biegefluktuationen aus der DMPC-reichen Matrix (siehe Abbildung 2B Mitte).
    HINWEIS: Um die optimale Lipiddeuteration zu finden, die für ein bestimmtes Kontrastanpassungsschema erforderlich ist, verwenden Sie verfügbare webbasierte SLD-Rechner (Scattering Length Density), wie sie vom NIST Center for Neutron Research64entwickelt wurden. Diese webbasierten Schnittstellen sind mit benutzerfreundlichen Werkzeugen zur einfachen Berechnung der SLD von Lipiden mit unterschiedlichen Deuterationsgraden sowie von Lipidmischungen ausgestattet.
  3. Für NSE-Messungen der mittleren Membrandickenschwankungen (ohne seitlichen Kontrast) werden schwanzdeuterierte Varianten der Konstituenten Lipide verwendet, d.h. DMPC-d54 (C36H18NO8PD54, 732,3 g/mol) und DSPC-d70 (C44H18NO8PD70, 860,1 g/mol)35,38, so dass mDMPC-d54 = 133,0 mg und mDSPC-d70 = 67,0 mg. Dieses Kontrastschema (Abbildung 2A, rechte Tafel) verstärkt das Streusignal von den Lipidkopfgruppen (NSLD ~ 4,5 × 10-6 Å -2) durch Kontrastanpassung der Schwanzgruppe (NSLD ~ 6,4 × 10-6 Å-2 ) zum deuterierten Puffer, was die Erkennung von Schwankungen in der Dicke der Membran ermöglicht.
  4. Für Dickenfluktuationsstudien ausgewählter Membrankompartimente, z. B. DMPC-reiche Matrix, verwenden Sie die gleiche Strategie, die in Schritt 1.2 beschrieben wurde, indem protiierte DMPC-Lipide durch ihre schwanzdeuterierten Analoga, d. H. DMPC-d54, ersetzt werden, so dass die DSPC-reichen Domänen kontrastreich auf den deuterierten Puffer abgestimmt sind und das primäre Streusignal aus der Headgroup-Region der tail-deuterierten DMPC-reichen Matrix stammt.

2. Herstellung der Lipidsuspension für die Extrusion

  1. Berechnen Sie die Masse jedes Bestandteils in der Probe, abhängig von der Probenzusammensetzung. Als Faustregel gilt, dass für Proben mit mehreren molekularen Komponenten die Masse einer Komponente durch ihre molare Masse Mwigegeben ist, gewichtet durch ihre Molfraktion, Xi, und über alle Komponenten normalisiert wird, so dass: figure-protocol-4065 wobei Mtot die Gesamtmasse ist, hier auf 200 mg festgelegt. Siehe das obige Beispiel für DMPC-DSPC-Lipiddoppelschichten mit unterschiedlichen Deuterationsschemata.
  2. Wiegen Sie mit einer digitalen Halbmikrowaage die berechneten Massen an Lipiden (und anderen Probenbestandteilen, z. B. Proteinen, Nanopartikeln usw.) und geben Sie sie in eine Durchstechflasche oder einen Rundkolben - denken Sie daran, die Durchstechflasche oder den Kolben vorher zu wiegen. Fügen Sie 1 ml Lösungsmittel hinzu, um die gewogenen Komponenten durch manuelles Mischen in einer Haube aufzulösen. Für reine Lipidproben verwenden Sie Chloroform oder Ethanol. Wählen Sie für Proben mit zusätzlichen, nicht lipidfreien Komponenten (z. B. Nanopartikel) ein gemeinsames Lösungsmittel, das alle Komponenten dispergiert.
    1. Für kleine Lipidmengen (<10 mg) eine Stammlösung vorbereiten und das erforderliche Volumen in die Mischung pipetten.
      HINWEIS: Fügen Sie keine übermäßigen Mengen an Lösungsmittel hinzu, da dies den unten beschriebenen Lösungsmitteltrocknungsschritt erheblich verlangsamt.
