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  • Introducción
  • Protocolo
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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo presenta la preparación de diapositivas y la puntuación automatizada del ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica. Para ilustrar el método y la sensibilidad del ensayo, se irradiaron linfocitos aislados in vitro. Este método automatizado de detección de ADN DSB es útil para aplicaciones de dosimetría biológica rápidas y de alto rendimiento.

Resumen

La radiación ionizante es un potente inductor del daño al ADN y un carcinógeno bien documentado. La dosimetría biológica comprende la detección de los efectos biológicos inducidos por la exposición a la radiación ionizante para realizar una evaluación individual de la dosis. Esto es pertinente en el marco de las emergencias radiológicas, donde las evaluaciones de salud y la planificación del tratamiento clínico para las víctimas expuestas son críticas. Dado que las roturas de doble cadena de ADN (DSB) se consideran la forma más letal de daño al ADN inducido por la radiación, este protocolo presenta un método para detectar DSB de ADN en muestras de sangre. La metodología se basa en la detección de una proteína de reparación de ADN fosforilada marcada con fluorescentes, a saber, γ-H2AX. El uso de una plataforma de microscopía automatizada para puntuar el número de focos γ-H2AX por célula permite un análisis estandarizado con una disminución significativa en el tiempo de respuesta. Por lo tanto, el ensayo γ-H2AX tiene el potencial de ser uno de los ensayos más rápidos y sensibles para la dosimetría biológica. En este protocolo, las muestras de sangre total de voluntarios adultos sanos se procesarán e irradiarán in vitro para ilustrar el uso del ensayo automatizado y sensible de focos γ-H2AX para aplicaciones de biodosimetría. Se utiliza un sistema automatizado de escaneo de diapositivas y una plataforma de análisis con un microscopio de fluorescencia integrado, que permite la puntuación rápida y automática de DNA DSB con un grado reducido de sesgo.

Introducción

Desde su descubrimiento, la radiación ionizante (RI) se ha convertido en una herramienta indispensable en las prácticas médicas e industriales actuales, así como en aplicaciones agrícolas y militares. Sin embargo, el amplio uso de IR también aumenta el riesgo de sobreexposición a la radiación tanto para los trabajadores profesionales de radiación como para los miembros del público. La RI es un carcinógeno físico bien conocido que puede inducir daño al ADN de manera directa o indirecta, lo que lleva a riesgos significativos para la salud 1,2. Por lo tanto, es importante realizar una evaluación de la dosis, ya que el grado de exposición constituye un paso inicial importante en el manejo del accidente de radiación 1.

En caso de emergencias nucleares o radiológicas a gran escala, el número de evaluaciones de dosis que deben realizarse puede variar de unas pocas a miles de personas dependiendo del tamaño del accidente3. En estos escenarios, la dosimetría física también puede ser ambigua (por ejemplo, si el dosímetro no se usa correctamente) o no disponible, cuando los miembros del público están involucrados. Si bien los síntomas clínicos podrían usarse para el triaje, no son necesariamente específicos de la radiación y pueden resultar en un diagnóstico falso. Por lo tanto, es aconsejable utilizar la dosimetría biológica junto con la dosimetría física y las evaluaciones clínicas. Este método permite el análisis de los cambios inducidos por la radiación a nivel celular y permite la identificación inequívoca de los individuos expuestos que requieren tratamiento médico4. El médico puede entonces utilizar esta evaluación biológica de la dosis para complementar las reconstrucciones de la dosis física y otros diagnósticos clínicos, con el fin de prescribir la atención médica adecuada5. La necesidad de dosimetría biológica será especialmente alta para el triaje y el manejo médico de las víctimas cuando el escenario de exposición no sea bien conocido y cuando las víctimas sean miembros del público. El objetivo principal del triaje es distinguir eficazmente a las personas "preocupadas bien", que podrían tener síntomas prodrómicos pero que no recibieron una dosis alta, de las personas expuestas que necesitan ayuda médica inmediata y atención especializada. El nivel umbral de dosis de radiación que puede causar enfermedad por radiación es de aproximadamente 0,75 a 1,00 Gy. Entonces, aquellos individuos que reciben > 2 Gy de exposición tienen un mayor riesgo de síndrome de radiación aguda y deben recibir tratamiento médico inmediato6,7. Las estimaciones oportunas y precisas de la dosis biológica para las víctimas atrapadas en el fuego cruzado de tales desastres son críticas. Además, también puede consolar y tranquilizar a las víctimas mínimamente expuestas8.

Las autoridades de protección radiológica utilizan diversos marcadores de biodosimetría, que se basan principalmente en la detección de daño citogenético, como cromosomas dinátricos o micronúcleos, en linfocitos humanos cultivados9. La detección del daño citogenético también se puede realizar mediante el ensayo de translocación de hibridación fluorescente in situ (FISH)10. Sin embargo, el principal inconveniente de los métodos citogenéticos convencionales es el largo tiempo de respuesta para obtener los resultados en una situación de emergencia8.

Uno de los primeros pasos en el proceso de reconocimiento de ADN DSB es la fosforilación de la variante de histona H2AX, lo que lleva a la formación de γ-H2AX, y el posterior reclutamiento de factores de reparación. Durante la última década, la detección de focos de γ-H2AX inducidos por radiación en linfocitos de sangre periférica mediante microscopía de inmunofluorescencia ha recibido una creciente atención como una herramienta de dosimetría biológica confiable11,12,13,14,15. Dependiendo de la calidad de la radiación y el tipo de célula, el rendimiento máximo de los focos de γ-H2AX se detecta dentro de 0.5 - 1 hora después de la irradiación16,17. Se prevé que existe una estrecha correlación entre el número de focos de ADN DSB y γ-H2AX, así como entre la desaparición de focos y la reparación de DSB. Los experimentos de tijera láser con una microbiana láser pulsada han demostrado que los focos γ-H2AX se localizan en los sitios de ADN DSB18. Si bien sigue siendo un tema de debate activo, uno de los primeros estudios con 125sugerí una correlación uno a uno entre el número calculado de desintegraciones por célula (representable para el número de ADN DSB inducido por radiación) y el número de focos γ-H2AX que se calificó19,20.

