Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

Résumé

Le clivage sous les cibles et le marquage (CUT&Tag) est une stratégie efficace de profilage épigénomique de la chromatine. Ce protocole présente une stratégie CUT&Tag affinée pour le profilage des modifications des histones chez les plantes.

Résumé

La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduisent à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. Le clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag) est une méthode d’attachement enzymatique dans laquelle la protéine spécifique de chromatine est d’abord reconnue par son anticorps spécifique, puis l’anticorps attache une protéine de fusion A-transposase (pA-Tn5), qui clive la chromatine ciblée in situ par l’activation d’ions magnésium. Ici, nous fournissons notre protocole CUT&Tag précédemment publié en utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allortetraploïdes avec modification. Ce protocole étape par étape peut être utilisé pour la recherche épigénomique chez les plantes. En outre, des modifications substantielles pour l’isolement des noyaux végétaux sont accompagnées de commentaires critiques.

Introduction

Les sites d’ADN de liaison au facteur de transcription et la chromatine ouverte associée aux marques de modification des histones jouent un rôle fonctionnel essentiel dans la régulation de l’expression des gènes et constituent les principaux axes de recherche épigénétique1. Classiquement, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplé au séquençage profond (ChIP-seq) a été utilisé pour l’identification à l’échelle du génome de la modification spécifique de l’histone de la chromatine ou de cibles d’ADN avec des protéines spécifiques, et est largement adopté dans le domaine de l’épigénétique2. La technologie de clivage sous cibles et de marquage (CUT&Tag) a été développée à l’origine par le laboratoire Henikoff pour capturer les fragments d’ADN affiliés aux protéines dans tout le ^génome5. Par rapport au ChIP, CUT&Tag peut générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et avec un arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure ^simplifiée3. À ce jour, des méthodes d’analyse des régions de chromatine avec des modifications spécifiques des histones à l’aide de CUT&Tag ont été établies dans des cellules ^animales4,5. Plus précisément, le CUT&Tag unicellulaire (scCUT&Tag) a également été développé avec succès pour les tissus et cellules ^humains6. Cependant, en raison de la complexité de la paroi cellulaire et des métabolites secondaires, CUT&Tag est toujours techniquement difficile pour les tissus végétaux.

Auparavant, nous avions signalé un protocole CUT&Tag utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allotétraploïdes4. Pour démontrer l’efficacité de l’isolement des noyaux et de la capture de l’ADN à l’aide de tissus végétaux, la procédure de profilage est présentée ici. Les principales étapes comprennent l’isolement des noyaux intacts, l’incubation in situ avec l’anticorps pour la modification de la chromatine, l’incubation de la transposase, l’intégration de l’adaptateur et la préparation de la bibliothèque d’ADN. Le dépannage se concentre sur la préparation de la bibliothèque CUT&Tag pour l’isolation des noyaux de la plante et le contrôle qualité.

Dans cette étude, nous présentons une stratégie CUT&Tag affinée pour les plantes. Non seulement nous fournissons un protocole étape par étape pour le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton, mais nous fournissons également une méthodologie optimisée pour l’isolement des noyaux végétaux, y compris la stratégie de sélection de la concentration de détergent pour une lyse cellulaire appropriée et la stratégie de filtrage des noyaux. Des étapes détaillées avec des commentaires critiques sont également incluses dans ce protocole mis à jour.

Protocole

1. Préparer la transposase et les solutions mères (Jour 1)

REMARQUE: Dans cette partie, les adaptateurs oligonucléotidiques sont complexés avec la transposase Tn5 pour rendre la transposase active.

