Gewinnung von Makrophagen aus humanen Monozyten zur Beurteilung der Infektionsrate von Leishmania braziliensis und der Immunantwort des angeborenen Wirts

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung menschlicher Makrophagen aus Monozyten zur Infektion mit Leishmania braziliensis. Es ermöglicht Forschern auch, die Infektionsrate und Lebensfähigkeit von Parasiten, die ROS-Produktion durch Fluoreszenzmikroskopie und die Produktion von Entzündungsmediatoren in Kulturüberständen zu bewerten, um die Reaktion von Makrophagen auf eine Infektion zu untersuchen.

Zusammenfassung

Makrophagen sind multifunktionale Zellen, die für die Funktion des Immunsystems unerlässlich sind, und die primäre Wirtszelle bei einer Infektion mit Leishmania braziliensis (Lb). Diese Zellen sind auf die Erkennung von Mikroorganismen und die Phagozytose spezialisiert, aktivieren aber auch andere Immunzellen und präsentieren Antigene, sowie fördern Entzündungen und Gewebereparaturen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMC) gesunder Spender, um Monozyten zu trennen, die sich dann zu Makrophagen differenzieren. Diese Zellen können dann in vitro in verschiedenen Lb-Konzentrationen infiziert werden, um die Fähigkeit zur Kontrolle der Infektion sowie die Immunantwort der Wirtszellen zu bewerten, die mit verschiedenen Methoden gemessen werden kann. PBMCs wurden zunächst durch Zentrifugieren mit einem Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert und dann plattiert, damit Monozyten an Kulturplatten haften konnten. Nicht adhärente Zellen wurden durch Waschen entfernt. Als nächstes wurden adhärente Zellen 7 Tage lang mit dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) kultiviert, um die Makrophagendifferenzierung zu induzieren. Wir empfehlen, 2 x 10⁶ Zellen pro Well auf 24-Well-Platten zu plattieren, um 2 x 10⁵ Makrophagen zu erhalten. Vollständig differenzierte Makrophagen können dann für 4 oder 24 Stunden mit Lb infiziert werden. Dieses Protokoll führt zu einem signifikanten Prozentsatz infizierter Zellen, der durch optische oder Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden kann. Zusätzlich zum Infektionsindex kann die Parasitenlast gemessen werden, indem die Anzahl der Parasiten in jeder Zelle gezählt wird. Weitere molekulare und funktionelle Assays können auch in Kulturüberständen oder innerhalb der Makrophagen selbst durchgeführt werden, was es ermöglicht, dieses Protokoll in einer Vielzahl von Kontexten anzuwenden und auch an andere intrazelluläre Parasitenarten anzupassen.

Einleitung

Der intrazelluläre Protozoenparasit der Gattung Leishmania ist der Erreger eines vernachlässigten Krankheitskomplexes, der als Leishmaniose bekannt^{ist 1}. Diese Tropenkrankheiten haben ein breites Spektrum an klinischen Manifestationen, die von Hautläsionen bis hin zu Komplikationen reichen können, die sich aus der viszeralen Form der Krankheit ergeben und unbehandelt tödlich sein können. Die kutane Leishmaniose (CL) ist die häufigste Form der Leishmaniose und zeichnet sich durch eine einzelne oder wenige ulzerierte Hautläsionen mit verschlimmerter chronischer Entzündung^{aus 2}. Die Entwicklung der Krankheit hängt von der Leishmania-Spezies ab, zusätzlich zu einer Kombination von Faktoren, die mit der Immunantwort des Wirts verbunden sind und die beide die klinischen Ergebnisse bestimmen ^3,4. Leishmania braziliensis ist die Hauptart, die CL in Brasilien verursacht, wobei Fälle in allen Bundesstaaten des Landes gemeldet wurden⁵. Die Immunantwort gegen L. braziliensis gilt als schützend, da sie den Parasiten auf die Impfstelle beschränkt und mehrere Immunzelltypen wie Makrophagen, Neutrophile und Lymphozyten umfasst ^4,6,7.

Makrophagen sind multifunktionale Zellen, die für das Immunsystem unerlässlich sind, da sie auf den Nachweis und die Phagozytose von Mikroorganismen spezialisiert sind und Antigene präsentieren und andere Zelltypen aktivieren können. Makrophagen sind in der Lage, Prozesse von der Entzündung über die Gewebereparatur bis hin zur Aufrechterhaltung der Homöostase^{zu regulieren 8,9}. Diese Zellen spielen eine wesentliche Rolle bei der frühen Immunantwort gegen intrazelluläre Parasiten wie Leishmanien und sind wichtig für deren Eliminierung 10,11,12.