Durante la última década, la Unión Europea financió los proyectos MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radiological casualties) y RENEB (Realizing the European Network of Biodosimetry) para crear una red sostenible en dosimetría biológica y retrospectiva.21,22. Este proyecto incluyó varios laboratorios en toda Europa para evaluar las capacidades de respuesta a emergencias en caso de una emergencia radiológica.14,21,22. El ensayo de focos γ-H2AX tiene una serie de ventajas considerables, como un tiempo de procesamiento rápido, el potencial de procesamiento por lotes que permite un alto rendimiento, así como su alta sensibilidad si se usa dentro de unas pocas horas después de la exposición.13,23,24. La alta sensibilidad del ensayo en el rango de dosis bajas dio lugar a una serie de estudios en los que se utilizó el ensayo de focos γ-H2AX como indicador del efecto de la exposición a la radiación médica, tanto en radioterapia como en aplicaciones de diagnóstico por imágenes.25,26,27,28,29,30. Estas características hacen que el ensayo de focos γ-H2AX sea una alternativa altamente competitiva a otros métodos para el triaje temprano en grandes accidentes nucleares para separar a los individuos críticamente expuestos de los de bajo riesgo. Varios experimentos de optimización han ilustrado que es factible realizar el ensayo de focos γ-H2AX con pequeños volúmenes de sangre, como el estudio de Moquet et al. que informaron que es factible realizar el ensayo de focos γ-H2AX con solo una gota de sangre (pinchazo en el dedo)31. Un enfoque similar se utilizó en el desarrollo del sistema RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool) de alto rendimiento totalmente automatizado que se optimizó para medir los rendimientos de γ-H2AX a partir de muestras de sangre derivadas de punciones en los dedos.32,33. En general, los resultados de los estudios de intercomparación MULTIBIODOSA y RENEB sugieren que el ensayo de focos γ-H2AX podría ser una herramienta de triaje muy útil después de una exposición reciente (hasta 24 horas) a la radiación aguda12,13,14. En un estudio de intercomparación de rango de dosis bajas, se pudo distinguir una dosis tan baja como 10 mGy de las muestras de control irradiadas simuladamente, destacando la sensibilidad del ensayo en el rango de dosis bajas.34. Es importante tener en cuenta que la alta sensibilidad del ensayo es particularmente cierta para los linfocitos, lo que los convierte en uno de los tipos de células más adecuados para la evaluación de exposiciones a dosis bajas. Los linfocitos son principalmente células no ciclativas y representan una población sincrónica. Este último evita la expresión de γ-H2AX se asocia con la replicación del ADN, lo que reduce significativamente la sensibilidad del ensayo para detectar DSB inducida por radiación durante la fase G2 y S del ciclo celular.35. Además de su sensibilidad a dosis bajas para linfocitos, el tiempo de respuesta del ensayo de focos γ-H2AX es significativamente más rápido que las técnicas citogenéticas como el ensayo de plántricos y micronúcleos, ya que no requiere la estimulación de linfocitos. Por lo tanto, los resultados se pueden obtener en unas pocas horas en comparación con un par de días para las técnicas citogenéticas. Un inconveniente importante del ensayo es la rápida desaparición de la señal de focos γ-H2AX, que normalmente se reducirá a niveles basales dentro de los días posteriores a la exposición a la radiación, dependiendo de la cinética de reparación del ADN.36. Por lo tanto, la aplicación más adecuada del ensayo en un contexto de biodosimetría es para fines de triaje inicial y para priorizar un seguimiento de dosimetría biológica citogenética que consume más tiempo para ciertas víctimas. Sin embargo, para una biodosimetría retrospectiva precisa y efectos a largo plazo, uno tiene que confiar en técnicas citogenéticas como los análisis FISH de tres colores para la detección de aberraciones cromosómicas estables en caso de que la exposición tuviera lugar hace varios años.10.

Como parte de varias iniciativas de biodosimetría, se han evaluado múltiples ensayos con fines de triaje junto con el ensayo de focos γ-H2AX para clasificar a las personas en emergencias radiológicas a gran escala; como el ensayo de dicentría, el ensayo de micronúcleos de bloqueo de citocinesis, la resonancia paramagnética electrónica (EPR), el ensayo de proteína sérica (SPA), el ensayo de manchas de piel (SSA), la luminiscencia estimulada ópticamente (OSL), así como el análisis de expresión génica 37,38. El ensayo de focos γ-H2AX se puede utilizar cuantitativamente para la evaluación de la formación y reparación de DSB de ADN39. Sin embargo, el ensayo depende del tiempo, ya que el nivel de γ focos H2AX varía con el tiempo después de la irradiación debido a la cinética de reparación del ADN DSB40. Un estudio comparativo ilustró que la puntuación microscópica con capacidad de etapa z ofrece los resultados más precisos después de 1 Gy de irradiación, mientras que la citometría de flujo solo da resultados confiables a dosis más altas de IR41. Hay muchos informes del desarrollo de soluciones de análisis de imágenes para su uso en puntuación automatizada42,43,44,45,46. En este protocolo, se utiliza una plataforma de microscopía fluorescente automatizada y de alto rendimiento para analizar los focos de γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica. El uso de un sistema de puntuación automático evita tanto el sesgo de puntuación entre laboratorios como entre observadores, mientras que aún permite una sensibilidad suficiente para detectar dosis inferiores a 1 Gy47. La principal ventaja de este sistema en comparación con el software gratuito de código abierto para la puntuación de focos es el hecho de que el proceso completo desde el escaneo de diapositivas hasta la captura y puntuación está automatizado. El concepto de clasificadores definibles y almacenables por el usuario garantiza la reproducibilidad que agrega un grado de calidad imparcial a los resultados. Por lo tanto, este trabajo ilustra cómo se pueden obtener resultados de focos γ-H2AX utilizando un método automatizado de escaneo microscópico y puntuación que se puede utilizar cuando los laboratorios de radiobiología reciben muestras de sangre de individuos potencialmente sobreexpuestos con fines de dosimetría biológica.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Biomédica del Comité de Ética de la Universidad de Western Cape - Código BM18/6/12.

