Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado

Resumen

La escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) es una estrategia eficiente de perfiles epigenómicos de cromatina. Este protocolo presenta una estrategia refinada de CUT&Tag para el perfilado de modificaciones de histonas en plantas.

Resumen

La regulación epigenómica a nivel cromático, incluidas las modificaciones del ADN y las histonas, los comportamientos de los factores de transcripción y los ARN no codificantes con sus proteínas reclutadas, conducen al control temporal y espacial de la expresión génica. La escisión bajo objetivos y tagmentación (CUT&Tag) es un método de anclaje enzimático en el que la proteína de cromatina específica es reconocida primero por su anticuerpo específico, y luego el anticuerpo ata una proteína de fusión de proteína A-transposasa (pA-Tn5), que escinde la cromatina dirigida in situ mediante la activación de iones de magnesio. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo CUT&Tag publicado anteriormente utilizando núcleos intactos aislados de hojas de algodón alotretráploides con modificación. Este protocolo paso a paso se puede utilizar para la investigación epigenómica en plantas. Además, se proporcionan modificaciones sustanciales para el aislamiento de los núcleos de plantas con comentarios críticos.

Introducción

Los sitios de ADN de unión al factor de transcripción y la cromatina abierta asociada con las marcas de modificación de histonas desempeñan funciones funcionales críticas en la regulación de la expresión génica y son los principales focos de la investigación epigenética1. Convencionalmente, el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) junto con la secuenciación profunda (ChIP-seq) se ha utilizado para la identificación de todo el genoma de la modificación específica de la histona de cromatina o dianas de ADN con proteínas específicas, y es ampliamente adoptado en el campo de la epigenética2. La tecnología de escisión bajo objetivos y tagmentación (CUT&Tag) fue desarrollada originalmente por el Laboratorio Henikoff para capturar los fragmentos de ADN afiliados a proteínas en todo el ^genoma5. En comparación con ChIP, CUT&Tagcan genera bibliotecas de ADN a alta resolución y un fondo excepcionalmente bajo utilizando un pequeño número de células con un procedimiento ^{simplificado3}. Hasta la fecha, se han establecido métodos para el análisis de regiones de cromatina con modificaciones específicas de histonas utilizando CUT&Tag en células ^animales4,5. Específicamente, el CUT&Tag unicelular (scCUT&Tag) también se ha desarrollado con éxito para tejidos y células ^humanas6. Sin embargo, debido a la complejidad de la pared celular y los metabolitos secundarios, CUT&Tag sigue siendo un desafío técnico para los tejidos vegetales.

Anteriormente, reportamos un protocolo CUT&Tag utilizando núcleos intactos aislados de hojas de algodón alotretráploides4. Para demostrar la eficiencia del aislamiento de núcleos y la captura de ADN utilizando tejido vegetal, aquí se presenta el procedimiento de perfil. Los pasos principales incluyen el aislamiento de núcleos intactos, la incubación in situ con el anticuerpo para la modificación de la cromatina, la incubación de la transposasa, la integración del adaptador y la preparación de la biblioteca de ADN. La resolución de problemas se centra en la preparación de la biblioteca CUT&Tag para el aislamiento de núcleos de plantas y el control de calidad.

En este estudio, presentamos una estrategia refinada de CUT&Tag para plantas. No solo proporcionamos un protocolo paso a paso para el perfilado H3K4me3 en hojas de algodón, sino que también proporcionamos una metodología optimizada para el aislamiento de núcleos de plantas, incluida la estrategia para seleccionar la concentración de detergente para la lisis celular adecuada y la estrategia para filtrar los núcleos. Los pasos detallados con comentarios críticos también se incluyen en este protocolo actualizado.

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Protocolo

1. Preparar soluciones de transposasa y stock (Día 1)

NOTA: En esta parte, los adaptadores de oligonucleótidos se complejan con la transposasa Tn5 para hacer transposasa activa.

