Obtención de macrófagos a partir de monocitos humanos para evaluar la tasa de infección por Leishmania braziliensis y la respuesta inmunitaria innata del huésped

Resumen

Este protocolo describe el proceso de obtención de macrófagos humanos a partir de monocitos para la infección por Leishmania braziliensis. También permite a los investigadores evaluar la tasa de infección y la viabilidad del parásito, la producción de ROS mediante microscopía de fluorescencia y la producción de mediadores inflamatorios en sobrenadantes de cultivo para investigar la respuesta de los macrófagos a la infección.

Resumen

Los macrófagos son células multifuncionales esenciales para el funcionamiento del sistema inmunitario y la célula huésped principal de la infección por Leishmania braziliensis (Lb). Estas células están especializadas en el reconocimiento de microorganismos y la fagocitosis, pero también activan otras células inmunitarias y antígenos presentes, además de promover la inflamación y la reparación de tejidos. Aquí, describimos un protocolo para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos para separar monocitos que luego se diferencian en macrófagos. Estas células pueden infectarse in vitro a diferentes concentraciones de Lb para evaluar la capacidad de controlar la infección, así como evaluar la respuesta inmunitaria de la célula huésped, que puede medirse mediante varios métodos. Las PBMC se aislaron primero por centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque y luego se sembraron para permitir que los monocitos se adhirieran a las placas de cultivo; Las células no adherentes se eliminaron mediante lavado. A continuación, las células adherentes se cultivaron con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) durante 7 días para inducir la diferenciación de macrófagos. Sugerimos sembrar 2 x 10⁶ células por pocillo en placas de 24 pocillos para obtener 2 x 10⁵ macrófagos. Los macrófagos completamente diferenciados pueden infectarse con Lb durante 4 o 24 horas. Este protocolo da como resultado un porcentaje significativo de células infectadas, que pueden ser evaluadas por microscopía óptica o de fluorescencia. Además del índice de infección, la carga parasitaria se puede medir contando el número de parásitos dentro de cada célula. También se pueden realizar ensayos moleculares y funcionales adicionales en sobrenadantes de cultivo o dentro de los propios macrófagos, lo que permite que este protocolo se aplique en una variedad de contextos y también se adapte a otras especies de parásitos intracelulares.

Introducción

El parásito protozoario intracelular del género Leishmania es el agente causal de un complejo de enfermedad desatendida conocido como leishmaniasis¹. Estas enfermedades tropicales tienen una amplia gama de manifestaciones clínicas que pueden ir desde lesiones cutáneas hasta complicaciones derivadas de la forma visceral de la enfermedad, que pueden ser mortales si no se tratan. La leishmaniasis cutánea (LC) es la forma más frecuente de leishmaniasis y se caracteriza por una o pocas lesiones cutáneas ulceradas con inflamación crónica exacerbada². El desarrollo de la enfermedad depende de la especie de Leishmania, además de una combinación de factores asociados con la respuesta inmune del huésped, que definen los resultados clínicos ^3,4. Leishmania braziliensis es la principal especie causante de CL en Brasil, con casos reportados en todos los estados del país⁵. La respuesta inmune contra L. braziliensis se considera protectora, ya que restringe el parásito al sitio de inoculación, e involucra varios tipos de células inmunes, como macrófagos, neutrófilos y linfocitos ^4,6,7.

Los macrófagos son células multifuncionales esenciales para el sistema inmunitario, ya que están especializados en la detección y fagocitosis de microorganismos, y pueden presentar antígenos y activar otros tipos de células. Los macrófagos son capaces de regular procesos que van desde la inflamación hasta la reparación de tejidos y el mantenimiento de la homeostasis ^8,9. Estas células juegan un papel esencial en la respuesta inmune temprana contra parásitos intracelulares, como la Leishmania, siendo importantes para su eliminación 10,11,12.

