Leishmania braziliensis 감염률 및 선천성 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 인간 단핵구에서 대식세포 획득

요약

이 프로토콜은 Leishmania braziliensis에 감염되기 위해 단핵구에서 인간 대식세포를 얻는 과정을 설명합니다. 또한 연구자들은 감염률과 기생충 생존력, 형광 현미경 검사에 의한 ROS 생산, 배양 상등액의 염증 매개체 생성을 평가하여 감염에 대한 대식세포 반응을 조사할 수 있습니다.

초록

대식세포는 면역 체계 기능에 필수적인 다기능 세포로, 리슈마니아 브라질리엔시스(Lb) 감염의 주요 숙주 세포입니다. 이 세포는 미생물 인식 및 식균작용에 특화되어 있을 뿐만 아니라 다른 면역 세포를 활성화하고 항원을 제시할 뿐만 아니라 염증 및 조직 복구를 촉진합니다. 여기에서는 건강한 기증자의 말초 혈액(PBMC)에서 단핵 세포를 얻어 단핵구를 분리한 다음 대식세포로 분화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 그런 다음 이러한 세포를 다양한 Lb 농도로 체외에서 감염시켜 감염 제어 능력을 평가하고 숙주 세포 면역 반응을 평가할 수 있으며, 이는 여러 방법으로 측정할 수 있습니다. PBMC는 먼저 Ficoll-Hypaque gradient로 원심분리하여 분리한 다음 단핵구가 배양 플레이트에 부착될 수 있도록 도금했습니다. 비부착성 세포는 세척에 의해 제거하였다. 다음으로, 대식세포 분화를 유도하기 위해 대식세포-집락자극인자(M-CSF)로 부착 세포를 7일 동안 배양하였다. 2 x 10⁵ 대식세포를 얻기 위해 24웰 플레이트에 웰당 2 x 10⁶ 셀을 도금하는 것이 좋습니다. 완전히 분화된 대식세포는 4시간 또는 24시간 동안 Lb에 감염될 수 있습니다. 이 프로토콜은 광학 또는 형광 현미경으로 평가할 수 있는 상당한 비율의 감염된 세포를 생성합니다. 감염 지수 외에도 기생충 부하는 각 세포 내부의 기생충 수를 세어 측정할 수 있습니다. 배양 상층액 또는 대식세포 자체 내에서 추가 분자 및 기능 분석을 수행할 수도 있으며, 이를 통해 이 프로토콜을 다양한 상황에 적용할 수 있으며 다른 세포 내 기생충 종에도 적용할 수 있습니다.

서문

리슈마니아(Leishmania) 속의 세포 내 원생동물 기생충은 리슈마니아증(leishmaniasis)으로 알려진 방치된 질병 복합체의 원인 병원체이다¹. 이러한 열대성 질환은 피부 병변에서 내장성 질환으로 인한 합병증에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보이며, 치료하지 않으면 치명적일 수 있습니다. 피부 리슈마니아증(CL)은 리슈마니아증의 가장 흔한 형태로, 악화된 만성 염증을 동반한 단일 또는 소수의 궤양 피부 병변이 특징이다². 질병의 발병은 리슈마니아(Leishmania) 종에 의존하며, 숙주 면역 반응과 관련된 요인들의 조합에 따라 달라지며, 둘 다 임상적 결과를 정의한다 ^3,4. Leishmania braziliensis는 브라질에서 CL을 유발하는 주요 종으로, 브라질의 모든 주에서 사례가 보고되었습니다⁵. L. braziliensis에 대한 면역 반응은 기생충을 접종 부위로 제한하고 대식 세포, 호중구 및 림프구와 같은 여러 면역 세포 유형을 포함하기 때문에 보호 ^4,6,7로 간주됩니다.

대식세포는 미생물의 검출 및 식세포작용에 특화되어 있으며 항원을 제시하고 다른 세포 유형을 활성화할 수 있기 때문에 면역 체계에 필수적인 다기능 세포입니다. 대식세포는 염증에서 조직 복구 및 항상성 유지에 이르는 과정을 조절할 수 있습니다 ^8,9. 이 세포는 리슈마니아(Leishmania)와 같은 세포 내 기생충에 대한 초기 면역 반응에 필수적인 역할을 하며, 이를 제거하는 데 중요합니다 10,11,12.