1. Imprimaciones diluidas (imprimación A, imprimación B e imprimación C) a una concentración de 100 μM utilizando el tampón de recocido (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (consulte la Tabla 1 para obtener información de secuencia de imprimaciones y la Tabla 2 para las recetas de soluciones de trabajo). Conservar a -20 °C hasta su uso.
2. Establecer las dos reacciones siguientes en tubos de PCR: Reacción 1 (adaptador AB), 10 μL de imprimación A de 100 μM, 10 μL de imprimación B de 100 μM; Reacción 2 (adaptador AC), 10 μL de imprimación A de 100 μM, 10 de imprimación C de μL 100 μM.
3. Anneal los adaptadores en la máquina de PCR utilizando el siguiente programa: tapa térmica (102 °C), 75 °C durante 15 min, 60 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min, 40 °C durante 10 min, 25 °C durante 30 min.
   NOTA: Los adaptadores son moléculas de ADN parcialmente de doble cadena (concentración = 50 pmol/μL).
4. Configure la siguiente reacción en un tubo centrífugo de 1,5 ml: 10 μL de transposasa pA-Tn5 (500 ng/μL o 7,5 pmol/μL), 0,75 μL de adaptador AB (50 pmol/μL), 0,75 μL de AC adaptador (50 pmol/μL), 7 μL de tampón de acoplamiento. Pipetear 20x suavemente para mezclar bien e incubar a 30 °C en un baño de agua durante 1 h. La concentración final de transposasa = 4 pmol/μL. Conservar a -20 °C hasta su uso.
   NOTA: Relación molar del adaptador AB: adaptador AC: transposasa = 0.5:0.5:5:1.
5. Preparar las soluciones madre según las recetas proporcionadas en la Tabla 2 y autoclave o filtre las soluciones madre para esterilizar.
6. Autoclave y esteriliza tijeras, papel de filtro, un tamiz de acero inoxidable, un mortero, morteros, etc.

2. Aislamiento de núcleos (Día 2)

1. Preenfríe la centrífuga a 4 °C. Por cada 1 g del material de partida (hojas de algodón), preparar 25 mL de tampón de aislamiento nuclear A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampón de aislamiento nuclear B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampón de lavado nuclear (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, cóctel inhibidor de la proteasa 0,1%), 1 mL de tampón de anticuerpos (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1 mg/mL BSA, cóctel inhibidor de proteasa 0,1%, 0,05% p/v digitonina). Deje que los tubos se asienten sobre hielo hasta su uso.
2. Moler las hojas frescas (~ 1 g) en nitrógeno líquido a un polvo fino y transferir a un tubo de 50 ml que contenga 25 ml de tampón de aislamiento nuclear refrigerado A.
3. Mezcle la solución tampón suavemente e incube el tubo en hielo durante 5 minutos con un suave agitación para dispersar el material de manera uniforme.
4. Centrifugar durante 5 min a 500 rcf a 4 °C para formar el pellet celular.
5. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet con 20 mL de tampón B de aislamiento nuclear refrigerado complementado con Tritón X-100 al 0,5%. Invierta el tubo suavemente para resuspendir el pellet por completo.
   NOTA: El tampón B de aislamiento nuclear de 20 ml es aplicable para material de partida de 1 g, y este volumen se puede escalar en consecuencia.
   1. Realizar un ensayo piloto para probar el efecto de la concentración en serie de Tritón X-100 (por ejemplo, 2 ml de tampón B de aislamiento nuclear, cada uno con 0,1%, 0,25%, 0,5% y 1% de Tritón X-100 para 100 mg de tejidos molidos). La concentración apropiada de Triton X-100 está indicada por una acumulación de núcleos blancos/grises en la parte inferior y un sobrenadante verde oscuro después de la lisis y centrifugación a baja velocidad (< 500 rcf durante 4 min).
6. Filtre el lisado celular resultante con una combinación de dos tamices: un tamiz de 500 mallas en la parte superior para eliminar los restos de tejido más grandes y un tamiz de 1000 mallas en la parte inferior para recoger los núcleos.
   NOTA: Elija un tamaño de malla apropiado para los tamices dependiendo del tamaño de los núcleos de las plantas.
7. Use papel de filtro estéril en la parte posterior del tamiz para absorber los desechos de células pequeñas en el lisado.
8. Transfiera los núcleos restantes que contienen lisado en la parte superior del tamiz de 1000 mallas a cuatro tubos de centrífuga frescos de 1,5 ml.
9. Centrifugar durante 4 min a 300 rcf a 4 °C para recoger los núcleos.
10. Retire la mayor cantidad posible del sobrenadante con una punta de pipeta y lave el pellet con tampón de lavado nuclear.
11. Añadir 800 μL del tampón de lavado nuclear e invertir los tubos suavemente para resuspendir el pellet. Gire el tubo de nuevo durante 4 minutos a 300 rcf a 4 °C.
12. Realizar un total de 3 lavados.
13. (Opcional) Tome imágenes de los núcleos bajo un microscopio para la tinción DAPI.
    1. Transfiera 100 μL de suspensión de núcleos en el tampón de lavado nuclear del paso 2.11. a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 900 μL de tampón de lavado nuclear y 2 μL de solución madre de DAPI (1 mg/ml) para obtener una concentración final de trabajo de 2 μg/ml para DAPI. Incubar el tubo en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Después de la tinción, centrífuga durante 4 min a 300 rcf a 4 °C para recoger los núcleos.
    3. Retire la mayor cantidad posible del sobrenadante con una punta de pipeta. Lavar 3 veces con 800 μL del tampón de lavado nuclear.
    4. Retire la mayor cantidad posible del sobrenadante y resuspenda los núcleos con 100 μL de tampón de lavado nuclear.
    5. Tome imágenes de los núcleos bajo un microscopio de fluorescencia utilizando el canal DAPI.
14. Combine los núcleos de dos tubos (~50 μL de núcleos en volumen en cada tubo de 1,5 ml). Centrifugar durante 4 min a 300 rcf a 4 °C. Retire la mayor cantidad posible del búfer restante con una punta de pipeta.