Durante la infección por L. braziliensis, los macrófagos pueden responder a través de diferentes mecanismos para eliminar el parásito, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y mediadores inflamatorios^13,14. Las respuestas inmunitarias pueden ser guiadas por la producción de citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias, que contribuyen a un estado inflamatorio exacerbado o a procesos de reparación de tejidos ^6,15,16. La plasticidad de los macrófagos es fundamental para la inmunopatogenia de la CL, así como para la interacción parásito-huésped, y estas células se consideran cruciales para la elucidación de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.

Dado que la CL es una enfermedad compleja, las investigaciones requieren que los investigadores exploren tipos de células que imiten a las que se encuentran en los seres humanos. Las respuestas inmunitarias observadas en diferentes modelos experimentales pueden variar y producir resultados que no reflejan la respuesta inmunitaria observada en humanos infectados de forma natural. Por lo tanto, el protocolo que se presenta en este documento fue diseñado para permitir el estudio de los macrófagos humanos y sus respuestas inmunes durante la LC causada por L. braziliensis.

Protocolo

El Comité de Revisión Institucional de Ética en Investigación en Seres Humanos del Instituto Gonçalo Moniz (Fundación Oswaldo Cruz-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahía-Brasil), aprobó este estudio (número de protocolo: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Aislamiento de PBMC humanos

1. Asegúrese de que las muestras de sangre, el gradiente de densidad de 1,077 g/ml (p. ej., Ficoll-Histopaque) y la solución salina estén a temperatura ambiente.
2. Diluya las muestras de sangre con solución salina en una proporción de 1:1.
3. Transfiera 10-12 mL de gradiente de densidad a tubos de 50 mL.
4. Superponga cuidadosamente hasta 40 ml de la muestra de sangre diluida sobre el gradiente de densidad. Separe las capas de sangre y gradiente de densidad.
5. Primera centrifugación: tubos de centrífuga que contienen sangre y capas de gradiente de densidad a 400 x g durante 30 min a 24 ºC.
   NOTA: Apague el freno antes de poner en marcha la centrífuga.
6. Extraiga el plasma por encima del anillo PBMC con una pipeta (la capa de capa leucitaria se encuentra entre las capas de plasma y gradiente de densidad; debajo de ella están los glóbulos rojos/granulocitos).
7. Transfiera la capa de PBMC en forma de nube (capa de capa leucocitaria) con una pipeta a un tubo de 15 ml y llénelo con solución salina fría (mantenida en hielo o a 4 °C).
8. Segunda centrifugación: tubos de centrífuga a 300 x g durante 10 min a 4 °C con el freno activado.
9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet llenando el tubo con solución salina fría.
10. Tercera centrifugación: tubos de centrífuga a 250 x g durante 10 min a 4 °C con el freno activado.
11. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet, llenando el tubo con solución salina fría.
12. Cuarta centrifugación: centrifugar el tubo a 200 x g durante 10 min a 4 °C con el freno activado.
13. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 mL de medio RPMI frío.
14. Cuente las celdas para determinar el número de celdas obtenidas.

2. Diferenciación en macrófagos humanos

NOTA: Para una placa de 24 pocillos, calcule la cantidad total de celdas necesarias para colocar 2 x 10⁶ celdas por pocillo, lo que producirá 2 x 10⁵ macrófagos. Este rendimiento se basa en un promedio de 10% de monocitos en sangre humana. Alternativamente, los monocitos también pueden liberarse por métodos no enzimáticos y luego contarse para la siembra.

1. En una placa de 24 pocillos, coloque cubreobjetos de vidrio redondos de 13 mm en el fondo de cada pocillo. Placa el equivalente a 2×10⁶ celdas en 1 mL de RPMI incompleto por pocillo.
   NOTA: Limite el número de celdas en cada pocillo, ya que las cantidades sobreestimadas pueden dificultar la adhesión de las células y comprometer el cultivo. Además, todos los cubreobjetos deben estar limpios y estériles.
2. Placas de incubación durante 30 min a 37 ºC bajo 5% de CO₂ para la adhesión celular.
3. Retire los sobrenadantes y lave una vez con solución salina al 0,9% a temperatura ambiente para eliminar las células no adherentes.
4. Después del lavado, retire la solución salina y agregue 250 μL de medio RPMI suplementado a temperatura ambiente (10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 50 ng/mL M-CSF) a cada pocillo.
5. Incubar las células durante 7 días a 37 ºC bajo 5% de CO₂.
   1. Agregue 125 μL de medio RPMI suplementado a cada pocillo cada dos días. Al final de la diferenciación celular, el volumen final será de 500 μL por pocillo.
   2. Para analizar la viabilidad celular, realice otro cultivo en paralelo en una placa de 96 pocillos (2 x 10⁵ por pocillo).
   3. Después de la diferenciación en macrófagos (7 días), añadir 20 μL de reactivo AlamarBlue.
   4. Después de 7 horas de incubación, lea las placas en un espectrofotómetro a longitudes de onda de 570 nm y 600 nm.