1. Preparación de soluciones48

  1. Solución de fijación celular (3% de PFA en PBS)
    1. Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado y, trabajando en una campana extractora, agregue 20 g de paraformaldehído a 200 ml de H2O destilado. Caliente la mezcla a 60 ° C para ayudar a la disolución.
    2. Una vez disuelto el PFA, añadir 40 gotas de 5 N NaOH con cuidado durante 30 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Ajustar a pH 7 usando 1 M HCl y hacer hasta un volumen final de 250 mL con H2O destilado (las alícuotas se pueden almacenar a -20 °C durante 1 año). Agregue 25 ml de esta solución a 41,7 ml de PBS para obtener una solución de PFA al 3%.
  2. Solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1%: Agregue 10 g de BSA a 1000 ml de PBS y mezcle hasta que se disuelva. Conservar a 4 °C hasta su uso (máximo 72 horas).
  3. Solución de Triton-X en una concentración de 1:500: Añadir 1 μL de Triton-X a 500 μL de PBS, conservar a 4 °C hasta su uso (máximo 24 horas).
  4. Soluciones de anticuerpos
    1. Anticuerpo primario - Anti-γ-H2AX en concentración de 1:500: Añadir 1 μL de anti-γ-H2AX a 500 μL de solución de BSA al 1%, conservar a 4 °C hasta su uso (máximo 24 horas).
    2. Anticuerpo secundario - DAM-TRITC en concentración de 1:1000: Añadir 1 μL de DAM-TRITC a 1000 μL de solución de BSA al 1%, conservar a 4 °C hasta su uso (máximo 24 horas).
  5. Medios completos del Roswell Park Memorial Institute (cRPMI)
    1. Agregue el suero fetal bovino (FBS) filtrado y la penicilina-estreptomicina a los medios RPMI 1640 en un frasco estéril para dar una concentración final de 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.

2. Preparación de muestras

NOTA: Para este protocolo, las muestras de sangre total periférica se recolectan por venopunción en tubos de recolección de litio-heparina de voluntarios adultos sanos (con consentimiento informado - BM18/6/12 Comité de Ética de Investigación Biomédica del Comité de Ética de la Universidad de Western Cape). Antes de comenzar, asegúrese de que la sangre y el medio de densidad de 1.077 g / ml estén aclimatados a temperatura ambiente.

  1. En un gabinete de bioseguridad preparado, diluya la sangre total periférica en un volumen 1: 1 con PBS y coloque suavemente la sangre diluida en un volumen igual a dos volúmenes de medio con una densidad de 1.077 g / ml. Es importante colocar gradualmente la sangre en capas sobre el medio de densidad manteniendo el tubo inclinado a 45 °, asegurando que la sangre y el medio de densidad no se mezclen.
  2. Transfiera con cuidado la suspensión a una centrífuga y gire a 900 x g durante 20 minutos. A partir de entonces, pipetee la capa "turbia" solo a un nuevo tubo cónico estéril y llene el tubo con PBS y centrífuga durante 10 minutos a 1000 x g. A partir de entonces, aspire el sobrenadante con una pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet, resuspenda el pellet PBMC cuidadosamente en 1 mL PBS y llene el tubo con PBS.
  3. Repita el paso de lavado anterior dos veces más para llegar a un total de tres lavados.
  4. Contar el número de PBMC utilizando un hemocitómetro, consciente de que cada ml de sangre periférica de un donante adulto dará como resultado un promedio aproximado de 1 - 1.5 x 106 PBMC49. Después de contar, diluya el pellet de PBMC a una concentración de 8 x10 5 linfocitos en 1 ml de cRPMI. Luego agregue aproximadamente 2 x 106 PBMC o 2.5 ml de la solución aislada de PBMC en un tubo cónico estéril para irradiaciones.

3. Irradiaciones de muestra

PRECAUCIÓN: Manipule la unidad de radiación de acuerdo con las pautas de protección contra la radiación y use un dosímetro físico en todo momento. Asegúrese de que el sistema de irradiación utilizado esté calibrado y configurado de tal manera que se alcancen las dosis esperadas correctas.