  3. Trocknen Sie die Lipidlösung in einer Haube, indem Sie vorsichtig ein Inertgas (z. B. Stickstoff, Argon) in die Durchstechflasche strömen lassen, während Sie die Durchstechflasche langsam in einem Winkel drehen. Halten Sie die Fläschchen in geneigter Position, um einen dünnen Film aus getrocknetem Lipid an den Wänden der Durchstechflasche zu erzeugen, der eine gleichmäßige Trocknung ermöglicht. Legen Sie die Durchstechflasche intermittierend in ein Wasserbad bei 35 °C, um die verdunstungsvermittelte Abkühlung zu umgehen, wodurch die Lösungsmittelverdampfung verlangsamt wird.
  4. Legen Sie die Fläschchen über Nacht in einen Vakuumofen bei ~35 °C, um das Restlösungsmittel vollständig zu entfernen. Für ungesättigte Lipide das Vakuum mit einem Inertgas reinigen, um die Oxidation zu minimieren.
  5. Um eine vollständige Lösungsmittelentfernung zu gewährleisten, wiegen Sie die Durchstechflasche nach der Lipidtrocknung und bestätigen Sie, dass über die gemessenen Materialmengen hinaus keine überschüssige Masse vorhanden ist. Tun Sie dies, indem Sie die Masse der Durchstechflasche nach dem Trocknen von der gemessenen Masse subtrahieren. Wenn überschüssige Masse vorhanden ist, trocknen Sie die Probe unter Vakuum für weitere 6 h. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf.
  6. Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit 4 mLD2OoderD2O-Puffer, um eine Lipidkonzentration von 50 mg/ml zu erhalten. Bei Lipiden mit hohen Übergangstemperaturen, wie DMPC-DSPC-Mischungen, erhitzen Sie den Puffer auf über die Übergangstemperatur (60 °C), um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Da NSE-Experimente relativ große Probenvolumina (~ 4 ml) erfordern, sollten Sie die Probe mit der Hälfte des erforderlichen Puffers, d. H. 2 ml, hydratisieren, um die Anzahl der Extrusionen pro Probe zu minimieren (siehe Abschnitt 3). Fügen Sie in diesem Fall die verbleibende Hälfte der Puffernachextrusion hinzu. Beachten Sie, dass die Kapazität der in der Extrusion verwendeten Spritzen auf 1 ml begrenzt ist. Daher würde die Hydratierung mit 4 ml Puffer vier Extrusionssätze erfordern.
  7. Mischen Sie die hydratisierte Lipidlösung so lange, bis der Lipidfilm vollständig aufgelöst ist und an den Wänden der Durchstechflasche nicht mehr sichtbar ist. In diesem Stadium bilden die hydratisierten Lipide multilamellare Vesikel und mikrometergroße multilamellare Stapel und die Suspension erscheint milchig weiß.
  8. Um das Brechen der Lipidstapel zu erleichtern und die Multilamellität zu reduzieren, führen Sie fünf Gefrier-/Auftauzyklen durch, indem Sie die Durchstechflasche mit hydratisierter Lipidlösung in einen Gefrierschrank in Laborqualität (vorzugsweise -80 °C Gefrierschrank) legen, bis sie vollständig gefroren ist, und dann die Durchstechflasche in ein 35 ° C-Wasserbad überführen, bis die Lipidlösung vollständig aufgetaut ist. Wirbeln Sie die aufgetaute Lösung vor, bis sie homogen ist. Wiederholen Sie den Vorgang noch vier weitere Male.
    HINWEIS: Alternativ kann ein Trockeneisbad durch die Kombination von Aceton und Trockeneis für ein schnelles Einfrieren vorbereitet werden.

3. Extrusion der hydratisierten Lipidlösung

  1. Montieren Sie den Extruderaufbau mit einer Polycarbonatmembran zwischen zwei Membranträgern und fügen Sie zwei Papierfilter auf jeder Seite hinzu, um zusätzliche Unterstützung zu bieten. Verwenden Sie eine Polycarbonatmembran mit einer Porengröße, die der liposomalen Zielgröße entspricht (übliche Porengrößen für NSE-Experimente sind 50 nm und 100 nm – typischerweise ermöglichen Liposomen mit einem Durchmesser von 100 nm weniger eingeschränkte Membranschwankungen, aber kleinere 50-nm-Liposomen könnten für Krümmungsstudien verwendet werden). Stellen Sie sicher, dass die Polycarbonatmembran vollständig gedehnt ist, bevor Sie die Montage abschließen und das externe Extrudergehäuse festziehen.