3. Cultivo e infección por Leishmania

NOTA: En este ensayo se utilizaron promastigotes de L. braziliensis de dos cepas diferentes (MHOM/BR/01/BA788 y MHOM/BR88/BA-3456).

1. Cuente los parásitos Lb y calcule el volumen para obtener 5 x 10^{parásitos de 5}/mL.
2. Prepare un medio para insectos de Schneider suplementado (10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina).
3. Incubar los parásitos en un volumen total de 5 mL en una incubadora de 24 ºC hasta alcanzar la fase estacionaria (4 a 6 días).
   NOTA: Cuente los parásitos todos los días para evaluar el crecimiento.
4. Después de alcanzar la fase estacionaria, centrifugar los cultivos de Leishmania a 100 x g durante 10 min a 4 ºC para eliminar los parásitos muertos (precipitados en el fondo del tubo).
5. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 1.800 x g durante 10 min a 4 ºC para recuperar los parásitos viables. Deseche el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender el pellet con 1 mL de medio RPMI suplementado para contar los parásitos.
7. Calcule el volumen de parásitos para obtener una proporción de parásito:célula de 10:1. Transfiera los parásitos a placas de cultivo que contengan macrófagos previamente cultivados en medio RPMI suplementado (~300 μL/pocillo) a temperatura ambiente.
8. Retire el sobrenadante de cada pocillo que contenga macrófagos diferenciados.
   NOTA: Tan pronto como sea posible, reemplace el medio en cada pocillo para evitar que las células pasen períodos prolongados sin medio. Sugerimos quitar y reemplazar el medio en tres pocillos a la vez.
9. Transfiera la cantidad calculada de Lb a cada pocillo que contenga macrófagos diferenciados.
10. Infectar las células durante 4 o 24 horas a 37 ºC bajo 5% de CO₂.
    1. Después de 4 horas, lavar los macrófagos 3 veces con solución salina a temperatura ambiente para eliminar los parásitos no internalizados.
    2. Durante el período de infección de 24 horas, agregue 300 μL de medio RPMI suplementado a cada pocillo después del lavado, y luego reincube durante otras 20 horas a 37 °C bajo 5% de CO₂.
11. Retire el sobrenadante para medir los mediadores inflamatorios mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Centrifugar el sobrenadante recogido a 1.800 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Este procedimiento se realiza para eliminar cualquier parásito no internalizado. Los sobrenadantes pueden congelarse y mantenerse a -80^°C hasta el momento de los análisis futuros.
       NOTA: Las células se pueden utilizar para evaluar la tasa de infección, la viabilidad del parásito o la producción de ROS.

4. Evaluación de la infección

1. Cuantificación de la tasa de infección
   1. Agregue 300 μL de metanol a cada pocillo después de eliminar el sobrenadante. Espere 15 minutos para fijar las celdas adheridas a los cubreobjetos.
   2. Retire los cubreobjetos de los pocillos y colóquelos en un soporte para remojarlos en la solución de tinción celular (p. ej., Quick Panoptic 2) durante 1 min.
   3. Sumerja los cubreobjetos dos veces en la solución de tinción celular (por ejemplo, Quick Panoptic 3) y espere hasta que se sequen.
   4. Coloque 15 μL de medio de montaje (por ejemplo, Entellan) en portaobjetos y, a continuación, coloque cubreobjetos sobre el medio.
      NOTA: Todos los macrófagos adheridos a los cubreobjetos deben estar en contacto con el medio de montaje.
   5. Cuente 100 células al azar bajo un microscopio óptico utilizando un objetivo de 100x para cuantificar la tasa de infección y el número de amastigotes internalizados.
2. Viabilidad de los parásitos
   1. Después de 4 horas de infección, lavar las células con solución salina a temperatura ambiente 3 veces.
   2. Añadir 300 μL de medio para insectos de Schneider suplementado.
   3. Incubar en incubadora a 24 ºC.
   4. Cuantificar el crecimiento del parásito después de 48, 72, 96 y 120 horas.

