표적 및 태비네이션 하에서 절단을 사용하는 식물에서의 H3K4me3 수정 프로파일링

요약

표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 하에서의 절단은 효율적인 크로마틴 에피게놈 프로파일링 전략이다. 이 프로토콜은 식물에서 히스톤 수정의 프로파일 링을위한 세련된 CUT & Tag 전략을 제시합니다.

초록

DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에서의 에피게놈 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. 표적 및 태멘테이션 하에서의 절단(CUT&Tag)은 특정 크로마틴 단백질이 먼저 특정 항체에 의해 인식되고, 그 다음에 항체가 단백질 A-트랜스포자제(pA-Tn5) 융합 단백질을 테더링하는 효소-테더링 방법으로, 마그네슘 이온의 활성화에 의해 표적 염색질을 현장에서 절단한다. 여기에서, 우리는 수정과 함께 allortetraploid 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하여 이전에 발표 된 CUT&Tag 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 프로토콜은 식물의 후성 게놈 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 식물 핵 분리에 대한 실질적인 변형은 비판적인 논평과 함께 제공된다.

서문

히스톤 변형 마크와 관련된 전사 인자 결합 DNA 부위 및 오픈 크로마틴은 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 기능적 역할을 하며 후성유전학 연구의 주요 초점입니다¹. 종래에는 딥 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역침전 분석법(ChIP)이 특정 단백질을 이용한 특정 크로마틴 히스톤 변형 또는 DNA 표적의 게놈 전반의 동정을 위해 사용되어 왔으며, 후성유전학² 분야에서 널리 채택되고 있다. 표적 및 태멘테이션 (CUT&Tag) 기술 하에서의 절단은 원래 Henikoff Lab에 의해 게놈 전체에 걸쳐 단백질 제휴 DNA 단편을 포획하기 위해 개발되었습니다⁵. ChIP와 비교할 때, CUT&Tagcan은 단순화된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도와 매우 낮은 배경에서 DNA 라이브러리를 생성합니다³. 현재까지 CUT&Tag를 이용한 특이적 히스톤 변형을 갖는 크로마틴 영역을 분석하기 위한 방법이 동물 세포^4,5에서 확립되었다. 특히, 단일 세포 CUT&Tag(scCUT&Tag)도 인간 조직 및 세포를 위해 성공적으로 개발되었습니다⁶. 그러나 세포벽과 이차 대사 산물의 복잡성으로 인해 CUT&TAG는 여전히 식물 조직에 기술적으로 도전적입니다.

이전에 우리는 동종 테트라 플로이드 면화 잎에서 분리 된 손상되지 않은 핵을 사용하는 CUT&Tag 프로토콜을보고했습니다⁴. 식물 조직을 이용한 핵 분리 및 DNA 포획의 효율성을 입증하기 위해, 프로파일링 절차가 여기에 제시된다. 주요 단계는 무손상 핵 단리, 크로마틴 변형을 위한 항체와의 계내 인큐베이션, 트랜스포자제 인큐베이션, 어댑터 통합, 및 DNA 라이브러리 준비를 포함한다. 문제 해결은 식물 핵 분리 및 품질 관리를 위한 CUT&Tag 라이브러리 준비에 중점을 둡니다.

이 연구에서는 식물에 대한 세련된 CUT&Tag 전략을 제시합니다. 우리는 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을위한 단계별 프로토콜을 제공 할뿐만 아니라 적절한 세포 용해를위한 세제 농도를 선택하는 전략과 핵을 필터링하는 전략을 포함하여 식물 핵 분리를위한 최적화 된 방법론을 제공합니다. 중요한 의견이 있는 자세한 단계도 이 업데이트된 프로토콜에 포함되어 있습니다.

프로토콜

1. 트랜스포자제 및 스톡 용액 준비(1일차)

참고: 이 부분에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터는 활성 트랜스포자제를 만들기 위해 Tn5 트랜스포자제와 복합체화된다.