Während einer Infektion mit L. braziliensis können Makrophagen durch verschiedene Mechanismen reagieren, um den Parasiten zu eliminieren, wie z. B. die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Entzündungsmediatoren^13,14. Immunreaktionen können durch die Produktion von proinflammatorischen oder entzündungshemmenden Zytokinen gesteuert werden, die zu einem verschlimmerten Entzündungszustand oder Gewebereparaturprozessen beitragen ^6,15,16. Die Plastizität von Makrophagen ist sowohl für die Immunpathogenese von CL als auch für die Parasit-Wirt-Interaktion von grundlegender Bedeutung, und diese Zellen gelten als entscheidend für die Aufklärung von Krankheitsmechanismen und für die Entwicklung neuer Therapieansätze.

Da CL eine komplexe Krankheit ist, müssen die Forscher bei der Untersuchung Zelltypen untersuchen, die denen des Menschen ähneln. Die Immunantworten, die in verschiedenen experimentellen Modellen beobachtet werden, können variieren und zu Ergebnissen führen, die nicht die Immunantwort widerspiegeln, die bei natürlich infizierten Menschen beobachtet wurde. Somit wurde das hierin vorgestellte Protokoll entwickelt, um die Untersuchung menschlicher Makrophagen und ihrer Immunantworten während der durch L. braziliensis verursachten CL zu ermöglichen.

Protokoll

Das Institutional Review Board for Ethics in Human Research am Gonçalo Moniz Institute (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brasilien) hat diese Studie genehmigt (Protokollnummer: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Isolierung humaner PBMCs

1. Stellen Sie sicher, dass die Blutproben, der Dichtegradient von 1,077 g/ml (z. B. Ficoll-Histopaque) und die Kochsalzlösung Raumtemperatur haben.
2. Blutproben mit Kochsalzlösung im Verhältnis 1:1 verdünnen.
3. Übertragen Sie 10-12 mL Dichtegradient auf 50 mL Röhrchen.
4. Legen Sie vorsichtig bis zu 40 ml der verdünnten Blutprobe auf den Dichtegradienten. Trennen Sie die Blut- und Dichtegradientenschichten.
5. Erste Zentrifugation: Zentrifugenröhrchen mit Blut- und Dichtegradientenschichten bei 400 x g für 30 min bei 24 ºC.
   HINWEIS: Schalten Sie die Bremse aus, bevor Sie die Zentrifuge starten.
6. Entfernen Sie das Plasma oberhalb des PBMC-Rings mit einer Pipette (die Buffy-Coat-Schicht befindet sich zwischen den Plasma- und Dichtegradientenschichten; darunter befinden sich rote Blutkörperchen/Granulozyten-Pellets).
7. Die wolkenartige PBMC-Schicht (Buffy Coat Layer) mit einer Pipette in ein 15 mL Röhrchen geben und mit kalter Kochsalzlösung auffüllen (auf Eis oder bei 4 °C lagern).
8. Zweite Zentrifugation: Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C bei eingeschalteter Bremse.
9. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Röhrchen mit kalter Kochsalzlösung füllen.
10. Dritte Zentrifugation: Zentrifugenröhrchen bei 250 x g für 10 min bei 4 °C bei eingeschalteter Bremse.
11. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut, indem Sie das Röhrchen mit kalter Kochsalzlösung füllen.
12. Vierte Zentrifugation: Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 10 min bei 4 °C bei eingeschalteter Bremse.
13. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 1 mL kaltem RPMI-Medium.
14. Zellen zählen, um die Anzahl der erhaltenen Zellen zu bestimmen.

2. Differenzierung in humane Makrophagen

HINWEIS: Berechnen Sie für eine 24-Well-Platte die Gesamtmenge an Zellen, die benötigt wird, um 2 x 10⁶ Zellen pro Well zu plattieren, was 2 x 10⁵ Makrophagen ergibt. Diese Ausbeute basiert auf durchschnittlich 10 % Monozyten im menschlichen Blut. Alternativ können Monozyten auch durch nicht-enzymatische Methoden freigesetzt und dann für die Plattierung gezählt werden.

