표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

요약

표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 하에서의 절단은 효율적인 크로마틴 에피게놈 프로파일링 전략이다. 이 프로토콜은 식물에서 히스톤 수정의 프로파일 링을위한 세련된 CUT & Tag 전략을 제시합니다.

초록

DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에서의 에피게놈 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. 표적 및 태멘테이션 하에서의 절단(CUT&Tag)은 특정 크로마틴 단백질이 먼저 특정 항체에 의해 인식되고, 그 다음에 항체가 단백질 A-트랜스포자제(pA-Tn5) 융합 단백질을 테더링하는 효소-테더링 방법으로, 마그네슘 이온의 활성화에 의해 표적 염색질을 현장에서 절단한다. 여기에서, 우리는 수정과 함께 allortetraploid 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하여 이전에 발표 된 CUT&Tag 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 프로토콜은 식물의 후성 게놈 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 식물 핵 분리에 대한 실질적인 변형은 비판적인 논평과 함께 제공된다.

서문

히스톤 변형 마크와 관련된 전사 인자 결합 DNA 부위 및 오픈 크로마틴은 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 기능적 역할을 하며 후성유전학 연구의 주요 초점입니다¹. 종래에는 딥 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역침전 분석법(ChIP)이 특정 단백질을 이용한 특정 크로마틴 히스톤 변형 또는 DNA 표적의 게놈 전반의 동정을 위해 사용되어 왔으며, 후성유전학² 분야에서 널리 채택되고 있다. 표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 기술 하에서의 절단은 원래 Henikoff Lab에 의해 게놈 전체에 걸쳐 단백질 제휴 DNA 단편을 포획하기 위해 개발되었습니다⁵. ChIP와 비교할 때, CUT&Tagcan은 단순화된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도와 매우 낮은 배경에서 DNA 라이브러리를 생성합니다³. 현재까지 CUT&Tag를 이용한 특이적 히스톤 변형을 갖는 크로마틴 영역을 분석하기 위한 방법이 동물 세포^4,5에서 확립되었다. 특히, 단일 세포 CUT&Tag(scCUT&Tag)도 인간 조직 및 세포를 위해....

프로토콜

1. 트랜스포자제 및 스톡 용액 준비(1일차)

참고: 이 부분에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 활성 트랜스포자제를 만들기 위해 Tn5 트랜스포자제와 복합체화된다.

1. 어닐링 완충액 (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 프라이머 (프라이머 A, 프라이머 B 및 프라이머 C)를 100 μM 농도로 희석한다 (작업 용액에 대한 제조법에 대해서는 프라이머 및 표 2의 서열 정보는 표 1 참조). 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.
2. PCR 튜브에 다음의 두 반응을 설정한다: 반응 1 (어댑터 AB), 100 μM의 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 B; 반응 2 (어댑터 AC), 10 μL의 100 μM 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 C.
3. 다음 프로그램을 사용하여 PCR 기계에서 어댑터를 어닐링한다: 히트 리드 (102°C), 15분 동안 75°C, 10분 동안 60°C, 10분 동안 50°C, 10분 동안 40°C, 30분 동안 25°C.
   참고: 어댑터는 부분적으로 이중 가닥 DNA 분자입니다(농도 = 50 pmol/....

결과

그림 1은 CUT&Tag 워크플로를 보여 줍니다. 도 2는 무손상 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. "핵 분리" 단계의 목표는 후속 CUT&Tag 반응을 위해 충분한 양으로 온전한 핵을 수득하는 것이었다. 도 3은 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. IgG 음성 대조군은 실험을 설정할 때 병렬로 요구된다. IgG 대조군과 비교하여, H3K4me3 항체 샘플로 .......

토론

여기에서는 염색질 면역침전(ChIP)에 비해 절차가 단순화된 적은 수의 세포를 사용하여 고분해능과 매우 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성하는 기술인 CUT&Tag에 대해 설명했습니다. 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을 성공적으로 수행 한 것은 동물 세포를 위해 처음 설계된 CUT & Tag가 식물 세포에도 사용될 수 있음을 시사합니다. ChIP ^assay8에 일반적으로 사용되는 트리스 버퍼 시?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W