標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

要約

標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)は、効率的なクロマチンエピゲノムプロファイリング戦略です。このプロトコルは、植物におけるヒストン修飾のプロファイリングのための洗練されたCUT&Tag戦略を提示する。

要約

DNAおよびヒストン修飾、転写因子の挙動、およびそれらのリクルートされたタンパク質を有する非コードRNAを含む、有彩色レベルでのエピゲノム調節は、遺伝子発現の時間的および空間的制御をもたらす。標的下での切断およびタグ付け(CUT&Tag)は、特定のクロマチンタンパク質を最初にその特異的抗体によって認識し、次に抗体がプロテインA-トランスポザーゼ(pA-Tn5)融合タンパク質をテテルする酵素テザリング法であり、マグネシウムイオンの活性化によって標的クロマチンを その場で 切断する。ここでは、以前に公開されたCUT&Tagプロトコルを、改変したアロール四倍体コットン葉から単離された無傷の核を用いて提供する。このステップバイステップのプロトコルは、植物におけるエピゲノム研究に使用することができます。さらに、植物核単離のための実質的な改変は、批判的なコメントと共に提供される。

概要

ヒストン修飾マークに関連する転写因子結合DNA部位およびオープンクロマチンは、遺伝子発現の調節において重要な機能的役割を果たし、エピジェネティック研究の主要な焦点である¹。従来、ディープシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)は、特定のタンパク質を有する特定のクロマチンヒストン修飾またはDNA標的のゲノムワイドな同定に用いられており、エピジェネティクスの分野で広く採用されています²。標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)技術は、もともとゲノム全体でタンパク質関連DNA断片を捕捉するためにHenikoff Labによって開発されました⁵。ChIPと比較すると、CUT&Tagcanは、簡略化された手順で少数の細胞を使用して、高解像度で非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリを生成します³。今日まで、CUT&Tagを用いて特定のヒストン修飾を有するクロマチン領域を分析する方法が動物細胞において確立されている^4,5。具体的には、単一細胞CUT&Tag(scCUT&Tag)もヒトの組織や細胞向けに開発に成功しています⁶。しかし、細胞壁と二次代謝産物の複雑さのために、CUT&Tagは植物組織にとって依然として技術的に困難です。

以前、我々は同種四倍体綿葉から単離された無傷の核を用いたCUT&Tagプロトコルを報告した⁴。植物組織を用いた核単離およびDNA捕捉の効率を実証するために、プロファイリング手順をここに提示する。主なステップには、インタクトな核単離、クロマチン修飾のための抗体との in situ インキュベーション、トランスポザーゼインキュベーション、アダプター統合、およびDNAライブラリー調製が含まれる。トラブルシューティングでは、植物核の分離と品質管理のためのCUT&Tagライブラリの準備に焦点を当てています。

この研究では、植物に対する洗練されたCUT&Tag戦略を提示します。綿葉のH3K4me3プロファイリングのためのステップバイステップのプロトコルを提供するだけでなく、適切な細胞溶解のための洗剤の濃度を選択するための戦略や核をろ過する戦略など、植物核単離のための最適化された方法論も提供します。批判的なコメントを含む詳細な手順も、この更新されたプロトコルに含まれています。

プロトコル

1. トランスポザーゼとストック溶液の準備(1日目)

