Получение макрофагов из моноцитов человека для оценки скорости инфицирования Leishmania braziliensis и врожденного иммунного ответа хозяина

Резюме

Этот протокол описывает процесс получения макрофагов человека из моноцитов для инфицирования Leishmania braziliensis. Это также позволяет исследователям оценивать частоту инфекции и жизнеспособность паразитов, продукцию АФК с помощью флуоресцентной микроскопии и выработку медиаторов воспаления в надосадочной жидкости культуры для изучения реакции макрофагов на инфекцию.

Аннотация

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для функционирования иммунной системы, и основной клеткой-хозяином при инфекции Leishmania braziliensis (Lb). Эти клетки специализируются на распознавании микроорганизмов и фагоцитозе, но также активируют другие иммунные клетки и присутствующие антигены, а также способствуют воспалению и восстановлению тканей. В этой статье мы описываем протокол получения мононуклеарных клеток из периферической крови (PBMC) здоровых доноров для разделения моноцитов, которые затем дифференцируются в макрофаги. Затем эти клетки могут быть инфицированы in vitro в различных концентрациях Lb для оценки способности контролировать инфекцию, а также для оценки иммунного ответа клетки-хозяина, который может быть измерен несколькими методами. PBMC сначала выделяли центрифугированием с градиентом Фиколла-Гипака, а затем покрывали пластинами, чтобы моноциты могли прилипать к культуральным планшетам; Неадгезивные клетки удаляли путем промывки. Затем адгезивные клетки культивировали макрофагально-колониестимулирующим фактором (M-CSF) в течение 7 дней для индуцирования дифференцировки макрофагов. Мы предлагаем наносить 2 x 10⁶ клеток на лунку на 24-луночные планшеты с целью получения 2 x 10⁵ макрофагов. Полностью дифференцированные макрофаги могут быть инфицированы Lb в течение 4 или 24 часов. Этот протокол приводит к значительному проценту инфицированных клеток, который можно оценить с помощью оптической или флуоресцентной микроскопии. Помимо индекса заражения, паразитарную нагрузку можно измерить, подсчитав количество паразитов внутри каждой клетки. Дальнейшие молекулярные и функциональные анализы также могут быть выполнены в культуральных надосадочных зонтах или внутри самих макрофагов, что позволяет применять этот протокол в различных контекстах, а также адаптировать к другим внутриклеточным видам паразитов.

Введение

Внутриклеточный простейший паразит рода Leishmania является возбудителем забытого комплекса заболеваний, известного как лейшманиоз¹. Эти тропические болезни имеют широкий спектр клинических проявлений, которые могут варьироваться от поражений кожи до осложнений, возникающих в результате висцеральной формы заболевания, которые при отсутствии лечения могут привести к летальному исходу. Кожный лейшманиоз (КЛ) является наиболее частой формой лейшманиоза и характеризуется одним или несколькими изъязвленными поражениями кожи с обострением хронического воспаления². Развитие заболевания зависит от вида Leishmania, в дополнение к комбинации факторов, связанных с иммунным ответом хозяина, которые определяют клинические исходы ^3,4. Leishmania braziliensis является основным видом, вызывающим CL в Бразилии, при этом случаи зарегистрированы во всех штатах страны⁵. Иммунный ответ против L. braziliensis считается защитным, поскольку он ограничивает паразита до места инокуляции, и включает несколько типов иммунных клеток, таких как макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты ^4,6,7.

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для иммунной системы, поскольку они специализируются на обнаружении и фагоцитозе микроорганизмов, а также могут представлять антигены и активировать другие типы клеток. Макрофаги способны регулировать процессы от воспаления до восстановления тканей и поддержания гомеостаза ^8,9. Эти клетки играют важную роль в раннем иммунном ответе против внутриклеточных паразитов, таких как Leishmania, что важно для их уничтожения 10,11,12.

Во время инфекции L. braziliensis макрофаги могут реагировать с помощью различных механизмов элиминации паразита, таких как производство активных форм кислорода (АФК) и медиаторов воспаления^13,14. Иммунные реакции могут определяться выработкой провоспалительных или противовоспалительных цитокинов, которые способствуют обострению воспалительного состояния или процессам восстановления тканей ^6,15,16. Пластичность макрофагов имеет основополагающее значение для иммунопатогенеза КЛ, а также для взаимодействия паразита и хозяина, и эти клетки считаются критически важными для выяснения механизмов заболевания и разработки новых терапевтических подходов.

Поскольку ХЛ является сложным заболеванием, исследования требуют от исследователей изучения типов клеток, которые имитируют те, которые обнаружены у человека. Иммунные реакции, наблюдаемые в различных экспериментальных моделях, могут варьироваться и давать результаты, которые не отражают иммунный ответ, наблюдаемый у естественно инфицированных людей. Таким образом, представленный здесь протокол был разработан для изучения макрофагов человека и их иммунных реакций во время КЛ, вызванных L. braziliensis.