  1. Irradia PBMC a temperatura ambiente utilizando una fuente de 60Co. Calibrar (protocolo TRS-398) con una cámara Farmer 117 para la cual se obtiene un factor de calibración de cámara del Instituto Nacional de Metrología de Sudáfrica (NMISA)50.
    1. Para este ensayo, coloque los tubos cónicos entre una lámina acrílica de 5 mm (utilizada para la acumulación de entrada de vigas) y un material de retrodispersión de 50 mm con la tasa de dosis actual de 60Co de 0,57 Gy/min para un tamaño de campo homogéneo de 300 mm × 300 mm a una distancia de fuente a superficie de 750 mm.
  2. Irradiar los PBMC con dosis graduadas de 0.125, 0.500, 1.000, 1.500 y 2.000 Gy, y mantener las muestras de control irradiadas simuladamente, en la sala de control, recibiendo solo exposición a la radiación ambiental.
  3. Incubar las muestras irradiadas durante 1 hora a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 para alcanzar el número máximo de focos γ-H2AX.
    NOTA: El tiempo de incubación se puede modificar de acuerdo con el diseño experimental.

4. Preparación de diapositivas

NOTA: Consulte la Figura 1 para la configuración de diapositivas.

  1. Preparar 3 portaobjetos (repeticiones técnicas) utilizando portaobjetos recubiertos con una superficie cargada positivamente para mejorar la adherencia por condición de irradiación (o por tubo cónico). Coloque la diapositiva en el soporte del clip, agregue la tarjeta de filtro encima de ella y, finalmente, el embudo. Asegure los clips deslizantes y colóquelos en la citocentrífuga.
  2. Añadir 250 μL de la suspensión celular al embudo (200.000 células/diapositiva) y girar durante 30 x g durante 5 minutos utilizando una citocentrífuga.
  3. Después de la citocentrifugación, retire la diapositiva del soporte del clip y, con una pluma hidrofóbica, dibuje un círculo alrededor del punto con las células para retener la tinción inmunofluorescente en las células unidas durante el proceso de tinción.

5. Fijación e inmunofluorescencia γ-H2AX

NOTA: Todas las soluciones se agregan cuidadosamente directamente sobre el área de la célula que está marcada por un círculo hidrofóbico. Las soluciones de tinción se dispensan ligeramente por encima de la corredera sin permitir que la punta de la pipeta interrumpa las células. Las soluciones NO se agregan a toda la diapositiva.

  1. Fije las diapositivas en PFA al 3% recién preparado durante 20 minutos.
    NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar en PBS que contiene 0.5% de PFA a 4 ° C durante un máximo de 2 días antes de realizar la inmunotinción. A continuación, lave los portaobjetos en un frasco de Coplin con PBS durante 5 minutos, luego cubra las células con 100 μL de la solución fría de Triton-X durante 10 minutos para permitir la permeabilización.
  2. Coloque la solución Triton-X en papel de seda y lave las diapositivas tres veces en una solución de BSA al 1% durante 10 minutos. Esto se hace para prevenir el fondo no deseado mediante el bloqueo de la unión de anticuerpos inespecíficos.
  3. Incubar portaobjetos a temperatura ambiente con 100 μL del anticuerpo primario anti-γ-H2AX diluido 1:500 durante 1 hora en una cámara humidificadora, lo que se logra fácilmente agregando papel de seda húmedo en la base de una caja de almacenamiento de diapositivas rectangular.
    1. Coloque la solución de anticuerpos en papel de seda y realice tres lavados con solución de BSA al 1% durante 10 minutos en un frasco de Coplin para eliminar el anticuerpo primario no unido y evitar la unión inespecífica del anticuerpo secundario.
  4. Incubar portaobjetos con 100 μL de la solución secundaria de anticuerpos DAM-TRITC diluida 1:1000 durante 1 hora en la cámara humidificadora. Coloque la solución de anticuerpos en papel de seda y lave los portaobjetos en PBS durante 10 minutos tres veces.
  5. Finalmente seque los toboganes fuera del círculo hidrófobo con papel de seda suave y libre de polvo y agregue 1-2 gotas de DAPI resueltas en un medio de montaje acuoso y cubra suavemente la diapositiva con un deslizamiento de cubierta de 24 x 50 mm, asegurándose de que no haya burbujas de aire atrapadas y colóquelas en el refrigerador a 4 ° C durante la noche. Las diapositivas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas antes del escaneo.

6. Escaneo automatizado y puntuación de diapositivas

NOTA: El sistema de escaneo debe tener un microscopio fluorescente, una cámara CCD (dispositivo acoplado cargado) de alta resolución conectada a un capturador de fotogramas para la digitalización en tiempo real de imágenes de video, una etapa de escaneo, trackball para movimientos manuales, mouse 3D, PC y monitor rápidos, y disco duro para archivar(Figura 2).