注:この部分では、オリゴヌクレオチドアダプターはTn5トランスポザーゼと複合体形成され、活性トランスポザーゼを作る。

1. アニーリングバッファー(10 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl、1 mM EDTA)を用いてプライマー(プライマーA、プライマーB、およびプライマーC)を100 μM濃度に希釈する(プライマーの配列情報については 表1 を参照し、作業液のレシピについては 表2 を参照)。使用時まで-20°Cで保存してください。
2. 反応1(アダプターAB)、100 μMプライマーAの10 μL、100 μMプライマーBの10 μL。反応2(アダプターAC)は、10 μLの100 μMプライマーA、10 μLの100 μMプライマーC。
3. ヒートフタ(102°C)、75°Cで15分間、60°Cで10分間、50°Cで10分間、40°Cで10分間、25°Cで30分間、PCRマシンでアダプターをアニーリングします。
   注: アダプターは部分的に二本鎖の DNA 分子です (濃度 = 50 pmol/μL)。
4. 10 μL の pA-Tn5 トランスポザーゼ (500 ng/μL または 7.5 pmol/μL)、0.75 μL のアダプター AB (50 pmol/μL)、0.75 μL のアダプター AC (50 pmol/μL)、7 μL のカップリングバッファー。ピペット20xを穏やかによく混ぜ合わせ、ウォーターバス中で30°Cで1時間インキュベートした。トランスポザーゼの最終濃度=4pmol/μL.使用時まで-20°Cで保存してください。
   注:アダプターAB:アダプターAC:トランスポザーゼ=0.5:0.5:1のモル比。
5. 表2に規定されたレシピに従ってストック溶液を準備し、オートクレーブまたは濾過してストック溶液を滅菌する。
6. オートクレーブや殺菌はさみ、ろ紙、ステンレス製のふるい、乳鉢、乳棒など

2. 原子核隔離(2日目)

1. 遠心分離機を4°Cに予冷する。 出発物質(綿葉)の各1gについて、25mLの核隔離緩衝液A(10mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、1mM EDTA)、20mLの核隔離緩衝液B(10mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、1mM EDTA)、50mLの核洗浄緩衝液(10mM Tris pH 8.0)を調製し、 150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%)、1 mL の抗体バッファー (50 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、1 mg/mL BSA、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン)。使用時までチューブを氷の上に座らせてください。
2. 液体窒素中の新鮮な葉(〜1g)を微粉末に粉砕し、25mLの冷却核分離緩衝液Aを含む50mLチューブに移す。
3. 緩衝液を穏やかに混合し、チューブを氷上で5分間穏やかに振とうして材料を均等に分散させる。
4. 4°Cで500 rcfで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成した。
5. 上清をデカントし、0.5%Triton X-100を添加した20 mLの冷却核隔離バッファーBでペレットを再懸濁した。チューブを静かに反転させて、ペレットを完全に再懸濁させます。
   注: 20 mL 核分離バッファー B は 1 g の出発物質に適用可能であり、この容量はそれに応じてスケーリングできます。
   1. パイロットアッセイを実行して、Triton X-100の系列濃度の効果を試験する(例えば、2mLの核単離緩衝液B、100mgの粉砕組織に対してそれぞれ0.1%、0.25%、0.5%、および1%のTriton X-100を含む)。Triton X-100の適切な濃度は、底部に白/灰色の核が蓄積し、溶解および低速で遠心分離した後の濃い緑色の上清(500 rcfを4分間<)によって示される。
6. 得られた細胞溶解物を2つのふるいの組み合わせで濾過する:上部に500メッシュの篩で大きな組織破片を除去し、下部に1000メッシュの篩で核を回収する。
   注: 植物の核サイズに応じて、ふるいに適切なメッシュサイズを選択します。
7. ふるいの裏側に滅菌ろ紙を使用して、溶解液中の小細胞破片を吸収します。
8. 1000メッシュのふるいの頂部側に残った核含有溶解物を4本の新鮮な1.5mL遠沈管に移す。
9. 遠心分離機を4°Cで300rcfで4分間遠心分離し、核を回収した。
10. ピペットチップを使用してできるだけ多くの上清を除去し、核洗浄バッファーでペレットを洗浄する。
11. 800 μLの核洗浄バッファーを加え、チューブを静かに反転させてペレットを再懸濁します。チューブを再び 4 °C で 300 rcf で 4 分間回転させます。
12. 合計3回の洗浄を行います。
13. (オプション)DAPI染色のために顕微鏡下で核を画像化する。
    1. ステップ2.11から核洗浄バッファーに100 μLの核懸濁液を移す。新しい1.5 mLチューブに。900 μL の核洗浄バッファーと 2 μL の DAPI ストック溶液 (1 mg/mL) を加えて、DAPI の最終作業濃度を 2 μg/mL にします。チューブを暗所で室温で30分間インキュベートする。
    2. 染色後、4°Cで300rcfで4分間遠心分離し、核を回収した。
    3. ピペットチップを使用してできるだけ多くの上清を除去します。800 μLの核洗浄バッファーで3回洗浄します。
    4. できるだけ多くの上清を除去し、100 μLの核洗浄バッファーで核を再懸濁する。
    5. DAPIチャネルを用いた蛍光顕微鏡下で核を画像化する。
14. 2本のチューブからの核を結合する(各1.5mLチューブに約50μLの体積の核)。4°Cで300 rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを使用して、残りのバッファーをできるだけ多く取り除きます。