протокол

Институциональный наблюдательный совет по этике в исследованиях человека при Институте Гонсалу Мониша (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Сальвадор, Баия-Бразилия) одобрил это исследование (номер протокола: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Изоляция МПМП человека

1. Убедитесь, что образцы крови, градиент плотности 1,077 г/мл (например, Ficoll-Histopaque) и солевой раствор имеют комнатную температуру.
2. Образцы крови разбавляют физиологическим раствором в соотношении 1:1.
3. Перенесите 10-12 мл градиента плотности в пробирки объемом 50 мл.
4. Осторожно наложите до 40 мл разбавленной крови на градиент плотности. Отделите слои градиента крови и плотности.
5. Первое центрифугирование: центрифужные пробирки, содержащие слои крови и градиента плотности при 400 x g в течение 30 мин при 24 ºC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите тормоз перед запуском центрифуги.
6. Удалите плазму над кольцом PBMC с помощью пипетки (охристый слой оболочки расположен между плазмой и слоями градиента плотности; ниже него находятся эритроциты/гранулы гранул гранул эритроцитов).
7. Перенесите облачный слой PBMC (слой охристого покрытия) с помощью пипетки в пробирку объемом 15 мл и заполните холодным физиологическим раствором (храните на льду или при температуре 4 °C).
8. Второе центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 300 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
10. Третье центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 250 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
11. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
12. Четвертое центрифугирование: центрифугирование пробирки при давлении 200 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
13. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл холодной среды RPMI.
14. Подсчитайте ячейки, чтобы определить количество полученных ячеек.

2. Дифференцировка в макрофаги человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-луночного планшета рассчитайте общее количество клеток, необходимое для планшета 2 x 10⁶ клеток на лунку, что даст 2 x 10⁵ макрофагов. Этот выход основан на среднем 10% моноцитов в крови человека. В качестве альтернативы, моноциты также могут быть высвобождены неферментативными методами, а затем подсчитаны для осаждения.

1. На 24-луночную пластину поместите на дно каждой лунки круглые стеклянные покровные стекла диаметром 13 мм. Наложите эквивалент 2×10⁶ клеток в 1 мл РПМИ неполного состава на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте количество клеток в каждой лунке, так как завышенное количество может препятствовать адгезии клеток и поставить под угрозу культивирование. Кроме того, все покровные стекла должны быть чистыми и стерильными.
2. Инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 ºC при 5%_CO2 для адгезии клеток.
3. Удалите надосадочную жидкость и промойте один раз 0,9% физиологическим раствором при комнатной температуре, чтобы удалить любые неадгезивные клетки.
4. После промывания удалите физиологический раствор и добавьте в каждую лунку 250 μл дополненной среды RPMI комнатной температуры (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина и 50 нг/мл M-CSF).
5. Инкубируйте клетки в течение 7 дней при 37 ºC при 5%_CO2.
   1. Добавляйте 125 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку каждые два дня. В конце дифференцировки клеток конечный объем составит 500 мкл на лунку.
   2. Чтобы проанализировать жизнеспособность клеток, параллельно проведите еще одну культуру на 96-луночном планшете (2 x 10⁵ на лунку).
   3. После дифференцировки в макрофаги (7 дней) добавьте 20 мкл реагента AlamarBlue.
   4. Через 7 часов инкубации считывают показания планшетов на спектрофотометре на длинах волн 570 нм и 600 нм.

3. Бактериологическое исследование и инфекция лейшмании

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе использовались промастиготы L. braziliensis из двух разных штаммов (MHOM/BR/01/BA788 и MHOM/BR88/BA-3456).

1. Подсчитайте Lb паразитов и рассчитайте объем, чтобы получить 5 x 10⁵/мл паразитов.
2. Приготовьте с добавок среду Schneider's Insect (10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
3. Инкубировать паразитов в общем объеме 5 мл в инкубаторе с температурой 24 ºC до достижения стационарной фазы (от 4 до 6 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитывайте паразитов каждый день, чтобы оценить рост.
4. После достижения стационарной фазы центрифугируйте культуры Leishmania при 100 x g в течение 10 минут при 4 ºC, чтобы удалить всех мертвых паразитов (осажденных на дне пробирки).
5. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугуйте при давлении 1 800 x g в течение 10 минут при 4 ºC для извлечения жизнеспособных паразитов. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл добавленной среды RPMI для подсчета паразитов.
7. Рассчитайте количество паразитов, чтобы получить соотношение паразит:клетка 10:1. Перенесите паразитов в культуральные планшеты, содержащие макрофаги, предварительно культивированные в дополненной среде RPMI (~300 мкл/лунка) при комнатной температуре.
8. Удалите надосадочную жидкость из каждой лунки, содержащей дифференцированные макрофаги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно скорее замените среду в каждой лунке, чтобы клетки не проводили длительные периоды без среды. Мы предлагаем удалять и заменять среду в трех лунках за один раз.
9. Перенесите рассчитанное количество Lb в каждую лунку, содержащую дифференцированные макрофаги.
10. Заражайте клетки в течение 4 или 24 часов при температуре 37 ºC при 5%_CO2.
    1. Через 4 часа промойте макрофаги 3 раза физиологическим раствором комнатной температуры, чтобы удалить любых неинтернализованных паразитов.
    2. В течение 24-часового периода заражения добавьте по 300 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку после промывки, а затем повторно инкубируйте еще 20 часов при 37 °C при 5%_CO2.
11. Удалите надосадочную жидкость для измерения медиаторов воспаления с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), следуя инструкциям производителя.
    1. Собранную надосадочную жидкость центрифугировать при 1800 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Эта процедура проводится для удаления любых неинтернализованных паразитов. Надосадочная жидкость может быть заморожена и храниться при температуре -80^°C до момента проведения будущего анализа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть использованы для оценки уровня инфекции, жизнеспособности паразитов или продукции АФК.