  1. Configuración del clasificador
    NOTA: El clasificador es un conjunto de parámetros que definen cómo el sistema detecta las celdas. Es el resultado de la capacitación basada en campos de imagen preclasificados. Un clasificador es específico para un aumento de microscopio, tipo de célula y laboratorio. Por lo tanto, los clasificadores pueden requerir modificaciones en los siguientes parámetros para adaptarlos a las condiciones actuales. Se recomienda probar la configuración con una diapositiva de referencia antes de la evaluación.
    1. Adquisición de imágenes: Utilice un objetivo seco 40x para la obtención de imágenes. Para lograr una calidad de imagen comparable en todas las celdas, establezca el tiempo de integración de la cámara en modo automático. Establezca el tiempo máximo de integración en al menos 1 segundo para ambos canales de color (ganancia de cámara 4.0). El canal de señal se adquiere con 10 planos de enfoque y 14/40 μm entre los planos.
    2. Selección celular: Se detectan PBMC dentro de un rango de 20.00μm 2 y 76.00μm 2. Establezca la profundidad máxima de concavidad en 0,05 y la relación de aspecto máxima en 1,4. Establezca el umbral de nivel de gris relativo en 20%.
    3. Procesamiento celular: Procese el canal de contratinción DAPI con un algoritmo máximo de histograma para reducir el fondo. El canal de señal se procesa con un filtro TopHat (fuerza 7, factor de suavizado 0) para reducir el fondo y mejorar las señales.
    4. Conteo de señales: cuente los focos utilizando la función Recuento de objetos del dispositivo. Para evitar la evaluación de falsos positivos de las señales de fondo restantes, solo se cuentan aquellas señales que muestran al menos el 30% de la intensidad en comparación con el objeto más brillante de la célula.
  2. Inserte / coloque las diapositivas en la plataforma de escaneo automatizado o en la etapa de deslizamiento, después de limpiarlas suavemente con etanol al 70%, para eliminar el polvo.
  3. Configuración de diapositivas - Abrir el menú diálogo Configuración de diapositivas (Figura 3)
    1. Seleccione la ruta de datoscorrecta, esto especifica dónde se almacenan los archivos de diapositivas resultantes de la búsqueda.
    2. Asigne un nombre a la diapositiva, a cada diapositiva se le debe dar un nombre único. Si se introduce una serie de diapositivas en forma de lista enumerada, el '?' se puede utilizar como comodín para el número de diapositiva.
    3. Seleccione el clasificador adecuado, como se describe en la sección 1.1 - 1.4 (Figura 4).
    4. Seleccione la ventana de búsqueda y seleccione Predefinido si existe una definición de ventana de búsqueda que coincida con el círculo de celdas de la citocentrífuga, seleccione la definición respectiva en la columna Tamaño o seleccione Manual si no hay una definición de ventana de búsqueda predefinida disponible. En este caso, no es necesario establecer la columna Tamaño.
    5. Seleccione Recuento máximo de celdas y agregue el número máximo de celdas necesarias para ser escaneadas. La búsqueda finaliza incluso si la ventana de búsqueda seleccionada aún no se ha escaneado por completo tan pronto como se alcanza el recuento máximo de celdas. Para aplicaciones de biodosimetría, la puntuación automatizada de 1000 células por diapositiva es suficiente, teniendo en cuenta que se preparan 3 diapositivas por muestra de sangre. Haga clic en Aceptar para confirmar la configuración.
  4. Configuración de escaneo de diapositivas
    1. Haga clic en el botón Buscar en la barra lateral. Si se seleccionó la configuración Ventana de búsqueda manual en la configuración de diapositivas, se abrirá un cuadro de diálogo que permitirá determinar el área de escaneo (Figura 5). Mediante el objetivo 10x, seleccione el área de búsqueda rectangular en la diapositiva de forma interactiva fijando dos esquinas del campo de búsqueda haciendo clic izquierdo del ratón. Esto se puede confirmar con el botón OK. Si la ventana de búsqueda hace referencia a una ventana de búsqueda predefinida, se omitirá este paso.
    2. Se solicita al usuario que ajuste una posición de inicio de enfoque. A continuación, se seleccionará automáticamente un objeto de referencia, el software solicitará al usuario que enfoque y centre un núcleo de referencia (utilizando el objetivo 40x) para cada diapositiva y que confirme la configuración con OK. El sistema se moverá automáticamente a todas las diapositivas secuencialmente. Si es necesario, ajuste la configuración de Live Image - Tiempo de integración para este paso ( Figura5).
    3. Compruebe todos los ajustes del microscopio y confirme el mensaje del sistema con OK. El sistema iniciará el procedimiento automatizado de enfoque y escaneo. Una vez que se completa el escaneo, los datos se guardan en la computadora para su análisis. El sistema de escaneo se apaga automáticamente después de que se completa el escaneo.
      NOTA: Asegúrese de que la palanca del tubo del microscopio esté en una posición que desvíe toda la luz hacia la cámara.
    4. Fin de la búsqueda, la búsqueda finaliza si se ha analizado toda la búsqueda, si se ha alcanzado el número máximo de celdas o si se ha cancelado la búsqueda.
  5. Análisis de diapositivas
    NOTA: El análisis completado se representa en la Figura 6.
    1. Cuando se complete el escaneo, haga clic en el botón Galería en la barra lateral. Revise la galería, que consta de pequeñas imágenes de las células detectadas. En esta ventana (Figura 7), especifique si las celdas almacenadas en la galería por un criterio que se elegirá en un menú desplegable. Las celdas generalmente se muestran en el orden en que se han detectado.
    2. Haga clic en Histograma de calidad/Diagrama de valores de características (Figura 8)para dar la distribución de la medida de calidad para las células detectadas, así como las medias y la desviación estándar de los focos puntuados.

Resultados

Para este protocolo, las células mononucleares de sangre periférica humana (MBMC) se aislaron de la sangre total de cuatro voluntarios adultos sanos y se expusieron a dosis de radiación de 0,125, 0,250, 0,500, 1,000 y 2,000 Gy. A partir de entonces, las muestras se incubaron durante 1 hora a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2. Después de la fijación y la tinción de inmunofluorescencia, las diapositivas se escanean y puntúan automáticamente. Las figuras 6,7 y 8 dan una representación de lo que el software produce al usuario. Una vez que se completa el escaneo, aparece una ventana de análisis, que ofrece una visión general de los focos puntuados. La galería da todos los focos puntuados con un menú interactivo que puede eliminar valores atípicos y finalmente se da un histograma con un resumen detallado de los datos.

Los focos γ-H2AX después de la exposición a los rayos γ se presentan en la Figura 9. Hubo un aumento gradual en el número de focos de γ-H2AX con el aumento de la dosis. Este gráfico no solo ilustra la dependencia de la dosis y la sensibilidad del ensayo, sino que el ajuste también se puede utilizar para realizar una estimación de la dosis cuando se recibe una muestra de un individuo que ha estado expuesto a una dosis desconocida. Es importante tener en cuenta que uno no tendrá niveles de control o focos de fondo irradiados simulados para este individuo. Por lo tanto, la Figura 9 incluye el valor de 0 Gy de las muestras de control irradiadas simuladamente, que fue de 0,57 ± 0,23 Gy para los cuatro donantes adultos en este estudio.