1. 어닐링 완충액 (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 프라이머 (프라이머 A, 프라이머 B 및 프라이머 C)를 100 μM 농도로 희석한다 (작업 용액에 대한 제조법에 대해서는 프라이머 및 표 2의 서열 정보는 표 1 참조). 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.
2. PCR 튜브에 다음의 두 반응을 설정한다: 반응 1 (어댑터 AB), 100 μM의 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 B; 반응 2 (어댑터 AC), 10 μL의 100 μM 프라이머 A, 10 μL의 100 μM 프라이머 C.
3. 다음 프로그램을 사용하여 PCR 기계에서 어댑터를 어닐링한다: 히트 리드 (102°C), 15분 동안 75°C, 10분 동안 60°C, 10분 동안 50°C, 10분 동안 40°C, 30분 동안 25°C.
   참고: 어댑터는 부분적으로 이중 가닥 DNA 분자입니다(농도 = 50 pmol/μL).
4. 1.5 mL 원심분리 튜브에서 다음 반응을 설정하십시오: 10 μL의 pA-Tn5 트랜스포자제 (500 ng/μL 또는 7.5 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AB (50 pmol/μL), 0.75 μL의 어댑터 AC (50 pmol/μL), 7 μL의 커플링 버퍼. 피펫 20x를 부드럽게 잘 섞어서 1시간 동안 수조에서 30°C에서 인큐베이션한다. 트랜스포자제의 최종 농도 = 4 pmol/μL. 사용 전까지 -20°C에서 보관한다.
   참고: 어댑터 AB의 몰 비율: 어댑터 AC: 트랜스포자제 = 0.5:0.5:1.
5. 표 2에 제공된 제조법에 따라 스톡 용액을 준비하고, 스톡 용액을 오토클레이브 또는 여과하여 멸균한다.
6. 오토클레이브 및 가위, 여과지, 스테인리스 스틸 체, 모르타르, 유모차 등을 살균합니다.

2. 핵 분리 (2 일째)

1. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 출발물질(면잎) 각 1 g에 대해, 25 mL의 핵 분리 완충액 A(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 준비하고, 20 mL의 핵 분리 완충액 B(10 mM 트리스 pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL의 핵 세척 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%), 항체 완충액 1 mL (50 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 1 mg/mL BSA, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌). 튜브를 사용할 때까지 얼음 위에 놓으십시오.
2. 액체 질소에서 신선한 잎 (~ 1 g)을 미세 분말로 갈아서 25 mL의 냉각 핵 분리 버퍼 A가 들어있는 50 mL 튜브로 옮깁니다.
3. 완충 용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하여 부드럽게 흔들어 물질을 고르게 분산시킵니다.
4. 4°C에서 500 rcf에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하였다.
5. 상청액을 데칸트하고, 0.5% 트리톤 X-100으로 보충된 냉각된 핵 분리 완충액 B의 20 mL로 펠렛을 재현탁시켰다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 펠렛을 완전히 재현탁시킵니다.
   참고: 20mL 핵 분리 버퍼 B는 출발 물질 1g에 적용 가능하며, 이에 따라 부피를 조절할 수 있습니다.
   1. 파일럿 분석을 수행하여 트리톤 X-100의 직렬 농도의 효과를 시험한다 (예를 들어, 분쇄된 조직 100 mg에 대해 각각 0.1%, 0.25%, 0.5%, 및 1% 트리톤 X-100을 갖는 2 mL 핵 분리 완충액 B). Triton X-100의 적절한 농도는 바닥에 흰색 / 회색 핵이 축적되고 저속으로 용해 및 원심 분리 후 짙은 녹색 상청액이 축적되어 표시됩니다 (4 분 동안 < 500 rcf).
6. 생성 된 세포 용해물을 두 개의 체로 필터링하십시오 : 상단의 500 메쉬 체는 더 큰 조직 파편을 제거하고 하단에는 1000 메쉬 체를 사용하여 핵을 수집합니다.
   참고 : 식물의 핵 크기에 따라 체에 적합한 메쉬 크기를 선택하십시오.
7. 체 뒷면에 멸균 여과지를 사용하여 용해물의 작은 세포 파편을 흡수하십시오.
8. 용해물을 함유하는 나머지 핵을 1000 메쉬 체의 윗면에 네 개의 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
9. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.
10. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액으로 펠렛을 세척하십시오.
11. 800 μL의 핵 세척 완충액을 첨가하고 튜브를 부드럽게 반전시켜 펠렛을 재현탁시킨다. 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 다시 회전시킨다.
12. 총 3 번의 세척을 수행하십시오.
13. (선택 사항) DAPI 염색을 위해 현미경으로 핵을 이미지화한다.
    1. 100 μL의 핵 현탁액을 단계 2.11로부터 핵 세척 완충액으로 옮긴다. 새로운 1.5 mL 튜브에. 900 μL의 핵 세척 완충액과 2 μL의 DAPI 원액 (1 mg / mL)을 첨가하여 DAPI에 대해 2 μg / mL의 최종 작업 농도를 만듭니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
    2. 염색 후, 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다.
    3. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하십시오. 800 μL의 핵 세척 완충액으로 3회 세척한다.
    4. 상층액을 가능한 한 많이 제거하고 핵 세척 완충액 100μL로 핵을 재현탁시킨다.
    5. DAPI 채널을 사용하여 형광 현미경으로 핵을 이미지화한다.
14. 두 개의 튜브 (각 1.5 mL 튜브에서 부피가 ~ 50 μL의 핵)에서 핵을 결합하십시오. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 최대한 제거하십시오.