1. Diluez les apprêts (apprêt A, apprêt B et apprêt C) jusqu’à une concentration de 100 μM à l’aide du tampon de recuit (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (voir le tableau 1 pour les informations de séquence des apprêts et le tableau 2 pour les recettes de solutions de travail). Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Mettre en place les deux réactions suivantes dans les tubes PCR : Réaction 1 (adaptateur AB), 10 μL d’amorce A de 100 μM, 10 μL d’amorce B de 100 μM ; Réaction 2 (adaptateur AC), 10 μL de 100 μM amorce A, 10 μL 100 μM amorce C.
3. Recuit les adaptateurs dans la machine PCR à l’aide du programme suivant: couvercle chauffant (102 °C), 75 °C pendant 15 min, 60 °C pendant 10 min, 50 °C pendant 10 min, 40 °C pendant 10 min, 25 °C pendant 30 min.
   REMARQUE: Les adaptateurs sont des molécules d’ADN partiellement double brin (concentration = 50 pmol / μL).
4. Mettre en place la réaction suivante dans un tube centrifuge de 1,5 mL : 10 μL de transposase pA-Tn5 (500 ng/μL ou 7,5 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AB (50 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AC (50 pmol/μL), 7 μL de tampon de couplage. Pipette 20x doucement pour bien mélanger et incuber à 30 °C au bain-marie pendant 1 h. Concentration finale de transposase = 4 pmol/μL. Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE: Rapport molaire de l’adaptateur AB: adaptateur AC: transposase = 0,5: 0,5: 1.
5. Préparer les solutions mères selon les recettes fournies dans le tableau 2 et autoclaver ou filtrer les solutions mères pour les stériliser.
6. Autoclavez et stérilisez des ciseaux, du papier filtre, un tamis en acier inoxydable, un mortier, des pilons, etc.

2. Isolement des noyaux (Jour 2)

1. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Pour chaque 1 g de matière première (feuilles de coton), préparer 25 mL de tampon d’isolement nucléaire A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampon d’isolement nucléaire B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampon de lavage nucléaire (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %), 1 mL de tampon anticorps (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, 1 mg/mL BSA, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine). Laissez les tubes reposer sur la glace jusqu’à utilisation.
2. Broyer les feuilles fraîches (~1 g) dans de l’azote liquide en une poudre fine et les transférer dans un tube de 50 mL contenant 25 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré A.
3. Mélanger doucement la solution tampon et incuber le tube sur de la glace pendant 5 min en agitant doucement pour disperser le matériau uniformément.
4. Centrifuger pendant 5 min à 500 rcf à 4 °C pour former la pastille de cellule.
5. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 20 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré B complété par 0,5% de Triton X-100. Inverser doucement le tube pour remettre complètement la pastille en suspension.
   REMARQUE: Le tampon d’isolement nucléaire B de 20 mL est applicable pour 1 g de matière première, et ce volume peut être mis à l’échelle en conséquence.
   1. Effectuer un essai pilote pour tester l’effet de la concentration en série de Triton X-100 (p. ex., tampon d’isolement nucléaire B de 2 mL, chacun avec 0,1 %, 0,25 %, 0,5 % et 1 % de Triton X-100 pour 100 mg de tissus broyés). La concentration appropriée de Triton X-100 est indiquée par une accumulation de noyaux blancs/gris au fond et un surnageant vert foncé après lyse et centrifugation à basse vitesse (< 500 rcf pendant 4 min).
6. Filtrer le lysat cellulaire résultant avec une combinaison de deux tamis: un tamis de 500 mailles sur le dessus pour éliminer les plus gros débris tissulaires et un tamis de 1000 mailles sur le fond pour recueillir les noyaux.
   REMARQUE: Choisissez un maillage approprié pour les tamis en fonction de la taille des noyaux des plantes.
7. Utilisez du papier filtre stérile à l’arrière du tamis pour absorber les débris de petites cellules dans le lysat.
8. Transférer les noyaux restants contenant du lysat sur la face supérieure du tamis à 1000 mailles dans quatre tubes centrifuges frais de 1,5 mL.
9. Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.
10. Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette et lavez la pastille avec un tampon de lavage nucléaire.
11. Ajouter 800 μL du tampon de lavage nucléaire et inverser doucement les tubes pour remettre en suspension la pastille. Faire tourner à nouveau le tube pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C.
12. Effectuez un total de 3 lavages.
13. (Facultatif) Imagez les noyaux sous un microscope pour la coloration DAPI.
    1. Transférer 100 μL de suspension de noyaux dans le tampon de lavage nucléaire à partir de l’étape 2.11. à un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 900 μL de tampon de lavage nucléaire et 2 μL de solution mère de DAPI (1 mg/mL) pour obtenir une concentration de travail finale de 2 μg/mL pour le DAPI. Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
    2. Après coloration, centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.
    3. Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette. Lavez 3 fois avec 800 μL du tampon de lavage nucléaire.
    4. Retirez autant de surnageant que possible et remettez en suspension les noyaux avec 100 μL de tampon de lavage nucléaire.
    5. Imagez les noyaux sous un microscope à fluorescence à l’aide du canal DAPI.
14. Combinez les noyaux de deux tubes (~50 μL de noyaux en volume dans chaque tube de 1,5 mL). Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez autant que possible le tampon restant à l’aide d’une pointe de pipette.

