Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos

Resumen

Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.

Resumen

La pérdida de función de los melanocitos conduce al vitiligo, que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Actualmente, no existe un tratamiento efectivo a largo plazo para el vitiligo. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un tratamiento conveniente y efectivo para el vitiligo. La tecnología de medicina regenerativa para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos parece ser un nuevo tratamiento prometedor para el vitiligo. Esto implica la reprogramación directa de las células de la piel del paciente en melanocitos funcionales para ayudar a mejorar la pérdida de melanocitos en pacientes con vitiligo. Sin embargo, este método debe probarse primero en ratones. Aunque la reprogramación directa es ampliamente utilizada, no existe un protocolo claro para la reprogramación directa en melanocitos. Además, el número de factores de transcripción disponibles es abrumador.

Aquí, se presenta un protocolo de sistema de empaquetado de lentivirus concentrados para producir factores de transcripción seleccionados para reprogramar células de la piel a melanocitos, incluidos Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se infectaron con el lentivirus concentrado para todos estos factores de transcripción para la reprogramación directa de los MEF en melanocitos inducidos (iMels) in vitro. Además, se examinaron estos factores de transcripción y se optimizó el sistema para la reprogramación directa a los melanocitos. La expresión de los marcadores característicos de melanina en iMels a nivel de gen o proteína aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos podría ser una nueva estrategia terapéutica exitosa para el vitiligo y confirmar el mecanismo de desarrollo de melanocitos, que proporcionará la base para una mayor reprogramación directa de fibroblastos en melanocitos in vivo.

Introducción

El vitiligo es una enfermedad de la piel que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Por diversas razones, incluyendo anomalías metabólicas, estrés oxidativo, generación de mediadores inflamatorios, desprendimiento celular y respuesta autoinmune, los melanocitos funcionales se pierden y se detiene la secreción de melanina, lo que lleva al desarrollo de vitiligo ^1,2. Esta condición ocurre ampliamente y es particularmente problemática en la cara. El tratamiento principal es el uso sistémico de corticosteroides e inmunomoduladores. La fototerapia se puede utilizar para enfermedades sistémicas o locales, y existen tratamientos quirúrgicos, como el trasplante de piel perforada y el trasplante autólogo de melanocitos ^3,4,5. Sin embargo, los pacientes que usan terapia farmacológica y fototerapia son propensos a la recaída, y estos tratamientos tienen efectos terapéuticos pobres a largo plazo. El tratamiento quirúrgico es traumático y sólo moderadamente efectivo ^2,6. Por lo tanto, se necesita una estrategia terapéutica nueva y efectiva para el vitiligo.

La reprogramación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) revierte estas células de su estado terminal a un estado pluripotente, un proceso mediado por los factores de transcripción, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc⁷. Sin embargo, debido a la posibilidad de tumorigenicidad y al largo tiempo de producción, esta tecnología ha sido recibida con escepticismo cuando se aplica a entornos clínicos⁸. La reprogramación directa es una tecnología que hace que un tipo de célula terminal se transforme en otro tipo de célula terminal⁹. Este proceso se logra mediante factores de transcripción adecuados. Varias células ya han sido reprogramadas directamente con éxito, incluyendo cardiomiocitos¹⁰, neuronas¹¹ y células ciliadas cocleares¹². Algunos investigadores incluso han reprogramado el tejido de la piel directamente in situ, que se puede utilizar para la reparación de heridas¹³. Las ventajas de la reprogramación directa incluyen tiempos y costos de espera reducidos, menor riesgo de cáncer, menos problemas éticos y una mejor comprensión del mecanismo subyacente a la determinación del destino celular⁹.