  2. Hydratisieren Sie die Polycarbonatmembran, indem Sie ~ 0,3 mLD2O oderD2O-Puffer einige Male durch die Membrananordnung mit luftdichten Glasspritzen geben. Verwenden Sie den gleichen Puffer, der auch bei der Probenvorbereitung verwendet wird. Lassen Sie es mindestens 10 Minuten ein, dann saugen Sie den Puffer vollständig aus, bevor Sie die Probe einführen.
  3. Füllen Sie eine 1 mL gasdichte Spritze mit der vorbereiteten Lipidlösung und führen Sie sie in ein Ende der Extruderapparatur ein. Setzen Sie dann eine leere Spritze in das gegenüberliegende Ende ein. Sobald die Spritzen mit der Extruderbaugruppe verbunden sind, legen Sie sie in den Extruderblock.
  4. Wenn für die Extrusion erhöhte Temperaturen erforderlich sind, wie bei gesättigten Lipiden mit hohen Übergangstemperaturen (z. B. DSPC, Tm = 55 °C), erwärmen Sie den Extruder-Heizblock über der Lipidübergangstemperatur (z. B. 60 °C) vor, indem Sie den Heizblock auf eine Heizplatte legen oder ein Zirkulationsbad verwenden, wie in Abbildung 3Agezeigt.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine homogene Mischung der Lipide zu gewährleisten und zu vermeiden, dass während der Extrusion ein extremer Druck ausgeübt wird, der die Polycarbonatmembran brechen könnte. Bei Lipidproben mit niedrigen Übergangstemperaturen (<25 °C) wird die Extrusion bei Raumtemperatur durchgeführt.
  5. Um die Lipidlösung zu extrudieren, befestigen Sie den Extrudersatz an einer programmierbaren Spritzenpumpe mit einem Aluminium-/Stahlrahmen, wie in Abbildung 3Adargestellt. Für temperaturgesteuerte Extrusionen fügen Sie eine speziell angefertigte Extruderbasis mit einem Flüssigkeitskanal hinzu und befestigen Sie sie an einem zirkulierenden Wasserbad.
  6. Programmieren Sie die Spritzenpumpe so, dass sie 15-20 Extrusionszyklen gemäß der Anleitung des Herstellers durchführt. Beim Extrudieren ändert sich die Farbe der Lipidlösung von milchigweiß zu transparentem Opalblau(Abbildung 3B,C),was auf eine endgültige liposomale Größe hinweist, die wie erwartet kleiner als die Wellenlänge des sichtbaren Lichts ist. Führen Sie für den in Abbildung 3Agezeigten Spritzenpumpentyp die folgenden Schritte aus.
    1. Beginnen Sie mit der Anpassung der Pumpeneinstellungen. Halten Sie die Taste Rate gedrückt, geben Sie die Extrusionsrate (50,99 ml/h) ein, drücken Sie dann die Taste Durchmesser und geben Sie den Spritzendurchmesser (4,606 mm) ein. Verwenden Sie die Pfeile nach oben unter jeder Ziffer auf dem Bildschirm, um diesen Ziffernwert zu ändern.
    2. Setzen Sie den Extrudersatz mit der Probenspritze rechts ein (siehe Abbildung 3A). Drücken Sie die Auszugstaste, bis die Auszugsleuchte aufleuchtet. Drücken Sie Start und warten Sie, bis die Probe in die linke (leere) Spritze abgegeben wurde.