3. Incubation d’anticorps

1. Remettre en suspension chaque 50 μL de noyaux dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL de tampon d’anticorps.
2. Mettre en place les réactions suivantes dans des tubes de 1,5 mL : deux répliques biologiques de groupes témoins d’IgG avec 150 μL de noyaux (~ 1 μg de chromatine) et 2 μL d’IgG (1 mg/mL) dans chaque tube, deux répliques biologiques de groupes de dosage H3K4me3 avec 150 μL de noyaux et 2 μL d’anticorps anti-H3K4me3 (1 mg/mL) dans chaque tube.
3. Mélanger doucement la solution et laisser les tubes sur un agitateur horizontal pour l’hybridation pendant la nuit à 4 °C et 12 tr/min.
4. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Préparer 50 mL frais de tampon de lavage d’immunoprécipitation (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1%, 0,05% p/v digitonine) dans un tube centrifuge de 50 mL. Laissez le tube reposer sur la glace.
5. Centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’anticorps de chaque tube.
6. Ajouter 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube et mélanger doucement. Laissez les tubes sur un agitateur horizontal pendant 5 min à température ambiante et à 12 tr/min.
7. Après lavage, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.
   REMARQUE: Pour éviter toute perturbation de la pastille de noyaux, laissez ~ 50-80 μL du tampon avec les noyaux.
8. Répétez les étapes 3.6.-3.7. deux fois de plus.
9. Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.

4. Incubation de la transposase

1. Préparer 1 mL de tampon d’incubation de transposase (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 1 mL du tampon de lavage IP avec 30 μL de 5 M NaCl.
2. Pour préparer le mélange de transposase Tn5 pour l’incubation, ajouter 1 μL de transposase à chaque 150 μL du tampon d’incubation de la transposase.
   REMARQUE: Préparer d’abord le mélange de solution de transposase en fonction du nombre de réactions, puis ajouter une aliquote de 150 μL à chaque tube.
3. Remettre en suspension les noyaux avec 150 μL de solution de transposase.
4. Laisser les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 2-3 h à température ambiante et mélanger toutes les 10-15 min.
5. Après incubation de la transposase, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’incubation de la transposase dans chaque tube.
6. Lavez les tubes avec un tampon de lavage IP. Pour ce faire, ajoutez 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube, mélangez doucement et laissez les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 5 min à température ambiante.
7. Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.
8. Répétez les étapes 4.6.-4.7. deux fois de plus.
9. Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.