L. braziliensis 감염 동안 대식세포는 반응성 산소종(ROS) 및 염증 매개체(inflammatory mediator)의 생성과 같은 기생충을 제거하기 위해 다양한 메커니즘을 통해 반응할 수 있습니다^13,14. 면역 반응은 전염증성 또는 항염증성 사이토카인의 생성에 의해 유도될 수 있으며, 이는 염증 상태 악화 또는 조직 복구 과정에 기여합니다 ^6,15,16. 대식세포의 가소성은 CL의 면역 발병 기전과 기생충-숙주 상호 작용의 근간이며, 이러한 세포는 질병 메커니즘의 해명과 새로운 치료 접근법의 개발에 중요한 것으로 간주됩니다.

CL은 복잡한 질병이기 때문에 연구를 위해 연구자들은 인간에서 발견되는 세포 유형을 모방해야 합니다. 다양한 실험 모델에서 관찰된 면역 반응은 다양할 수 있으며 자연적으로 감염된 인간에서 관찰된 면역 반응을 반영하지 않는 결과를 생성할 수 있습니다. 따라서, 본원에 제시된 프로토콜은 L. braziliensis에 의해 유발된 CL 동안 인간 대식세포 및 이들의 면역 반응에 대한 연구를 가능하게 하도록 설계되었다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

Gonçalo Moniz Institute(Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brazil)의 인간 연구 윤리를 위한 기관 검토 위원회(Institutional Review Board for Ethics in Human Research)는 이 연구를 승인했습니다(프로토콜 번호: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. 인간 PBMC의 분리

1. 혈액 샘플, 1.077g/mL 밀도 구배(예: Ficoll-Histopaque) 및 식염수가 실온에 있는지 확인합니다.
2. 혈액 샘플을 식염수로 1:1 비율로 희석합니다.
3. 10-12 mL의 밀도 구배를 50 mL 튜브로 옮깁니다.
4. 최대 40mL의 희석된 혈액 샘플을 밀도 구배 위에 조심스럽게 오버레이합니다. 혈액 및 밀도 구배 층을 분리합니다.
5. 첫 번째 원심분리: 24ºC에서 30분 동안 400 x g 에서 혈액 및 밀도 구배층을 포함하는 원심분리 튜브.
   알림: 원심분리기를 시작하기 전에 브레이크를 끄십시오.
6. 피펫으로 PBMC 링 위의 혈장을 제거합니다(버피 코트 층은 혈장과 밀도 구배 층 사이에 위치하며 그 아래에는 적혈구/과립구 펠렛이 있습니다).
7. 피펫을 사용하여 구름 모양의 PBMC 층(버피 코트 층)을 15mL 튜브에 옮기고 차가운 식염수를 채웁니다(얼음 위에 보관하거나 4°C에서 보관).
8. 두 번째 원심분리: 브레이크를 켠 상태에서 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리 튜브.
9. 상층액을 버리고 튜브에 차가운 식염수를 채워 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
10. 3차 원심분리: 브레이크를 켠 상태에서 250 x g 의 원심분리기 튜브를 4°C에서 10분 동안 사용합니다.
11. 상등액을 버리고 펠릿을 다시 현탁시켜 튜브에 차가운 식염수를 채웁니다.
12. 네 번째 원심분리: 브레이크를 켠 상태에서 200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.
13. 상등액을 버리고 펠릿을 1mL의 차가운 RPMI 배지로 재현탁합니다.
14. 얻은 세포의 수를 결정하기 위해 세포를 세십시오.

2. 인간 대식세포로의 분화

참고: 24웰 플레이트의 경우 웰당 2 x 10⁶ 세포를 플레이트링하는 데 필요한 총 세포의 양을 계산하면 2 x 10⁵ 대식세포가 생성됩니다. 이 수율은 인간 혈액에 있는 평균 10%의 단핵구를 기준으로 합니다. 대안적으로, 단핵구는 비효소적 방법으로 방출된 다음 도금을 위해 계수될 수도 있습니다.