1. Platzieren Sie auf einer 24-Well-Platte 13 mm runde Glasdeckgläser am Boden jeder Well. Plattieren Sie das Äquivalent von 2×10⁶ Zellen in 1 ml unvollständigem RPMI pro Well.
   HINWEIS: Begrenzen Sie die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung, da zu hoch geschätzte Mengen die Zelladhäsion behindern und die Kultivierung beeinträchtigen können. Darüber hinaus müssen alle Deckgläser sauber und steril sein.
2. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 ºC unter 5 % CO₂ für die Zelladhäsion.
3. Entfernen Sie die Überstände und waschen Sie sie einmal mit 0,9 % Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
4. Entfernen Sie nach dem Waschen die Kochsalzlösung und geben Sie 250 μl supplementiertes RPMI-Medium bei Raumtemperatur (10 % fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 ng/mL M-CSF) in jede Vertiefung.
5. Inkubieren Sie die Zellen 7 Tage lang bei 37 ºC unter 5 % CO₂.
   1. Geben Sie alle zwei Tage 125 μl supplementiertes RPMI-Medium in jede Vertiefung. Am Ende der Zelldifferenzierung beträgt das endgültige Volumen 500 μl pro Well.
   2. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu analysieren, führen Sie eine weitere Kultur parallel auf einer 96-Well-Platte (2 x 10⁵ pro Well) durch.
   3. Nach der Differenzierung in Makrophagen (7 Tage) fügen Sie 20 μl AlamarBlue Reagenz hinzu.
   4. Nach 7 Stunden Inkubation sind die Platten auf einem Spektralphotometer bei Wellenlängen von 570 nm und 600 nm abzulesen.

3. Leishmania-Kultur und Infektion

HINWEIS: In diesem Assay wurden L . braziliensis promastigotes aus zwei verschiedenen Stämmen (MHOM/BR/01/BA788 und MHOM/BR88/BA-3456) verwendet.

1. Zählen Sie Lb-Parasiten und berechnen Sie das Volumen, um 5 x 10⁵/ml-Parasiten zu erhalten.
2. Bereiten Sie ergänztes Schneider's Insect Medium vor (10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin).
3. Inkubieren Sie Parasiten mit einem Gesamtvolumen von 5 mL in einem 24 ºC Inkubator, bis die stationäre Phase erreicht ist (4 bis 6 Tage).
   HINWEIS: Zählen Sie jeden Tag die Parasiten, um das Wachstum zu beurteilen.
4. Nach Erreichen der stationären Phase werden die Leishmania-Kulturen bei 100 x g für 10 min bei 4 ºC zentrifugiert, um alle abgestorbenen Parasiten (die am Boden des Röhrchens ausgefällt werden) zu entfernen.
5. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 1.800 x g für 10 min bei 4 ºC zentrifugieren, um lebensfähige Parasiten zurückzugewinnen. Entsorgen Sie den Überstand.
6. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml supplementiertem RPMI-Medium, um die Parasiten zu zählen.
7. Berechnen Sie das Volumen der Parasiten, um ein Parasit:Zell-Verhältnis von 10:1 zu erhalten. Übertragen Sie Parasiten auf Kulturplatten, die Makrophagen enthalten, die zuvor in supplementiertem RPMI-Medium (~300 μl/Well) bei Raumtemperatur kultiviert wurden.
8. Entfernen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung, die differenzierte Makrophagen enthält.
   HINWEIS: Tauschen Sie das Medium so schnell wie möglich in jeder Vertiefung aus, um zu vermeiden, dass die Zellen längere Zeit ohne Medium auskommen. Wir empfehlen, das Medium in drei Vertiefungen gleichzeitig zu entfernen und auszutauschen.
9. Übertragen Sie die berechnete Menge an Lb in jede Vertiefung, die differenzierte Makrophagen enthält.
10. Infizieren Sie die Zellen für 4 oder 24 Stunden bei 37 ºC unter 5 % CO₂.
    1. Waschen Sie die Makrophagen nach 4 Stunden 3 Mal mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen.
    2. Für die 24-stündige Infektionsphase nach dem Waschen 300 μl supplementiertes RPMI-Medium in jede Vertiefung geben und dann weitere 20 Stunden bei 37 °C unter 5 % CO₂ rekubieren.
11. Entfernen Sie den Überstand, um Entzündungsmediatoren mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen.
    1. Zentrifugieren Sie den aufgefangenen Überstand bei 1.800 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Dieses Verfahren wird durchgeführt, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen. Überstände können eingefroren und bis zum Zeitpunkt der zukünftigen Analyse bei -80^°C aufbewahrt werden.
       HINWEIS: Zellen können verwendet werden, um die Infektionsrate, die Lebensfähigkeit von Parasiten oder die ROS-Produktion zu beurteilen.