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Figura 1: Preparación de portaobjetos paracentrifugación de citos. Coloque la diapositiva en el soporte del clip, agregue la tarjeta de filtro encima de ella y, finalmente, el embudo. Asegure los clips deslizantes y colóquelos en la citocentrífuga. Después de la citocentrifugación, retire la diapositiva del soporte del clip y dibuje un círculo alrededor del punto con las células con una pluma hidrofóbica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: La plataforma de escaneo automatizado que se utilizó en este protocolo, que contiene un escáner automatizado conectado a un microscopio fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Menú para la configuración de diapositivas. Abra el diálogo haciendo clic en el botón SETUP en la barra lateral. Seleccione o ingrese el directorio de destino para los archivos de resultados Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4:Menú de configuración del clasificador. Asegúrese de que la configuración del clasificador seleccionada coincida con el tipo de celda actual, las condiciones de preparación y los patrones de tinción de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5:Menú configuración para la ventana de búsqueda manual. Se seleccionó la ventana en la configuración de diapositivas; se abrirá un diálogo que permitirá determinar el área de exploración. Mediante el uso del objetivo 10x, el área de búsqueda rectangular en la diapositiva se selecciona interactivamente fijando dos esquinas del campo de búsqueda haciendo clic izquierdo del mouse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Ventana de análisis, una vez completado el análisis, la ventana de análisis muestra los resultados del análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7:Vista de galería para la diapositiva seleccionada. La pestaña Galería se encuentra en la barra lateral. La galería de imágenes consta de pequeñas imágenes de las celdas detectadas, que se muestran como una imagen combinada DAPI-TRITC. En la esquina inferior izquierda y derecha de cada imagen se muestran los recuentos de focos directos y los focos corregidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8:Imágenes de histograma para la diapositiva seleccionada. Esta ventana se abre haciendo clic con el botón derecho en el histograma. Al hacer clic en el histograma, la hoja de pestañas del histograma proporciona un resumen de datos que enumera la media, la desviación estándar, el coeficiente de variación, los valores mínimos, máximos y medianos de las celdas analizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Número de focos de γ-H2AX en función de la dosis de linfocitos expuestos a 60co-rayos γ. Las barras de error son las desviaciones estándar que representan la variación interindividual entre los donantes. Los datos representan el número medio de focos de γ-H2AX ± desviación estándar de cuatro voluntarios sanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento gradual para la puntuación automatizada basada en microscopía fluorescente del ensayo de focos γ-H2AX. Ilustra la utilidad del ensayo de focos como un método eficiente en el tiempo para analizar el número de DSB de ADN inducido por radiación en linfocitos de sangre periférica para realizar una evaluación de la dosis biológica en un escenario de accidente de radiación donde los individuos podrían estar expuestos a niveles desconocidos de IR.

En este protocolo específico, los PBMC se irradiaron in vitro para imitar una exposición a la radiación in vivo. Una vez que se completa la irradiación y el tiempo de incubación de una hora, se realizan diapositivas utilizando una citocentrífuga para crear un punto de concentración de células en el portaobjetos. El uso de una citocentrífuga es vital para lograr condiciones estandarizadas para la puntuación automatizada. Cuando se completa, se utiliza una pluma hidrofóbica para hacer un círculo alrededor de las células, para reducir el desperdicio de reactivos al permitir al usuario localizar los reactivos de tinción. Este tipo de pluma se puede utilizar en diversas técnicas de inmunotinción, como en secciones de parafina, secciones congeladas y preparaciones de citología. Además, es importante seleccionar una pluma hidrofóbica que sea compatible con sistemas de detección basados en enzimas y fluorescentes. Después de la preparación de la diapositiva, se produjo la fijación y la inmunofluorescencia γ-H2AX. En este protocolo, las células se fijan utilizando PFA al 3% en una solución de PBS durante 20 minutos. Para que la inmunotinción tenga éxito, es esencial que se conserve la morfología de las células y que los sitios antigénicos sean accesibles a los reactivos de detección que se utilizan. El PFA es un agente relativamente suave para la fijación y estabiliza las células mientras preserva las estructuras proteicas51. Los experimentos de optimización con concentraciones más altas de PFA y tiempos de fijación más largos dieron como resultado un impacto negativo en la calidad de la diapositiva, pero el almacenamiento adicional (durante la noche) en 0.5% de PFA hasta 24 horas produjo buenos resultados.

El anticuerpo monoclonal primario 2F3 utilizado en este protocolo reacciona a la variante de histona H2AX cuando se fosforila a serina 139 después de la inducción de DNA DSB. El anticuerpo es capaz de unirse al residuo fosforilado sin reactividad cruzada con otras histonas fosforiladas52. Dado que se trata de un anticuerpo monoclonal primario de ratón, se seleccionó un anticuerpo secundario contra la especie huésped del anticuerpo primario mientras se criaba en un huésped alternativo, a saber, burro-anti-ratón (DAM)-TRITC. Si bien la tinción inmunofluorescente se basa en la unión específica anticuerpo-epítopo, varias fuerzas intermoleculares también pueden dar lugar a una tinción de fondo no específica. Para reducir la unión inespecífica, es importante utilizar un reactivo bloqueador en los protocolos de tinción inmunofluorescente53; utilizamos una solución BSA. Además, se debe asignar suficiente tiempo a este paso de bloqueo dejando las diapositivas en la solución durante al menos 20 minutos antes de la tinción primaria y secundaria de anticuerpos. Además, la solución de BSA también debe usarse como diluyente para los anticuerpos primarios y secundarios. Dependiendo del anticuerpo anti-γ-H2AX y secundario que se utiliza para la tinción, se debe considerar probar diferentes diluciones de anticuerpos para determinar la concentración óptima. Para una puntuación más precisa, se puede realizar una doble tinción, agregando anticuerpos adicionales de proteína de reparación DSB de ADN.