    3. Drücken Sie die Stop-Taste, kurz bevor die Probespritze (rechts) vollständig leer ist. Erfassen Sie das dosierte Volumen und programmieren Sie damit den Extrusionszyklus. Halten Sie die Schaltfläche Rate gedrückt, bis Phase 1 (PH:01) auf dem Bildschirm angezeigt wird. Drücken Sie die Lautstärketaste, um die zuvor aufgezeichnete Menge einzugeben. Achten Sie in dieser Phase darauf, dass das Entnahmelicht ausgeschaltet ist – dadurch wird die Probe in die richtige Richtung abgegeben.
    4. Drücken Sie erneut die Taste Rate und verwenden Sie den Pfeil ganz rechts nach oben, um auf Phase 2 (PH:02) zuzugreifen. Drücken Sie Lautstärke, um den gleichen Wert des zuvor aufgezeichneten dosierten Volumens einzugeben. Drücken Sie in dieser Phase die Withdraw-Taste, bis die Withdraw-Leuchte leuchtet – dadurch wird die Probe nach links abgegeben.
    5. Um diesen Zyklus zu wiederholen, drücken Sie erneut die Taste Rate und verwenden Sie den Pfeil ganz rechts nach oben, um auf Phase 3 (PH:03) zuzugreifen. Drücken Sie die Lautstärketaste, bis LP:SE auf dem Bildschirm angezeigt wird, und stellen Sie sie auf 20 ein. Dies ist die Anzahl der Schleifen oder Wiederholungen, die die Pumpe ausführen wird. Drücken Sie abschließend die Rate-Taste, greifen Sie auf Phase 4 (PH:04) zu und drücken Sie die Lautstärketaste, um zur Stop-Funktion zu gelangen. Die Pumpe ist nun für die automatisierte Extrusion eingerichtet.
    6. Drücken Sie Start, um den Extrusionszyklus zu starten.
  7. Entleeren Sie die Spritze mit der extrudierten Lipidsuspension in einer sauberen Durchstechflasche und bereiten Sie die Lagerung oder Messungen vor. Bei Lipidproben mit hoher Schmelztemperatur lagern Sie die Probe über dem Flüssigkeitsphasenübergang bis zur Messung. Andernfalls bewahren Sie die Proben bei Raumtemperatur auf.
  8. Extrudierte Proben nicht einfrieren, da das Einfrieren dazu führt, dass die Vesikel platzen (die Suspension wird wieder milchig weiß).

4. NSE-Messungen für die Probe(n) und Reduzierung der gesammelten Daten

  1. Charakterisieren Sie vor dem NSE-Experiment die extrudierte liposomale Probe aus Schritt 3.7 mit verfügbaren Methoden, um eine angemessene Probenqualität sicherzustellen. Eine Liste potenzieller Verkohlungsmethoden, mit denen die Qualität liposomalen Suspensionen für NSE-Experimente beurteilt werden kann, z. B. Größenverteilung, Multilamellität, laterale Membranstruktur, ist im Diskussionsabschnitt enthalten.
  2. Bestimmen Sie den Q-Bereich und die entsprechenden Geräteeinstellungen, die für das Experiment erforderlich sind. Für Biegesteifigkeitsmessungen von Lipiddoppelschichten verwenden Sie einen Q-Bereich von ~(0,04 - 0,2) Å-1. Für Untersuchungen von Membrandickenschwankungen verwenden Sie einen Q-Bereich von ~(0,04 - 0,2) Å-1 entsprechend der Membrandicke35,66,67.
    HINWEIS: Besprechen Sie den Versuchsaufbau mit dem Instrumentenwissenschaftler vor Beginn des Experiments. Wie bereits erwähnt, ist eine SANS-Charakterisierung der Probe notwendig, insbesondere wenn keine Vorherigeinformation des Streusignals verfügbar ist, wie bei selektiv deuterierten Membranen. Alternativ können Sie statische Messungen (auch als Beugung bezeichnet) über einen begrenzten Q-Bereich auf dem NSE-Instrument durchführen, mit dem Vorbehalt, dass solche Messungen im Vergleich zu SANS viel länger dauern.