5. Balisage

1. Préparer fraîchement 2 mL du tampon de marquage (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %, 10 mM _MgCl2, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 2 mL de tampon de lavage IP avec 60 μL de 5 M NaCl et 20 μL de 1 M _MgCl2.
2. Resuspendez les noyaux avec 300 μL de tampon de marquage.
3. Mélanger la solution et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h pour le marquage.
4. Arrêter le marquage avec 10 μL de 0,5 M d’EDTA (concentration finale ~15 mM) et 30 μL de FDS à 10 % (concentration finale 1 %).

6. Extraction de l’ADN et construction de la bibliothèque NGS

1. Ajouter 300 μL de tampon d’extraction d’ADN CTAB comme ^décrit7. Incuber les tubes dans un bain-marie à 65 °C pendant 30 min. Inverser pour mélanger toutes les ~10 min.
2. Ajouter 600 μL de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1) dans chaque tube. Mélanger.
3. Pré-centrifuger les tubes de gel à verrouillage de phase pendant 2 min à 13 000 rcf à 4 °C. Transférer la solution ci-dessus dans des tubes de gel à verrouillage de phase.
4. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
5. Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
6. Ajouter 600 μL de chloroforme à chaque tube. Mélanger.
7. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
8. Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
9. Ajouter 12 μL d’éthanol à 100 % et 2 μL de coprécipitant GlycoBlue. Bien mélanger et conserver à -20 °C pendant 1 h.
10. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
11. Décantez le surnageant. Laver la pastille d’ADN à l’aide d’éthanol à 75 % (v/v) et centrifuger pendant 5 min à 13 000 rcf à 4 °C.
12. Décantez le surnageant. Séchez la pastille d’ADN à l’air libre et remettez en suspension l’ADN dans 25 μL de _ddH2O.
13. Configurez la réaction PCR comme suit. Pour un total de 50 μL de réaction, ajoutez 24 μL d’ADN, 11 μL de _ddH2O, 10 μL de tampon TAE 5x, 2 μL d’amorce P5 (10 μM), 2 μL d’amorce P7 (10 μM) et 1 μL d’enzyme TruePrep Amplify. Programme PCR : 72 °C pendant 3 min, 98 °C pendant 30 s ; puis 14 cycles de 98 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de 72 °C pendant 5 min.
    REMARQUE: Les premiers 72 °C pendant 3 min pour l’extension ne peuvent pas être ignorés. La suramplification de la bibliothèque conduira à un niveau élevé de doublons PCR dans le NGS. Commencez à partir de 12-14 cycles de PCR dans la réaction pcrifique pour H3K4me3 en utilisant ~ 1 μg de chromatine dans chaque réaction.
14. Chargez 2 μL des produits PCR sur un gel d’agarose à 1,5% pour l’électrophorèse.
15. Purifier les produits pcr à l’aide de billes magnétiques de purification de l’ADN commerciales.
16. Quantifiez la bibliothèque avec un fluoromètre et une électrophorèse sur gel d’agarose.
    REMARQUE: La concentration effective de la bibliothèque doit être >2 nM par qPCR pour assurer une bonne qualité.
17. Effectuez le séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.

Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail CUT&Tag. La figure 2 montre la coloration DAPI des noyaux intacts. L’objectif de l’étape « isolement des noyaux » était d’obtenir les noyaux intacts en quantité suffisante pour la réaction CUT&Tag ultérieure. La figure 3 montre l’électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR. Le contrôle négatif IgG est requis en parallèle lors de la mise en place de l’expérienc...

Discussion

Ici, nous avons décrit CUT&Tag, une technologie permettant de générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Notre succès avec le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton suggère que CUT&Tag, qui a d’abord été conçu pour les cellules animales, peut également être utilisé pour les cellules végétales. Le système t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)			Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
magnesium chloride (MgCl2)			Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail	Calbiochem	539133-1SET
potassium chloride (KCl)			Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl)			Make 5 M NaCl stock solution
spermidine			Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS)			Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base			Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100			Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag	Vazyme	S602/S603	Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
PCR machine	Applied Biosystems	ABI9700
Orbital shaker	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W