Una desventaja importante de este tipo de análisis es la necesidad de adquirir muestras de sangre lo antes posible después de la exposición, ya que se sabe que el número máximo de focos disminuye a niveles normales dentro de las 48 horas posteriores a la irradiación. Por lo tanto, cuando se conoce el momento del accidente de radiación y el posterior muestreo de sangre, podría ser útil trabajar con diferentes curvas de calibración que se han establecido en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación in vitro (por ejemplo, 4, 8, 12 y 24 horas). Sin embargo, como ya se mencionó en la sección de introducción del manuscrito, la fuerza del ensayo de focos γ-H2AX radica en los propósitos iniciales de triaje rápido y debe usarse para priorizar una dosimetría biológica citogenética que consume más tiempo. Un escenario combinado donde se utilizan múltiples biomarcadores de biodosimetría en paralelo, generará la estimación de dosis más confiable y varios laboratorios de biodosimetría en todo el mundo han unido fuerzas para establecer redes nacionales que pueden activarse y utilizarse para permitir múltiples evaluaciones de biodosimetría paralelas por parte de laboratorios con diferentes conocimientos37,54,55 . Además, se están realizando desarrollos para el análisis súper rápido, como un laboratorio móvil en o cerca del lugar del accidente56. Constantemente se desarrollan nuevos y prometedores métodos de biodosimetría, que se espera que den como resultado un rendimiento aún más rápido y confiable en el futuro57.

Para el sistema automatizado de análisis de imágenes, las diapositivas se insertan o colocan en la plataforma de escaneo automatizado o en el escenario de diapositivas. A continuación, asigne un nombre y guarde los detalles de la diapositiva en la carpeta correspondiente en el equipo conectado. Para este experimento, la detección automatizada de núcleos y focos se basa en los respectivos ajustes del clasificador. Al crear un clasificador, asegúrese de que la configuración del clasificador seleccionada coincida con el tipo de célula actual, las condiciones de preparación y la tinción inmunofluorescente de la muestra. Los canales fluorescentes apropiados que coinciden con el espectro de excitación de los anticuerpos primarios y secundarios se establecen en el clasificador. El clasificador permite establecer parámetros de puntuación adicionales si es necesario (por ejemplo, tamaño del núcleo, intensidad fluorescente, como se describe en la sección 6.1). Si dos o más proteínas de reparación del ADN (por ejemplo, γ-H2AX y 53BP1) se combinan en un experimento, el sistema también es capaz de detectar colocalizaciones de señales. En primer lugar, el sistema adquiere imágenes DAPI, aplica el procesamiento de imágenes e identifica núcleos utilizando criterios morfológicos establecidos en el clasificador. Las señales TRITC se adquieren utilizando 10 pilas z con un tamaño de paso de 0,35 mm entre los planos focales47. El clasificador utilizó el Recuento Directo de Focos, donde se puntúa el número de señales TRITC distintas dentro del núcleo. Aquí, es importante tener en cuenta que con el aumento de la dosis de radiación, las señales de los focos tienden a fusionarse en objetos más grandes, lo que resulta en una subestimación del número real de focos si los objetos se cuentan directamente. No fue necesario para el análisis descrito aquí, pero se puede implementar un paso adicional con el Recuento de Focos Corregidos para resolver este problema. Este último permite al sistema obtener los tamaños de las señales detectadas y las pesa en consecuencia. El uso de ambos métodos de conteo puede proporcionar una estimación más realista del número real de focos a dosis más altas.