  3. Laden Sie die extrudierte liposomale Suspension(en) mit einer Spritze oder einer Transferpipette in die vorgesehenen Probenzellen, die an NSE-Beamlines verfügbar sind. Beachten Sie, dass Standard-NSE-Probenzellen in Dicken von 1, 2, 3 und 4 mm erhältlich sind. Wählen Sie die Zelldicke so, dass das Streusignal optimiert wird, während das inkohärente Hintergrundsignal auf einer angemessenen Intensität gehalten wird.
    HINWEIS: Als Faustregel gilt, Probenzellen mit einer Pfadlänge von 1 oder 2 mm für protiierte Liposomen in deuteriertem Puffer zu verwenden – dickere Zellen können zu mehreren Streueffekten führen, die schwer zu korrigieren sind. Für Liposomen mit höheren Deuterationen (z. B. schwanzkontrastangepasste Liposomen oder asymmetrische Liposomen mit einzelnen protiierten Blättchen) sollten Sie die Verwendung einer dickeren Probenzelle (z. B. 3 oder 4 mm Pathlänge) in Betracht ziehen, um die Zählstatistik zu verbessern, wenn die Probe in größeren Mengen verfügbar ist - manchmal kann dies unerschwinglich sein.
  4. Bereiten Sie eine identische Probenzelle für den Puffer vor. Verwenden Sie den gleichen Puffer wie in der liposomalen Suspension. Messungen am Puffer sind für intensitätsnormalisierte und Hintergrundkorrekturen (BKG) notwendig.
  5. Legen Sie die Probenzelle(n) in den Probenhalter des NSE-Spektrometers, programmieren Sie die Messläufe und sammeln Sie Echodaten. Konsultieren Sie den Instrumentenwissenschaftler über die Programmierung der Messungen, wenn Sie zum ersten Mal NSE-Benutzer sind.
  6. Führen Sie zwei zusätzliche Messsätze durch, die für die Datenreduktion erforderlich sind: Auflösung (R) und Übertragung (T) Messungen.
    1. Durchführung der Auflösungsmessung (R) an einer elastischen Streureferenz (z. B. Kohlenstoff) – die unter den gleichen Einstellungen ausgeführt werden soll; d.h. gleiche Wellenvektor- und Fourier-Zeiten wie die Proben- und Puffermessungen.
    2. Führen Sie Transmissionsmessungen (T) an probe und puffer durch, um die Intensität des übertragenen Neutronenstrahls zu berechnen (siehe Schritt 4.9. unten). Die Transmission wird berechnet als das Verhältnis der Neutronenzahlen aus der Probe oder des Puffers dividiert durch die Neutronenzahlen für einen offenen Strahl (d.h. mit einer leeren Probenposition).
  7. Verwenden Sie die dedizierte Datenreduktionssoftware für das NSE-Spektrometer, auf dem die Messungen durchgeführt werden, um die gesammelten Daten zu reduzieren.
    HINWEIS: Verschiedene Spektrometer können unterschiedliche Software oder Benutzeroberflächen verwenden. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die NSE-Datenreduktion mithilfe der Data Analysis and Visualization Environment (DAVE)68 Software, die speziell für das NSE-Spektrometer am NIST Center for Neutron Research geschrieben wurde.
    1. Öffnen Sie die DAVE-Software und wählen Sie NSE-Daten reduzieren aus dem Menü Datenreduktion. Es werden mehrere Popup-Fenster angezeigt.
    2. Laden Sie die Datendateien über verschiedene Q-Werte hoch, indem Sie die Option .echo-Dateien öffnen aus dem Dateimenü verwenden. Diese Dateien entsprechen den Rohdatendateien mit den Spin-Echo-Signalen und haben die Erweiterung .echo im Dateinamen. Sobald der Datei-Upload abgeschlossen ist, werden die Dateien unter den verfügbaren Datensätzen angezeigt.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ausgewählte Datei und beschriften Sie sie entsprechend der Messung, der sie entspricht. d. h. Sample, Cell (für leere Zelle oder Puffer) oder Resolution.
    4. Gruppieren Sie die Detektorpixel in 2 x 2, um das Signal-Rausch-Verhältnis mithilfe der Registerkarte Datensatz zu verbessern. Wenden Sie die gleiche Bindung auf alle Dateien an. d. h. Auflösung, Zelle und Beispiel.