1. 24웰 플레이트에 각 웰 바닥에 13mm 원형 유리 커버슬립을 놓습니다. 웰당 불완전한 RPMI 1mL에 2×10⁶개 세포에 해당하는 플레이트를 만듭니다.
   참고: 과대평가된 양은 세포 부착을 방해하고 배양을 손상시킬 수 있으므로 각 웰의 세포 수를 제한하십시오. 또한 모든 커버슬립은 깨끗하고 멸균되어야 합니다.
2. 세포 접착을 위해 37ºC에서 5% CO₂ 이하로 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 상층액을 제거하고 실온에서 0.9% 식염수로 한 번 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
4. 세척 후 식염수를 제거하고 실온에서 보충된 RPMI 배지 250μL(10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 50 ng/mL M-CSF)을 각 웰에 첨가합니다.
5. 세포를 37ºC에서 5% CO₂ 이하로 7일 동안 배양합니다.
   1. 2일마다 125μL의 RPMI 배지를 각 웰에 추가합니다. 세포 분화가 끝나면 최종 부피는 웰당 500μL가 됩니다.
   2. 세포 생존율을 분석하려면 96웰 플레이트(웰당 2 x 10,⁵)에서 병렬로 다른 배양을 수행합니다.
   3. 대식세포로 분화한 후(7일) AlamarBlue 시약 20μL를 첨가합니다.
   4. 7 시간의 배양 후 570 nm 및 600 nm의 파장에서 분광 광도계에서 플레이트를 읽습니다.

3. 리슈마니아 문화와 감염

참고: 이 분석에는 두 가지 다른 균주(MHOM/BR/01/BA788 및 MHOM/BR88/BA-3456)의 L. braziliensis promastigotes가 사용되었습니다.

1. Lb 기생충을 세고 부피를 계산하여 5 x 10⁵/mL 기생충을 얻습니다.
2. 보충된 Schneider's Insect 배지(10% FBS, 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신)를 준비합니다.
3. 고정상(4-6일)에 도달할 때까지 24ºC 인큐베이터에서 총 5mL의 기생충을 배양합니다.
   참고: 성장을 평가하기 위해 매일 기생충의 수를 세십시오.
4. 정지 상태에 도달한 후 Leishmania 배양을 100 x g 에서 4ºC에서 10분 동안 원심분리하여 죽은 기생충(튜브 바닥에 침전됨)을 제거합니다.
5. 상층액을 새 튜브로 옮기고 1,800 x g 에서 4ºC에서 10분 동안 원심분리하여 생존 가능한 기생충을 회수합니다. 상등액을 버리십시오.
6. 기생충을 계수하기 위해 1mL의 보충된 RPMI 배지로 펠릿을 재현탁합니다.
7. 기생충의 부피를 계산하여 10:1의 기생충:세포 비율을 얻습니다. 실온에서 보충된 RPMI 배지(~300 μL/well)에서 이전에 배양한 대식세포를 포함하는 배양 플레이트로 기생충을 옮깁니다.
8. 분화된 대식세포를 포함하는 각 웰에서 상층액을 제거합니다.
   참고: 가능한 한 빨리 세포가 배지 없이 장기간 보내지 않도록 각 웰의 배지를 교체하십시오. 한 번에 3개의 웰에서 매체를 제거하고 교체하는 것이 좋습니다.
9. 계산된 양의 Lb를 분화된 대식세포를 포함하는 각 웰로 전달합니다.
10. 5% CO₂ 미만에서 37ºC에서 4시간 또는 24시간 동안 세포를 감염시킵니다.
    1. 4시간 후, 대식세포를 실온에서 식염수로 3회 세척하여 내재화되지 않은 기생충을 제거합니다.
    2. 24시간 감염 기간 동안 세척 후 각 웰에 보충된 RPMI 배지 300μL를 첨가한 다음 5% CO₂ 미만에서 37°C에서 20시간 동안 다시 재배양합니다.
11. 제조업체의 지침에 따라 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 염증 매개체를 측정하기 위해 상층액을 제거합니다.
    1. 수집된 상층액을 실온에서 10분 동안 1,800 x g 에서 원심분리합니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 절차는 내재화되지 않은 기생충을 제거하기 위해 수행됩니다. 상등액은 동결되어 향후 분석 시점까지 -80^oC로 유지 될 수 있습니다.
       참고: 세포는 감염률, 기생충 생존력 또는 ROS 생산을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