5. Evaluación de la producción de ROS por microscopía de fluorescencia

1. Después del período de infección, retire el sobrenadante y lave las células con 500 μL de solución salina.
2. Añada 300 μL del reactivo de sonda fluorogénica (por ejemplo, el reactivo verde CellROX a 5 μM) a cada pocillo.
3. Incubar las células durante 30 min a 37 ºC y 5% de CO₂.
4. Lave las celdas 3 veces con 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
5. Fije las celdas con 300 μL de formaldehído al 3,7% y deje reposar durante 15 minutos.
   NOTA: Mida la señal de florescencia dentro de las 24 horas.
6. Añada 5 μL de agente de tinción DAPI (por ejemplo, DAPI ProLong Gold antidecoloración) para la tinción celular. Coloque el cubreobjetos con la superficie que contiene macrófagos en contacto directo con el agente de tinción DAPI.
7. Analice la señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485/520 nm.
8. Calcule la fluorescencia total de la célula corregida (CTCF) a partir de 30 células para cada cubreobjetos utilizando ImageJ.
   CTCF = Densidad integrada (área de una celda seleccionada x fluorescencia media de las lecturas de fondo)

6. Análisis estadístico

1. Utilice la prueba de Mann-Whitney para comparar dos grupos con muestras no apareadas. Realice los análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 7.0. Considere las diferencias estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

Resultados

La comprensión de la interacción entre parásitos y células huésped es crucial para dilucidar los mecanismos implicados en la patogénesis de varias enfermedades. Aunque las células humanas cultivadas se utilizan menos debido a las limitaciones del cultivo celular en comparación con los linajes celulares, el protocolo presentado en este documento muestra una diferenciación robusta y reproducible de los macrófagos humanos. Este protocolo permite analizar varios aspectos de la resp...

Discusión

El protocolo presentado aquí para la diferenciación de monocitos humanos en macrófagos seguida de la infección con dos cepas de L. braziliensis permite evaluar varios aspectos de la interacción parásito-célula. Estas herramientas pueden ser cruciales para dilucidar las preguntas sin respuesta sobre el CL. Con el establecimiento de este protocolo, nuestro grupo pudo descubrir algunos aspectos de la respuesta inmune de los macrófagos obtenidos de individuos con diabetes y ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1100
Cell Culture Flask 25 cm²	SPL	70125
CellROX Green Reagent	Invitrogen	C10444
Coverslip circles 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306
Disposable support for blood collection	BD Vacutainer	364815
Eclipse blood collection needle 21 g x 1.25 in	BD Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Falcon Conical Tubes, 15 mL	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mL	StemCell Technologies	100-0090
Fetal Bovine Serum	Gibco	A4766801
Formaldehyde 3.7%	Merck	252549
Glass slide  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Human IL-6 ELISA Kit	RD	DY206
Human M-CSF Recombinant Protein	PeproTech	300-25
Human TNF-a ELISA Kit	RD	DY210
Leukotriene B4 ELISA Kit	Cayman	520111
Methanol	Merck	MX0482
Penilicin-Sreptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher	10378-016
Phosphate Buffered Saline pH 7.2 (10x)	Gibco	70013032
Plasma tube, 158 USP units of sodium heparin (spray coated)	BD Vacutainer	367874
Quick H&E Staining Kit (Hematoxylin and Eosin)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Schneider's Insect Medium	Sigma Aldrich	S0146
Tissue Culture 24-wells Plate	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061