    5. Überprüfen Sie die Daten über alle Pixelgruppen und maskieren Sie diejenigen mit schlechten Signalen (siehe Abbildung 4B),indem Sie die m-Taste auf der Tastatur drücken. Drücken Sie die Eingabetaste, um auf ein Popup-Fenster zuzugreifen, in dem Sie dieselbe Maske auf alle Fourier-Zeiten oder nachfolgende Fourier-Zeiten anwenden können. Dies kann auch auf einzelne Pixel zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Datenreduktion angewendet werden. Maskierte Pixel werden grün.
    6. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Daten in Form eines Echosignals, d. h. einer Kosinusfunktion in Bezug auf den Phasenstrom, über jedem Detektorpixel vorliegen (siehe Abbildung 4A).
      HINWEIS: Der Phasenstrom ist proportional zum Präzessionswinkel des Neutronenspins; Daher ist es üblich, den Phasenstrom als Phasenwinkel darzustellen, wie in Abbildung 4Adargestellt. Für Messungen an gepulsten Quellen werden zusätzliche Flugzeitberechnungen auf die Daten angewendet, um die Echosignale als Funktion der einfallenden Neutronenwellenlänge innerhalb eines Neutronenpulses zu erhalten.
    7. Beginnen Sie mit dem Anpassen der Auflösungsdatei. Wählen Sie eine Auflösungsdatei aus der Liste der hochgeladenen Dateien aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei. Wählen Sie im Popupmenü die Option "Einfügevorgänge: Echos anpassen (Auflösung)".
    8. Stellen Sie sicher, dass die Passungen der Echosignale eine Reihe von Anpassungsparametern ergeben, einschließlich des parameters A, der in Schritt 4.8 erforderlich ist. Die Passungen werden automatisch mit dem folgenden Ausdruck ausgeführt.
      figure-protocol-21657
      Hier ist ζ die Periode des Echosignals (d.h. Kosinusfunktion in Abbildung 4A),σ die Breite der Gaußschen Hülle ist, die durch die mittlere Wellenlänge und Wellenlängenspreizung des einfallenden Neutronenstrahls bestimmt wird, Φc ist der Phasenstrom und Φ0 ist der Echopunkt, der von der Feldbahn abhängt, die Neutronen50erfahren. Physikalische Informationen über die Probe sind in der Amplitude Ader Kosinusfunktion in Gleichung (1) kodiert.
      HINWEIS: Die Breite der Gaußschen Hüllkurve basiert auf Werten, die vom Instrumentenwissenschaftler vorgegeben wurden und sollte nicht geändert werden. Die anderen Parameter sind Variablen, die an das spezifische Echosignal über jedes Pixel angepasst sind.
    9. Überprüfen Sie die Anpassungsergebnisse, indem Sie auf jedes Pixel klicken, um die resultierenden Anpassungsparameter, die Qualität der Anpassung und die mittlere quadratische Abweichung der Anpassung anzuzeigen. Um den Fehler zu überprüfen, der jedem Formstückparameter über den gesamten Detektor zugeordnet ist, wählen Sie Bildoptionen und dann den gewünschten Formstückparameter aus. Dadurch wird eine Karte mit dem Wert des passenden Parameters über jedem Pixel generiert. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Detektorbild. Es erscheint ein Popup-Fenster mit einer Fehlerleistenzuordnung des ausgewählten Formstückparameters.
    10. Wenn die Anpassung über ein bestimmtes Pixel unbefriedigend ist (z. B. Parameeter mit großen Fehlerbalken anpassen), passen Sie das Signal über dieses bestimmte Pixel an. Wählen Sie dieses Pixelaus, drücken Sie die Registerkarte Formstück, und drücken Sie dann Pixel anpassen. Geben Sie neue Startparameter für die Phase (Φ0) und den Zeitraum (ζ) in die Registerkarte Formstück ein, um eine zufriedenstellendere Anpassung zu erhalten.