3. 항체 배양

1. 각 50 μL의 핵을 1.5 mL 튜브에 1 mL의 항체 완충액과 함께 재현탁시킨다.
2. 각 튜브에 150 μL의 핵(~1 μg의 크로마틴)과 2 μL의 IgG(1 mg/mL)를 갖는 IgG 대조군의 2개의 생물학적 복제물, 각 튜브에 150 μL의 핵과 2 μL의 항-H3K4me3 항체(1 mg/mL)를 갖는 H3K4me3 분석 그룹의 두 개의 생물학적 복제물.
3. 용액을 부드럽게 혼합하고 튜브를 4°C 및 12 rpm에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 수평 진탕기 상에 방치한다.
4. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각시킨다. 50 mL 원심분리 튜브에서 신선한 50 mL의 면역침전(IP) 세척 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, ,0.05% w/v 디지토닌)을 준비한다. 튜브를 얼음 위에 앉히십시오.
5. 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 각 튜브에서 항체 완충액을 분리한다.
6. 800 μL의 IP 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하고 부드럽게 혼합하십시오. 튜브를 실온에서 5 분 동안 수평 쉐이커에 놓고 12 rpm으로 두십시오.
7. 세척 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오.
   참고 : 핵 펠릿의 교란을 피하려면 ~ 50-80 μL의 완충액을 핵과 함께 두십시오.
8. 3.6.-3.7단계를 반복합니다. 두 번 더.
9. 세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.

4. 트랜스포자제 인큐베이션

1. IP 세척 완충액 1 mL를 5 M NaCl 중 30 μL와 혼합하여 신선한 트랜스포사제 인큐베이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 0.05% w/v 디지토닌)을 만드십시오.
2. 인큐베이션을 위한 Tn5 트랜스포자제 믹스를 제조하기 위해, 트랜스포자제 인큐베이션 완충액의 각 150 μL에 트랜스포자제 1 μL를 첨가한다.
   주: 반응 횟수에 따라 먼저 트랜스포자제 용액 믹스를 준비한 다음, 각 튜브에 150 μL의 분취량을 첨가한다.
3. 핵을 150 μL의 트랜스포사제 용액으로 재현탁시킨다.
4. 튜브를 실온에서 2-3 시간 동안 12 rpm의 수평 쉐이커에 놓고 10-15 분마다 혼합하십시오.
5. 트랜스포자제 인큐베이션 후, 튜브를 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 트랜스포사제 인큐베이션 완충액을 각 튜브에서 제거한다.
6. IP 세척 버퍼로 튜브를 세척하십시오. 이렇게 하려면 각 튜브에 800μL의 IP 세척 버퍼를 넣고 부드럽게 혼합한 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 12rpm의 수평 진탕기에 둡니다.
7. 4°C에서 300 rcf에서 4분 동안 원심분리한다. 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하십시오.
8. 4.6.-4.7단계를 반복합니다. 두 번 더.
9. 세 번째 세척 후, 4°C에서 300 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하십시오.

5. 태그 지정

1. 2 mL의 태멘테이션 완충액 (10 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM 스페르미딘, 프로테아제 억제제 칵테일 0.1%, 10 mM _MgCl2, 0.05% w/v 디지토닌)을 2 mL의 IP 세척 완충액과 60 μL의 5 M NaCl 및 20 μL의 1 M _MgCl2와 혼합하여 갓 만든다.
2. 핵을 300μL의 태멘테이션 버퍼로 재현탁시킨다.
3. 용액을 혼합하고 태깅을 위해 1 h 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.
4. 10 μL의 0.5 M EDTA (최종 농도∼15 mM) 및 30 μL의 10% SDS (최종 농도 1%)로 태깅을 중단한다.