3. 抗体インキュベーション

1. 各50 μLの核を1.5 mLチューブに1 mLの抗体緩衝液で再懸濁する。
2. 1.5 mL チューブで以下の反応をセットアップしました: 各チューブに 150 μL の核 (~ 1 μg のクロマチン) と 2 μL の IgG (1 mg/mL) を含む IgG 対照群の 2 つの生物学的複製、各チューブに 150 μL の核と 2 μL の抗 H3K4me3 抗体 (1 mg/mL) を含む H3K4me3 アッセイ群の 2 つの生物学的複製。
3. 溶液を穏やかに混合し、チューブを水平シェーカー上に放置し、4°Cおよび12rpmで一晩ハイブリダイゼーションを行う。
4. 遠心分離機を4°Cに予冷する。 50 mL 遠沈管で、新鮮な 50 mL の免疫沈降 (IP) 洗浄バッファー (10 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン) を準備します。チューブを氷の上に座らせます。
5. チューブを4°Cで300 rcfで4分間遠心分離します。 各チューブから抗体緩衝液を除去する。
6. 各チューブに800 μLのIP洗浄バッファーを加え、穏やかに混合します。チューブを水平シェーカーに室温および12rpmで5分間放置する。
7. 洗浄後、チューブを4°Cで300rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを用いて上清を除去する。
   注:核ペレットの乱れを避けるために、核を含む緩衝液を約50〜80μL残してください。
8. 手順 3.6.-3.7 を繰り返します。あと2回。
9. 3回目の洗浄後、4°Cで300rcfで2分間遠心分離する。 残りのバッファーをできるだけ削除します。

4. トランスポザーゼインキュベーション

1. 1 mL の IP 洗浄バッファーと 30 μL の 5 M NaCl を混合して、新鮮な 1 mL のトランスポザーゼインキュベーションバッファー (10 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン) を作ります。
2. インキュベーション用の Tn5 トランスポザーゼミックスを調製するには、各 150 μL のトランスポザーゼインキュベーションバッファーに 1 μL のトランスポザーゼを追加します。
   注:まず反応数に応じてトランスポザーゼ溶液ミックスを調製し、次に各チューブに150μLのアリコートを加える。
3. 核を150μLのトランスポザーゼ溶液で再懸濁する。
4. チューブを水平シェーカーに12rpmで室温で2〜3時間放置し、10〜15分ごとに混合する。
5. トランスポザーゼインキュベーション後、チューブを4°Cで300 rcfで4分間遠心分離します。 各チューブ内のトランスポザーゼインキュベーションバッファーを除去する。
6. チューブをIP洗浄バッファーで洗浄します。これを行うには、各チューブに800μLのIP洗浄バッファーを加え、穏やかに混合し、チューブを水平シェーカーに12rpmで室温で5分間放置します。
7. 4°Cで300 rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを用いて上清を除去する。
8. 手順 4.6.-4.7 を繰り返します。あと2回。
9. 3回目の洗浄後、4°Cで300rcfで2分間遠心分離する。 残りのバッファーをできるだけ削除します。