      HINWEIS: Es ist nützlich, die angepasste Phase als Funktion der Fourierzeit zu zeichnen. Gehen Sie dazu zum Hauptplotfenster und wählen Sie Phase v. Fourierzeit anpassen. Dieses Diagramm sollte glatt und kontinuierlich sein. Untersuchen Sie die Diskontinuitäten in diesem Diagramm, und überpassen Sie die Pixel, denen sie entsprechen.
  8. Reduzieren Sie die Sample- oder Cell-Datei, indem Sie die entsprechende Datei aus der Liste der hochgeladenen und beschrifteten Dateien auswählen.
    1. Überprüfen Sie alle Pixel und maskieren Sie die Pixel mit fehlerhaften Statistiken, wie in Schritt 4.7.5 beschrieben.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie Anpassungsvorgänge: Importphasen (Beispiel, Zelle). Dadurch werden die Phasen und die angewendete Maske aus der Auflösungsdatei importiert.
    3. Passen Sie die Echosignale mit dem gleichen Verfahren an, das zuvor für die Auflösungsdatei beschrieben wurde (Schritte 4.7.8-4.7.10). Ändern Sie beim Anpassen der Sample- und Cell-Dateien nicht die Werte des Zeitraums und des Echophasenpunkts, die aus den Auflösungsanpassungen importiert wurden. Diese Parameter hängen von den instrumentalen Einstellungen ab und sollten nicht mit den Samples variieren.
    4. Bevor Sie mit der Datenreduktion fortfahren, geben Sie das Strahlzentrum für alle Datendateien ein. Wählen Sie die Datendatei aus, gehen Sie zur Registerkarte Allgemein und geben Sie X- und Y-Balkenmittelwerte ein. Diese Werte werden während des Experiments aufgezeichnet.
    5. Sobald die Anpassung an die Sample-, Cell- und Resolution-Dateien abgeschlossen ist, berechnen Sie die normalisierte Zwischenstreufunktion, die später bei der Datenanalyse und -interpretation verwendet werden soll. Klicken Sie dazu mit der rechten Maustaste auf die Beispieldatei, die aus der Liste der angepassten Dateien reduziert werden soll, und wählen Sie im Popupmenü die Option I(Q) berechnen aus. Es erscheint ein Fenster mit Eingabemöglichkeiten für die Dateien Auflösung und Zelle (d. h. Puffer) sowie die Anzahl der Q-Arcs (siehe Schritt 4.9). Nachdem Sie alle erforderlichen Informationen eingegeben haben, drücken Sie die Taste OK. Die Ergebnisse werden in einem neuen Fenster angezeigt.
      HINWEIS: Die Datenreduktion wird gemäß der folgenden Gleichung durchgeführt, um die normalisierte Zwischenstreufunktion69zu erhalten.
      figure-protocol-26248
      wobei t die Fourierzeit ist, Noben und Nunten die Neutronenzahlen in den Non-Spin-Flip- und Spin-Flip-Konfigurationen sind (gemessen mit ausgeschalteten π/2-Flippern bzw. π-Flipper), und die hochgestellten BKG und Rentsprechen den Hintergrund- bzw. Auflösungsmessungen, wie in den Schritten 4.4 und 4.6 definiert. Beachten Sie, dass die Strahlpolarisation, figure-protocol-26744 also Änderungen im Spinzustand aufgrund des Energieaustauschs zwischen dem Neutron und der Probe, als Abfall der Polarisation (von der Einheit) detektiert wird.
  9. Gruppieren Sie schließlich die Detektorpixel in Q-Bögen,wie in Abbildung 4B gezeigt, um die Q-Abhängigkeitder normalisierten Zwischenstreufunktion S(Q,t) / S(Q, 0 ) zu erhalten. Dies wird technisch als Datenbinning bezeichnet und sollte mit Bedacht erfolgen, d.h. unter Berücksichtigung der Zählstatistiken aus der Stichprobe und der erwarteten Standardabweichung der Daten über die gruppierten Pixel.