6. DNA 추출 및 NGS 라이브러리 구축

1. ⁷에 기재된 바와 같이 300 μL의 CTAB DNA 추출 완충액을 첨가한다. 튜브를 65°C 수조에서 30분 동안 인큐베이션한다. ~ 10 분마다 혼합하도록 반전하십시오.
2. 600 μL의 페놀:클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1)을 각 튜브에 첨가한다. 철저히 섞으십시오.
3. 상잠금겔 튜브를 4°C에서 13,000 rcf에서 2분 동안 원심분리한다. 상기 용액을 위상 잠금 겔 튜브로 옮깁니다.
4. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
5. 상청액(∼600 μL)을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
6. 600 μL의 클로로포름을 각 튜브에 첨가하십시오. 철저히 섞으십시오.
7. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
8. 상청액 (∼600 μL)을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮긴다.
9. 12 μL의 100% 에탄올과 2μL의 글리코블루 공침제를 첨가한다. 완전히 혼합하고 -20°C에서 1시간 동안 보관한다.
10. 4°C에서 13,000 rcf에서 10분 동안 원심분리한다.
11. 상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 75% (v/v) 에탄올을 사용하여 세척하고 4°C에서 13,000 rcf에서 5분 동안 원심분리한다.
12. 상층액을 데칸트하십시오. DNA 펠릿을 공기-건조시키고 DNA를 25 μL의 _ddH2O에 재현탁시켰다.
13. PCR 반응을 다음과 같이 설정한다. 총 50 μL의 반응을 위해, 24 μL의 DNA, 11 μL의 _ddH2O, 10 μL의 5x TAE 완충액, 2 μL의 P5 프라이머 (10 μM), 2 μL의 P7 프라이머 (10 μM) 및 1 μL의 TruePrep 증폭 효소를 첨가한다. PCR 프로그램: 3분 동안 72°C, 30초 동안 98°C; 그 후 30초 동안 98°C, 30초 동안 60°C, 30초 동안 72°C의 14 사이클을 거쳐 5분 동안 72°C로 사이클하였다.
    참고: 연장을 위해 3분 동안 처음 72°C는 건너뛸 수 없습니다 . 라이브러리의 과다 증폭은 NGS에서 높은 수준의 PCR 중복을 초래할 것이다. 각 반응에서 ∼1 μg의 크로마틴을 사용할 때 H3K4me3에 대한 PCR 반응에서 12-14 PCR 사이클부터 시작한다.
14. PCR 산물 2 μL를 전기영동을 위해 1.5% 아가로스 겔에 로딩한다.
15. 상용 DNA 정제 자석 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제한다.
16. 라이브러리를 형광계 및 아가로스 겔 전기영동으로 정량화한다.
    참고: 라이브러리의 유효 농도는 양호한 품질을 보장하기 위해 qPCR에 의해 >2 nM이어야 합니다.
17. 차세대 염기서열 분석(NGS) 및 데이터 분석을 수행합니다.

결과

그림 1은 CUT&Tag 워크플로를 보여 줍니다. 도 2는 무손상 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. "핵 분리" 단계의 목표는 후속 CUT&Tag 반응을 위해 충분한 양으로 온전한 핵을 수득하는 것이었다. 도 3은 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동을 나타낸다. IgG 음성 대조군은 실험을 설정할 때 병렬로 요구된다. IgG 대조군과 비교하여, H3K4me3 항체 샘플로 ...

토론

여기에서는 염색질 면역침전(ChIP)에 비해 절차가 단순화된 적은 수의 세포를 사용하여 고분해능과 매우 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성하는 기술인 CUT&Tag에 대해 설명했습니다. 면화 잎에서 H3K4me3 프로파일 링을 성공적으로 수행 한 것은 동물 세포를 위해 처음 설계된 CUT & Tag가 식물 세포에도 사용될 수 있음을 시사합니다. ChIP ^assay8에 일반적으로 사용되는 트리스 버퍼 시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W