5. タグ付け

1. 2 mL の IP 洗浄バッファーを 60 μL の 5 M NaCl および 20 μL の 1 M _MgCl2 と混合して、2 mL のタグメント化バッファー (10 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、10 mM MgCl2、10 mM _MgCl2、0.05% w/v ジジトニン) を新たに作ります。
2. 核を300 μLのタグメント化バッファーで再懸濁する。
3. 溶液を混合し、タグ付けのために37°Cの水浴中で1時間インキュベートする。
4. 10 μL の 0.5 M EDTA (最終濃度〜15 mM) および 30 μL の 10% SDS (最終濃度 1%)でタグ付けを停止します。

6. DNA抽出とNGSライブラリー構築

1. 300 μLのCTAB DNA抽出バッファーを記載どおりに加え^ます7。チューブを65°Cの水浴中で30分間インキュベートする。反転して約10分ごとに混合します。
2. 600 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を各チューブに加える。徹底的に混ぜる。
3. フェーズロックゲルチューブを4°Cで13,000 rcfで2分間予備遠心分離する。 上記の溶液をフェーズロックゲルチューブに移す。
4. 4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。
5. 上清(約600 μL)を新しい1.5 mLチューブに移す。
6. 各チューブに600 μLのクロロホルムを加える。徹底的に混ぜる。
7. 4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。
8. 上清(約600 μL)を新しい1.5 mlチューブに移す。
9. 12 μL の 100% エタノールと 2 μL の GlycoBlue Coprecipitant を加える。十分に混合し、-20°Cで1時間保存する。
10. 4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。
11. 上清をデカントする。DNAペレットを75%(v/v)エタノールを用いて洗浄し、4°Cで13,000 rcfで5分間遠心分離する。
12. 上清をデカントする。DNAペレットを風乾し、25 μLの_ddH2OでDNAを再懸濁する。
13. PCR反応を以下のようにセットアップする。合計 50 μL の反応に、24 μL の DNA、11 μL の _ddH2O、10 μL の 5x TAE バッファー、2 μL の P5 プライマー (10 μM)、2 μL の P7 プライマー (10 μM)、および 1 μL の TruePrep Amplify Enzyme を加えます。PCRプログラム: 72 °C 3 分間, 98 °C 30 秒間;その後、98°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒を14サイクル、続いて72°Cで5分間。
    メモ:延長のための最初の72°Cの3分間はスキップ できません 。ライブラリーの過剰増幅は、NGSにおける高レベルのPCR複製をもたらすであろう。各反応で約1 μgのクロマチンを使用する場合、H3K4me3 の PCR 反応で 12 ~ 14 回の PCR サイクルを開始します。
14. 2 μL の PCR 産物を 1.5% アガロースゲルにロードして電気泳動します。
15. 市販のDNA精製磁気ビーズを用いてPCR産物を精製する。
16. ライブラリーを蛍光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量する。
    注: ライブラリーの有効濃度は、良質を確保するために qPCR で >2 nM にする必要があります。
17. 次世代シーケンシング(NGS)とデータ解析を実行します。

結果

図 1 は、CUT&Tag ワークフローを示しています。 図2は 、無傷の核のDAPI染色を示す。「核単離」工程の目的は、その後のCUT&Tag反応に十分な量で無傷の核を得ることであった。 図3は 、PCR産物のアガロースゲル電気泳動を示す。IgGネガティブコントロールは、実験を設定する際に並行して必要です。IgG対照群と比較して、H3K4me3?...

ディスカッション

ここでは、クロマチン免疫沈降法(ChIP)と比較して、少数の細胞を用いて、非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリーを高分解能かつ極めて低いバックグラウンドで生成する技術であるCUT&Tagについて説明しました。綿の葉のH3K4me3プロファイリングでの成功は、最初に動物細胞用に設計されたCUT&Tagが植物細胞にも使用できることを示唆しています。ChIPアッセイ⁸に一般的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W