4. Bewertung der Infektion

1. Quantifizierung der Infektionsrate
   1. Nach Entfernen des Überstands werden 300 μl Methanol in jede Vertiefung gegeben. Warten Sie 15 Minuten, um die an den Deckgläsern haften Zellen zu fixieren.
   2. Entfernen Sie die Deckgläser aus den Vertiefungen und legen Sie sie auf eine Stütze, um sie 1 Minute lang in der Zellfärbelösung (z. B. Quick Panoptic 2) einzuweichen.
   3. Tauchen Sie Deckgläser zweimal in Zellfärbelösung (z. B. Quick Panoptic 3) und warten Sie, bis sie getrocknet sind.
   4. Legen Sie 15 μl Eindeckmedium (z. B. Entellan) auf Objektträger und legen Sie dann Deckgläser über das Medium.
      HINWEIS: Alle Makrophagen, die an Deckgläsern befestigt sind, sollten mit dem Eindeckmedium in Kontakt kommen.
   5. Zählen Sie 100 Zellen nach dem Zufallsprinzip unter einem optischen Mikroskop mit einem 100-fachen Objektiv, um die Infektionsrate und die Anzahl der internalisierten Amastigoten zu quantifizieren.
2. Lebensfähigkeit von Parasiten
   1. Waschen Sie die Zellen nach 4 Stunden Infektion 3 Mal bei Raumtemperatur mit Kochsalzlösung.
   2. Fügen Sie 300 μL ergänztes Schneider's Insect Medium hinzu.
   3. Inkubieren Sie in einem 24 ºC Inkubator.
   4. Quantifizieren Sie das Parasitenwachstum nach 48, 72, 96 und 120 Stunden.

5. Bewertung der ROS-Produktion mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Entfernen Sie nach der Infektionsphase den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 500 μl Kochsalzlösung.
2. Geben Sie 300 μl des fluorogenen Sondenreagenzes (z. B. CellROX Green Reagenz bei 5 μM) in jede Vertiefung.
3. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 ºC und 5 % CO₂.
4. Waschen Sie die Zellen 3x mit 500 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
5. Die Zellen mit 300 μl 3,7 % Formaldehyd fixieren und 15 min ruhen lassen.
   HINWEIS: Messen Sie das Fluoreszenzsignal innerhalb von 24 Stunden.
6. Geben Sie 5 μl DAPI-Färbemittel (z. B. DAPI ProLong Gold Antifade) für die Zellfärbung hinzu. Legen Sie das Deckglas mit der Oberfläche, die Makrophagen enthält, in direkten Kontakt mit dem DAPI-Färbemittel.
7. Analysieren Sie das Fluoreszenzsignal mittels Fluoreszenzmikroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 485/520 nm.
8. Berechnen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) aus 30 Zellen für jedes Deckglas mit ImageJ.
   CTCF = Integrated Density (Fläche einer ausgewählten Zelle x Mittlere Fluoreszenz der Hintergrundmesswerte)

6. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie den Mann-Whitney-Test, um zwei Gruppen mit ungepaarten Stichproben zu vergleichen. Führen Sie die statistischen Analysen mit GraphPad Prism 7.0 durch. Betrachten Sie Unterschiede als statistisch signifikant, wenn p 0,05 <.

Ergebnisse

Das Verständnis der Interaktion zwischen Parasiten und Wirtszellen ist entscheidend, um die Mechanismen aufzuklären, die an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind. Obwohl kultivierte humane Zellen aufgrund von Einschränkungen der Zellkultur im Vergleich zu Zelllinien weniger verwendet werden, zeigt das hierin vorgestellte Protokoll eine robuste und reproduzierbare Differenzierung von humanen Makrophagen. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse verschiedener Aspekte ...

Diskussion

Das hierin vorgestellte Protokoll für die Differenzierung menschlicher Monozyten in Makrophagen, gefolgt von der Infektion mit zwei Stämmen von L. braziliensis , ermöglicht die Bewertung mehrerer Aspekte der Parasit-Zell-Interaktion. Diese Tools können entscheidend sein, um unbeantwortete Fragen zu CL zu klären. Mit der Etablierung dieses Protokolls war unsere Gruppe in der Lage, einige Aspekte der Immunantwort von Makrophagen aufzudecken, die von Personen mit Diabetes und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1100
Cell Culture Flask 25 cm²	SPL	70125
CellROX Green Reagent	Invitrogen	C10444
Coverslip circles 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306
Disposable support for blood collection	BD Vacutainer	364815
Eclipse blood collection needle 21 g x 1.25 in	BD Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Falcon Conical Tubes, 15 mL	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mL	StemCell Technologies	100-0090
Fetal Bovine Serum	Gibco	A4766801
Formaldehyde 3.7%	Merck	252549
Glass slide  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Human IL-6 ELISA Kit	RD	DY206
Human M-CSF Recombinant Protein	PeproTech	300-25
Human TNF-a ELISA Kit	RD	DY210
Leukotriene B4 ELISA Kit	Cayman	520111
Methanol	Merck	MX0482
Penilicin-Sreptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher	10378-016
Phosphate Buffered Saline pH 7.2 (10x)	Gibco	70013032
Plasma tube, 158 USP units of sodium heparin (spray coated)	BD Vacutainer	367874
Quick H&E Staining Kit (Hematoxylin and Eosin)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Schneider's Insect Medium	Sigma Aldrich	S0146
Tissue Culture 24-wells Plate	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061