3. Incubación de anticuerpos

1. Resuspend cada 50 μL de núcleos en un tubo de 1,5 mL con 1 mL de tampón de anticuerpos.
2. Establecer las siguientes reacciones en tubos de 1,5 ml: dos réplicas biológicas de grupos de control de IgG con 150 μL de núcleos (~ 1 μg de cromatina) y 2 μL de IgG (1 mg/ml) en cada tubo, dos réplicas biológicas de grupos de ensayo H3K4me3 con 150 μL de núcleos y 2 μL de anticuerpos anti-H3K4me3 (1 mg/ml) en cada tubo.
3. Mezcle la solución suavemente y deje los tubos en un agitador horizontal para la hibridación durante la noche a 4 °C y 12 rpm.
4. Preenfríe la centrífuga a 4 °C. Prepare un tampón de lavado fresco de 50 ml de inmunoprecipitación (IP) (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM de espermidina, cóctel inhibidor de proteasa 0.1%, ,0.05% p/v digitonina) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Deje que el tubo se asiente sobre hielo.
5. Centrifugar los tubos durante 4 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el tampón de anticuerpos de cada tubo.
6. Agregue 800 μL de tampón de lavado IP a cada tubo y mezcle suavemente. Deje los tubos en un agitador horizontal durante 5 minutos a temperatura ambiente y 12 rpm.
7. Después del lavado, centrífuga los tubos durante 4 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta.
   NOTA: Para evitar cualquier perturbación del pellet de núcleos, deje ~ 50-80 μL del tampón con los núcleos.
8. Repita los pasos 3.6.-3.7. dos veces más.
9. Después del tercer lavado, centrífuga durante 2 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el búfer restante tanto como sea posible.

4. Incubación de la transposasa

1. Hacer fresco 1 mL de tampón de incubación de transposasa (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM de espermidina, cóctel inhibidor de proteasa 0.1%, 0.05% p/v digitonina) mezclando 1 mL del tampón de lavado IP con 30 μL de 5 M NaCl.
2. Para preparar la mezcla de transposasa Tn5 para la incubación, agregue 1 μL de la transposasa a cada 150 μL del tampón de incubación de la transposasa.
   NOTA: Prepare primero la mezcla de solución de transposasa de acuerdo con el número de reacciones y luego agregue una alícuota de 150 μL a cada tubo.
3. Resuspendir los núcleos con 150 μL de solución de transposasa.
4. Deje los tubos en un agitador horizontal a 12 rpm durante 2-3 h a temperatura ambiente y mezcle cada 10-15 min.
5. Después de la incubación de la transposasa, centrífugue los tubos durante 4 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el tampón de incubación de la transposasa en cada tubo.
6. Lave los tubos con tampón de lavado IP. Para hacerlo, agregue 800 μL de tampón de lavado IP a cada tubo, mezcle suavemente y deje los tubos en un agitador horizontal a 12 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar durante 4 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta.
8. Repita los pasos 4.6.-4.7. dos veces más.
9. Después del tercer lavado, centrífuga durante 2 min a 300 rcf a 4 °C. Retire el búfer restante tanto como sea posible.