Para comenzar el escaneo automatizado, el área de escaneo se determina utilizando el objetivo 10x del microscopio para hacer un área de búsqueda rectangular fijando dos esquinas del campo de búsqueda con el clic izquierdo del mouse (Figura 5), seguido de enfocar la posición inicial. El objeto de referencia se selecciona automáticamente y el software solicita al usuario que enfoque y centre un núcleo de referencia (utilizando el objetivo 40x) para cada diapositiva. Una vez iniciada la búsqueda, el sistema se moverá al centro de la ventana de búsqueda de la primera diapositiva seleccionada y solicitará centrar y enfocar el objeto de referencia. Este objeto se utilizará posteriormente como referencia de posición para corregir cualquier cambio en las posiciones de la celda. El segundo propósito del campo de referencia es el ajuste automático de la luz, en el modo de luz transmitida la luz se ajusta hasta que se alcanza el nivel de luz óptimo. En el modo de fluorescencia el nivel de luz es fijo, pero el tiempo de integración de la cámara CCD se puede aumentar hasta que se mida la señal requerida. Para permitir un ajuste correcto de la luz, la referencia debe contener objetos con tinción típica. Es importante no utilizar un campo que tenga artefactos con una intensidad de tinción muy alta. Después del ajuste de la luz, el sistema inicia el enfoque automático de la cuadrícula en la posición de la cuadrícula más cercana al campo de referencia. Continúa enfocando los campos en una cuadrícula regular, moviéndose en un meandro hacia el frente y la parte posterior de la ventana de búsqueda. El escaneo comienza cuando se completa el enfoque automático de la cuadrícula. La etapa se mueve en un patrón de meandro campo tras campo para capturar datos. Cuando se detecta una celda, su posición y la imagen de la galería se almacenan y se muestran en la pantalla y se actualiza el recuento de celdas. Si se produce un error de microscopio, etapa o alimentador, la búsqueda se cancela automáticamente. El único paso en el que hay una intervención manual del operador es durante la configuración del escaneo de diapositivas. Este es también el punto donde se lleva a cabo un control de calidad rápido (burbujas de aire, bajo número de células, desvanecimiento de los artefactos de tinción de señal fluorescente) y donde se puede decidir abortar el escaneo de una diapositiva de calidad inferior. Una búsqueda finaliza si se ha analizado toda la diapositiva, si se ha alcanzado el número máximo de celdas o si se ha cancelado la búsqueda. Una vez que se completa el escaneo, los datos se presentan como se ven en Figura 6. Para ver las celdas escaneadas, se abre la ventana Galería y se puede ver cada celda (Figura 7). Este es otro punto donde el operador puede realizar un control de calidad comprobando el enfoque de las imágenes de la galería y el número total de celdas que se han puntuado. Si el sistema detectó demasiadas células fuera de foco o el sistema detectó muy pocas células para hacer una estimación realista de la dosis (por ejemplo, 100 células en lugar de las 1000 células previstas), entonces se debe tomar la decisión de excluir la diapositiva y la puntuación automática de la evaluación final. Todos los datos se resumen en histogramas (Figura 8), junto con información sobre la distribución, las medias y la desviación estándar de los focos anotados para cada célula. Los histogramas también se pueden utilizar para seleccionar y mostrar subpoblaciones de núcleos en función de los hallazgos automatizados para su revisión. Los análisis estadísticos de los resultados se realizan después de que la distribución, la media y la desviación estándar del número de focos por célula se hayan registrado manualmente. El gráfico se puede utilizar como una curva de calibración para hacer una estimación de la dosis de una muestra de biodosimetría. Esto se puede hacer utilizando la ecuación de la línea de tendencia para hacer una estimación aproximada de la dosis recibida. Además Figura 9 ilustra que el escaneo automatizado es lo suficientemente sensible como para detectar focos inducidos a dosis bajas. Además, los resultados muestran un claro aumento lineal del número de focos por célula con dosis. Cabe señalar que los resultados solo son representativos para el clasificador utilizado, los resultados diferirán para diferentes parámetros del clasificador. Por lo tanto, en el caso de un análisis de biodosimetría, es importante que se utilice el mismo clasificador y preparación de diapositivas para las muestras de biodosimetría que las que se han utilizado para establecer la curva de calibración que se utiliza para realizar la estimación de dosis. Si bien estaba fuera del alcance de este estudio, es importante tener en cuenta que el ensayo de focos γ-H2AX también se puede utilizar para determinar las irradiaciones corporales parciales. La mayoría de las exposiciones accidentales a la radiación son exposiciones corporales no homogéneas o parciales, donde solo una región localizada del cuerpo recibió una exposición a dosis altas. Varios estudios ilustraron que es posible utilizar el ensayo de focos γ-H2AX para estimar la fracción del cuerpo que ha sido irradiada y la dosis a la fracción irradiada.42. Cuando se produce una irradiación de todo el cuerpo, habrá una inducción aleatoria de ADN DSB en todas las células y uno puede esperar encontrar una distribución de Poisson. Similar a los métodos citogenéticos donde la inducción de aberraciones cromosómicas tiende a estar sobredispersada en linfocitos de sangre periférica donde hay una alta abundancia de células con aberraciones múltiples y células con metafases normales, análisis de dispersión de focos γ-H2AX utilizando un método de Poisson contaminado sugerido sobre distribuciones de focos dispersos58. Esto último también fue confirmado en in vivo experimentos con minicerdos y un macaco rhesus59.

Divulgaciones

C. Schunck es empleado de MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Alemania.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los participantes del estudio por sus donaciones de sangre, así como a la enfermera V. Prince por la recolección de muestras de sangre. Se agradece la asistencia financiera de la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica (NRF) para esta investigación. Las opiniones expresadas y las conclusiones a las que se llega son las de los autores y no necesariamente deben atribuirse al NRF. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA), a través de un Proyecto de Cooperación Técnica (número: URU6042) para apoyar a W. Martínez-López, así como el Proyecto de Investigación Coordinada E35010 (número de contrato: 22248).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albumin - BSAMerckA3059
Coplin JarSigmaS6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm)LasecGlass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL)WhiteSci607101
CytospinHealthcare TechnologiesJC370-12-L
Cytospin ClipsHealthcare TechnologiesJC302
Cytospin filter cardsHealthcare TechnologiesJC307
Cytospin FunnelsHealthcare TechnologiesJC372
DAM-TRITCInvitrogenA16022
DAPI-FluroshieldSigma/MerckF6057
EthanolKimixETD901
Filter tipsWhiteSci 200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HClMerck
HistopaqueSigma/Merck10771
lithium–heparin collection tubesThe Scientific Group367526
MetaSystems - MetaferMetasystemsAzio Imager Z2: 195-041848
NaOHMerck221465
NovoPenLeica BiosystemsNCL-PEN
ParaformaldehydeSigma/Merck158127
Phosphate-buffered saline TabletsSeparationsSH30028,02
PipettesWhiteSciP11037 and P1033X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) AntibodyBiolegend613402 / 100 μg
RPMI mediumWhiteSciBE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)Sigma/MerckT-9284
Tubes (15ml)WhiteSci601002
X-Tra adhesive slides – corner clippedSMM Technologies3800200E

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