  10. Für stark streuende Proben teilen Sie den Detektor in mehr Q-Bögen auf, wobei vernünftige Fehlerbalken auf der resultierenden Zwischenstreufunktion S(Q,t) / S(Q, 0 ) beibehalten werden. Dies ergibt mehr Q-Datenpunkte und ist wichtig für das unten beschriebene Datenanalyseverfahren. Beachten Sie, dass bei schwach streuenden Proben ein übermäßiges Binning zu schlechten Zerfallssignalen führt, d.h. zu großen Fehlerbalken auf S(Q,t) / S(Q, 0), was zu großen Unsicherheiten führen kann.

5. Datenanalyse und -interpretation

  1. Passen Sie die normalisierten Zwischenstreufunktionen S(Q,t) / S(Q, 0), die aus der obigen Datenreduktion erhalten wurden, auf eine gestreckte Exponentialfunktion mit einem Dehnungsexponenten von 2/370an.
    figure-protocol-28433
    HINWEIS: Ein Beispiel für diese Passungen finden Sie in Abbildung 5B. Anfälle von S(Q,t) / S(Q, 0) zu Gleichung (3) ergeben die Q-abhängigen Relaxationsraten Γ (Q).
  2. Zeichnen Sie Γ(Q) als Funktion von Q auf und passen Sie sich an ein geeignetes Modell an, um relevante Membranparameter zu extrahieren.

Ergebnisse

NSE-Studien, die auf Biegeschwankungen zugreifen, werden typischerweise über einen Q-Bereich von ~ (0,04 - 0,2) Å-1durchgeführt. Dieser Q-Bereich entspricht mittleren Längenskalen zwischen der Membrandicke und dem liposomalen Radius, wobei die Biegedynamik dominiert. Die Messung über einen erweiterten Q-Bereich kann den Zugang zu zusätzlichen dynamischen Modi ermöglichen, einschließlich liposomaler Diffusion und Intramembrandynamik. Weitere Einzelheiten zum Crossover in der Membrandynamik, auf das NSE ...

Diskussion

NSE ist eine leistungsstarke und einzigartige Technik zur Messung der mesoskopischen Dynamik von Lipidmembranen unter verschiedenen Bedingungen. Die effektive Nutzung von NSE hängt von der Probenqualität, dem Neutronenkontrast und dem Bereich der zugänglichen Dynamik ab, die für eine bestimmte Probe untersucht werden kann. Daher sind mehrere kritische Schritte erforderlich, um erfolgreiche NSE-Experimente durchzuführen und qualitativ hochwertige Daten zu sammeln. Ein wichtiger Schritt, um die effektive Nutzung der N...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte und haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

R. Ashkar dankt M. Nagao, L.-R. Stingaciu und P. Zolnierczuk für viele nützliche Diskussionen und für ihre häufige Unterstützung bei NSE-Experimenten auf ihren jeweiligen Beamlines. Die Autoren erkennen den Einsatz von Neutronenspin-Echospektrometern am NIST und ORNL an. Das NSE-Spektrometer am NIST wird vom Center for High Resolution Neutron Scattering unterstützt, einer Partnerschaft zwischen dem National Institute of Standards and Technology und der National Science Foundation unter der Vereinbarung Nr. DMR-1508249. Das NSE-Spektrometer an der Spallations-Neutronenquelle des ORNL wird von der Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy, unterstützt. Das Oak Ridge National Laboratory wird von UT-Battelle, LLC unter der US DOE Contract No. DE-AC05-00OR22725.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloroform (biotech grade)Sigma Aldrich496189Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bathJulaboSE-12Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium OxideCambridge Isotopes LaboratoriesDLM-4Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-MicrobalanceMettler ToledoMS105Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)Sigma AldrichE7023200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass PipetsVWR36360-536Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass VialsThermo ScientificB7990-1Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezerFisher ScientificIU2886DUltra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)Avanti Polar Lipidsvaries by lipidLipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifierMillipore SigmaZRQSVP3USDirect-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder SetAvanti Polar Lipids610020Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect FittingsGrainger2YDA1 and 2YDA7Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe PumpSyringePump.comNew Era-1000Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bathFisher ScientificCPX2800Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum OvenThermo Scientific36080.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex MixerFisher Scientific02-215-414Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

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