5. Etiquetado

1. Recién hecho 2 mL del tampón de tagmentación (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM espermidina, cóctel inhibidor de proteasa 0.1%, 10 mM _MgCl2, 0.05% p/v digitonina) mezclando 2 mL de tampón de lavado IP con 60 μL de 5 M NaCl y 20 μL de 1 M _MgCl2.
2. Resuspendir los núcleos con 300 μL de tampón de tagmentación.
3. Mezclar la solución e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 1 h para el tagmentación.
4. Detener el tagmentación con 10 μL de 0,5 M EDTA (concentración final ~15 mM) y 30 μL de SDS al 10% (concentración final 1%).

6. Extracción de ADN y construcción de bibliotecas NGS

1. Añadir 300 μL de tampón de extracción de ADN CTAB como se ^describe7. Incubar los tubos en un baño de agua a 65 °C durante 30 min. Invertir para mezclar cada ~10 min.
2. Añadir 600 μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo (25:24:1) a cada tubo. Homogeneizar.
3. Precentrifugar los tubos de gel de bloqueo de fase durante 2 min a 13.000 rcf a 4 °C. Transfiera la solución anterior a los tubos de gel de bloqueo de fase.
4. Centrifugadora durante 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
5. Transfiera el sobrenadante (~600 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
6. Añadir 600 μL de cloroformo a cada tubo. Homogeneizar.
7. Centrifugadora durante 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante (~600 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
9. Añadir 12 μL de etanol al 100% y 2 μL de coprecipitante de GlycoBlue. Mezclar bien y conservar a -20 °C durante 1 h.
10. Centrifugadora durante 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
11. Decantar el sobrenadante. Lave el gránulo de ADN con etanol al 75% (v/v) y centrífuga durante 5 min a 13.000 rcf a 4 °C.
12. Decantar el sobrenadante. Seque al aire el gránulo de ADN y resuspenda el ADN en 25 μL de _ddH2O.
13. Configure la reacción de PCR de la siguiente manera. Para un total de 50 μL de reacción, agregue 24 μL de ADN, 11 μL de _ddH2O, 10 μL de tampón 5x TAE, 2 μL de imprimación P5 (10 μM), 2 μL de imprimación P7 (10 μM) y 1 μL de TruePrep Amplify Enzyme. Programa de PCR: 72 °C durante 3 min, 98 °C durante 30 s; luego 14 ciclos de 98 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de 72 °C durante 5 min.
    NOTA: Los primeros 72 °C durante 3 minutos para la extensión no se pueden omitir. La sobreamplificación de la biblioteca conducirá a un alto nivel de duplicados de PCR en el NGS. Comience a partir de 12-14 ciclos de PCR en la reacción de PCR para H3K4me3 cuando se usa ~ 1 μg de cromatina en cada reacción.
14. Carga 2 μL de los productos de PCR en gel de agarosa al 1,5% para electroforesis.
15. Purificar los productos de PCR utilizando perlas magnéticas comerciales de purificación de ADN.
16. Cuantificar la biblioteca con un fluorómetro y electroforesis en gel de agarosa.
    NOTA: La concentración efectiva de la biblioteca debe ser >2 nM por qPCR para garantizar una buena calidad.
17. Realice secuenciación de próxima generación (NGS) y análisis de datos.

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Resultados

La figura 1 muestra el flujo de trabajo cut&tag. La Figura 2 muestra la tinción DAPI de los núcleos intactos. El objetivo del paso de "aislamiento de núcleos" era obtener los núcleos intactos en una cantidad suficiente para la posterior reacción cut&tag. La Figura 3 muestra la electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. El control negativo de IgG se requiere en paralelo al configurar el experimento. En comparació...

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Discusión

Aquí, hemos descrito CUT&Tag, una tecnología para generar bibliotecas de ADN a alta resolución y un fondo excepcionalmente bajo utilizando un pequeño número de células con un procedimiento simplificado en comparación con la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Nuestro éxito con el perfilado H3K4me3 en hojas de algodón sugiere que CUT&Tag, que fue diseñado por primera vez para células animales, también se puede utilizar para células vegetales. Tanto el sistema tampón Tris comúnmente utilizado para el e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W