4. Оценка инфекции

1. Количественная оценка уровня инфицирования
   1. Добавьте по 300 мкл метанола в каждую лунку после удаления надосадочной жидкости. Дайте 15 минут закрепить ячейки, прилипшие к покровным стеклам.
   2. Снимите покровные стекла с лунок и положите на подставку, чтобы замочить в растворе для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 2) на 1 минуту.
   3. Дважды погрузите покровные стекла в раствор для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 3) и подождите, пока они высохнут.
   4. Поместите 15 μL монтажного носителя (например, Entellan) на предметные стекла, а затем наденьте на носитель покровные стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все макрофаги, прикрепленные к покровным стеклам, должны находиться в контакте с монтажной средой.
   5. Подсчитайте 100 клеток случайным образом под оптическим микроскопом с помощью 100-кратного объектива, чтобы количественно оценить скорость инфицирования и количество интернализованных амастиготов.
2. Жизнеспособность паразитов
   1. Через 4 часа заражения промойте клетки физиологическим раствором комнатной температуры 3 раза.
   2. Добавьте 300 мкл добавленной среды Schneider's Insect.
   3. Инкубируйте в инкубаторе с температурой 24 ºC.
   4. Количественно оценивайте рост паразитов через 48, 72, 96 и 120 часов.

5. Оценка продукции АФК методом флуоресцентной микроскопии

1. После периода заражения удалите надосадочную жидкость и промойте клетки 500 мкл физиологического раствора.
2. Добавьте в каждую лунку по 300 мкл реагента флуорогенного зонда (например, зеленого реагента CellROX в концентрации 5 мкМ).
3. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 ºC и 5%_CO2.
4. Промойте ячейки 3 раза 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
5. Зафиксируйте клетки 300 мкл 3,7% формальдегида и оставьте на 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте сигнал цветения в течение 24 часов.
6. Добавьте 5 μЛ окрашивающего агента DAPI (например, DAPI ProLong Gold antifade) для окрашивания клеток. Поместите покровное стекло с поверхностью, содержащей макрофаги, в непосредственный контакт с красителем DAPI.
7. Анализ сигнала флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопии на длине волны возбуждения 485/520 нм.
8. Рассчитайте скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF) по 30 ячейкам для каждого покровного стекла с помощью ImageJ.
   CTCF = Интегрированная плотность (Площадь выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний)

6. Статистический анализ

1. Используйте тест Манна-Уитни для сравнения двух групп с непарными выборками. Выполняйте статистический анализ с помощью GraphPad Prism 7.0. Учитывайте статистически значимые различия при p < 0,05.

Результаты

Понимание взаимодействия паразитов и клеток хозяина имеет решающее значение для выяснения механизмов, участвующих в патогенезе некоторых заболеваний. Несмотря на то, что культивируемые клетки человека используются реже из-за ограничений клеточной культуры по срав?...

Обсуждение

Представленный в данной работе протокол дифференцировки моноцитов человека в макрофаги с последующим заражением двумя штаммами L. braziliensis позволяет оценить несколько аспектов взаимодействия паразита с клеткой. Эти инструменты могут иметь решающее значение для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1100
Cell Culture Flask 25 cm²	SPL	70125
CellROX Green Reagent	Invitrogen	C10444
Coverslip circles 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306
Disposable support for blood collection	BD Vacutainer	364815
Eclipse blood collection needle 21 g x 1.25 in	BD Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Falcon Conical Tubes, 15 mL	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mL	StemCell Technologies	100-0090
Fetal Bovine Serum	Gibco	A4766801
Formaldehyde 3.7%	Merck	252549
Glass slide  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Human IL-6 ELISA Kit	RD	DY206
Human M-CSF Recombinant Protein	PeproTech	300-25
Human TNF-a ELISA Kit	RD	DY210
Leukotriene B4 ELISA Kit	Cayman	520111
Methanol	Merck	MX0482
Penilicin-Sreptomycin-Glutamine (100x)	ThermoFisher	10378-016
Phosphate Buffered Saline pH 7.2 (10x)	Gibco	70013032
Plasma tube, 158 USP units of sodium heparin (spray coated)	BD Vacutainer	367874
Quick H&E Staining Kit (Hematoxylin and Eosin)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Schneider's Insect Medium	Sigma Aldrich	S0146
Tissue Culture 24-wells Plate	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061