4. 감염 평가

1. 감염률의 정량화
   1. 상층액을 제거한 후 각 웰에 300μL의 메탄올을 첨가합니다. 커버슬립에 부착된 세포를 고정하는 데 15분 정도 기다립니다.
   2. 웰에서 커버슬립을 제거하고 지지대에 올려 세포 염색 용액(예: Quick Panoptic 2)에 1분 동안 담궈냅니다.
   3. 커버슬립을 세포 염색 용액(예: Quick Panoptic 3)에 두 번 담그고 마를 때까지 기다립니다.
   4. 15μL의 장착 매체(예: Entellan)를 슬라이드에 놓고 매체 위에 커버슬립을 놓습니다.
      알림: 커버슬립에 부착된 모든 대식세포는 장착 매체와 접촉해야 합니다.
   5. 100x 대물렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 무작위로 100개의 세포를 계수하여 감염률과 내재화된 축혈구 수를 정량화합니다.
2. 기생충 생존 능력
   1. 감염 4시간 후 실온에서 식염수로 세포를 3회 세척합니다.
   2. 보충된 Schneider's Insect 배지 300μL를 추가합니다.
   3. 24ºC 인큐베이터에서 배양합니다.
   4. 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 후의 기생충 성장을 정량화합니다.

5. 형광 현미경 검사법에 의한 ROS 생산 평가

1. 감염 기간이 끝나면 상층액을 제거하고 500μL의 식염수로 세포를 씻어냅니다.
2. 각 웰에 300μL의 형광 프로브 시약(예: 5μM의 CellROX Green 시약)을 추가합니다.
3. 37ºC 및 5% CO₂에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
4. 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 셀을 3배 세척합니다.
5. 300μL의 3.7% 포름알데히드로 세포를 고정하고 15분 동안 그대로 둡니다.
   참고: 24시간 이내에 형광 신호를 측정하십시오.
6. 세포 염색을 위해 5μL의 DAPI 염색제(예: DAPI ProLong Gold 퇴색 방지제)를 추가합니다. 대식세포가 포함된 표면이 DAPI 염색제와 직접 접촉하도록 커버슬립을 놓습니다.
7. 485/520 nm의 여기 파장에서 형광 현미경으로 형광 신호를 분석합니다.
8. ImageJ를 사용하여 각 커버슬립에 대해 30개 세포에서 CTCF(Corrected Total Cell Fluorescence)를 계산합니다.
   CTCF = Integrated Density (선택된 세포의 면적 x 배경 판독값의 평균 형광)

6. 통계 분석

1. Mann-Whitney 검정을 사용하여 쌍을 이루지 않은 표본이 있는 두 그룹을 비교합니다. GraphPad Prism 7.0을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. p 가 0.05일 때 통계적으로 유의< 차이를 고려합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

기생충과 숙주 세포의 상호 작용에 대한 이해는 여러 질병의 발병기전과 관련된 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 배양된 인간 세포는 세포 계통에 비해 세포 배양의 한계로 인해 덜 사용되지만, 여기에 제시된 프로토콜은 인간 대식세포의 강력하고 재현 가능한 분화를 보여줍니다. 이 프로토콜을 통해 염증 매개체 생성부터 인간 대식세포의 감염원에 대한 감수성에 이...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

인간 단핵구가 대식세포로 분화된 후 L. braziliensis 의 두 균주에 감염되기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 기생충-세포 상호 작용의 여러 측면을 평가할 수 있도록 합니다. 이러한 도구는 CL에 대한 답이 없는 질문을 해명하는 데 중요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 확립으로 우리 그룹은 당뇨병 및 CL¹⁴가 있는 개인으로부터 얻은 대식세포의 면역 반...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1100
Cell Culture Flask 25 cm²	SPL	70125
CellROX Green Reagent	Invitrogen	C10444
Coverslip circles 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306
Disposable support for blood collection	BD Vacutainer	364815
Eclipse blood collection needle 21 g x 1.25 in	BD Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Falcon Conical Tubes, 15 mL	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mL	StemCell Technologies	100-0090
Fetal Bovine Serum	Gibco	A4766801
Formaldehyde 3.7%	Merck	252549
Glass slide  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Human IL-6 ELISA Kit	RD	DY206
Human M-CSF Recombinant Protein	PeproTech	300-25
Human TNF-a ELISA Kit	RD	DY210
Leukotriene B4 ELISA Kit	Cayman	520111
Methanol	Merck	MX0482
Penilicin-Sreptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher	10378-016
Phosphate Buffered Saline pH 7.2 (10x)	Gibco	70013032
Plasma tube, 158 USP units of sodium heparin (spray coated)	BD Vacutainer	367874
Quick H&E Staining Kit (Hematoxylin and Eosin)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Schneider's Insect Medium	Sigma Aldrich	S0146
Tissue Culture 24-wells Plate	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061