Aunque el método de reprogramación directa es ampliamente utilizado, actualmente no existe un método definido para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos, especialmente debido a los numerosos factores de transcripción que deben considerarse^14,15. Los factores de transcripción, Mitf, Sox10 y Pax3, se han utilizado para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos¹⁴. En contraste, la combinación de MITF, PAX3, SOX2 y SOX9 también se ha utilizado para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos humanos en otro estudio¹⁵. En este protocolo, a pesar del uso de un método de cribado diferente, se obtuvo el mismo resultado con la combinación de Mitf, Sox10 y Pax3 para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos como se describió anteriormente¹⁴. El desarrollo de un sistema para generar melanocitos a partir de otras células de la piel puede proporcionar un esquema para transformar otras células de la piel de pacientes con vitiligo en melanocitos. Por lo tanto, es crucial construir un método simple y eficiente para que esta reprogramación directa genere melanocitos con éxito.

Protocolo

Este trabajo fue aprobado por el Comité de Manejo y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Los experimentos se realizaron en estricta conformidad con los estándares establecidos por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). No hubo experimentos con humanos, por lo que este trabajo no necesitó la aprobación del comité de ética de investigación humana. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos.

1. Construcción de un sistema concentrado de envasado de lentivirus para factores de transcripción

1. Producción del virus concentrado (Figura 1A, B)
   1. Placa 1,5 × 10⁶ células HEK-293T en una placa de 60 mm y cultivar estas células con medio normal (ver Tabla 1) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
      NOTA: Si el virus necesita ser empaquetado en lotes, se puede utilizar una placa de cultivo celular de 100 mm (para más detalles, consulte la Tabla 2).
   2. Después de 24 h, asegúrese de que las células HEK-293T hayan alcanzado el 80-90% de confluencia el día de la transducción, y reemplace el medio con 3,5 ml de DMEM (150 μL de DMEM por 1 cm²). Dejar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 2 h.
      NOTA: El medio de reemplazo debe estar libre de suero, de modo que las células puedan estar "hambrientas" para una mejor transfección de plásmidos.
   3. Preparar la mezcla de plásmidos (mezcla A) que contenga 3 μg de los plásmidos diana de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 μg del plásmido envasador PMD2. G, y 2 μg del plásmido empaquetador PSPAX2. Enrasar el volumen de la mezcla A a 150 μL con DMEM sin suero. Prepare la mezcla del reactivo de transfección (mezcla B) agregando 12 μL del reactivo de transfección (el volumen es el doble de la masa total de todos los plásmidos) y componga el volumen de la mezcla B a 150 μL con DMEM sin suero.
      NOTA: Al preparar las mezclas, es importante agregar líquido lentamente para evitar burbujas de aire.
   4. Combine la mezcla A y la mezcla B después de dejar que permanezcan durante 5 minutos a temperatura ambiente. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min para formar el complejo de transfección.
   5. Saque las células HEK-293T de la incubadora, reemplace el medio con DMEM + 2% FBS, agregue la mezcla del paso 1.1.4 gota a gota y mezcle el líquido suavemente.
   6. Después de 8 h, cambie el medio con 3,5 ml de medio normal. Después de cambiar el medio, recoger el sobrenadante del virus cada 24 h y 48 h.
   7. Mezcle los sobrenadantes del virus recolectados en dos puntos de tiempo diferentes. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Pase el sobrenadante a través de filtros de 0,45 μm y recójalo en un tubo cónico estéril de 50 ml.
      NOTA: El virus recogido a las 24 h puede almacenarse a 4 °C y mezclarse con el virus recogido a las 48 h.
   8. Concentrar el sobrenadante del virus centrifugando a 6000 × g a 4 °C durante la noche (~16 h). Asegúrese de que el gránulo del virus sea visible en la parte inferior del tubo cónico después de la centrifugación.
   9. Vierta el sobrenadante lentamente. Disolver el gránulo del virus en un volumen de medio normal que sea 1/100^th del volumen del sobrenadante del virus. Usando una micropipeta P1000, pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente hasta obtener una mezcla homogénea. Divida el virus concentrado en tubos de microcentrífuga según sea necesario. Conservar a -80 °C.
      NOTA: El virus se concentra 100 veces con este método. El virus concentrado (100x) se puede almacenar durante >1 año a -80 °C. Evite la congelación y descongelación repetidas del virus.
2. Detección del título concentrado del virus (Figura 1C)
   1. La placa 1 × 10⁵ células HEK-293T en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Recuerda añadir uno bien como control negativo. Cultive estas células con medio normal a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
   2. Añadir 0,1 μL o 0,2 μL de virus concentrado fluorescente (100x) a cada pocillo después de 24 h, y añadir 4 ng/μL del reactivo de transfección polimérica catiónica a cada pocillo. Aproximadamente 8-12 h después de la infección, reemplace el medio con el medio normal.
      NOTA: Para garantizar la precisión y la eficiencia de la detección de fluorescencia, la tasa de infección debe ser del 10-30%. La adición de 0,1 μL o 0,2 μL del virus concentrado fluorescente puede mantener la eficiencia de la infección dentro de este rango. El título concentrado del virus puede alcanzar 1 × 10⁸ unidades transductoras (TU)/ml como mínimo.
   3. Aproximadamente 48 h después de la infección, lave el plato con 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas.
   4. Tripsinizar estas células usando 250 μL de tripsina-EDTA al 0,05% por pocillo en una placa de 6 pocillos durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y luego retirar el sobrenadante.
   5. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS, agregue la suspensión a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml y detecte la eficiencia de infección de la fluorescencia del virus (proteína fluorescente verde, GFP ⁺) utilizando citometría de flujo.
   6. Calcule el título concentrado del virus utilizando la siguiente fórmula: 10⁵ (volumen celular) × tasa de infección (GFP⁺%)/volumen de virus añadido (0,1 μL o 0,2 μL).

2. Reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos (Figura 2A)

1. Cubra un pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con 1 ml de solución de gelatina al 0,1% a temperatura ambiente durante 15-30 min. Asegúrese de que el pozo esté completamente cubierto con la solución de gelatina al 0,1%. Aspire la solución de gelatina al 0,1% después del recubrimiento.
   NOTA: Prepare una solución de gelatina al 0,1% (100 ml) de la siguiente manera: 0,1 g de gelatina en polvo se disuelven en 100 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio en autoclave y luego se almacenan a 4 ° C durante no más de 2 meses.
2. La placa 5 × 10⁴ MEFs en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina al 0,1% (como en el paso 2.1), y cultiva estas células con medio normal a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante la noche.
3. Pasadas las 24 h, confirmar que los MEFs han alcanzado el 40-50% de confluencia. Reemplace el medio por el medio normal.
4. El día 0, saque el virus concentrado del congelador y derrita el virus en hielo. Calcule el volumen del virus que se agregará mediante eq. (1). Agregue el virus concentrado para los seis factores de transcripción, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 y Snai2 (consulte la Tabla de materiales) a cada pozo de acuerdo con el volumen calculado, y luego agregue 4 μg / ml del agente de transfección polimérica catiónica.
   Número de células (5 × 10⁴) × 30 (multiplicidad de infección, MOI)/título de virus (1)
5. El día 1, 8-12 h después de la infección, retire el medio que contiene el virus y reemplácelo con un medio normal fresco mientras agrega 0.5 μg / ml de puromicina para detectar líneas celulares infectadas estables.
6. El día 2, 48 h después de la infección, reemplace el medio sobrenadante gradualmente con el medio de reprogramación. Primero, cambie 1^{/4 del} volumen medio total y agregue 3 μM CHIR99021.
7. Desde el día 3 hasta el día 7, dependiendo de la condición de las celdas, cambie el medio reemplazando con una mayor proporción de medio de reprogramación (ver Tabla 1) gradualmente, y cambie a un medio de reprogramación completo dentro de los 5 días.
   NOTA: Durante este período, puromycin y CHIR99021 deben usarse todos los días. Muchas células muertas aparecerán el primer y segundo día de cambio del medio de reprogramación. Esto es normal a medida que las células se adaptan gradualmente a la transformación. Por lo tanto, el medio debe cambiarse gradualmente para garantizar la proliferación saludable de las células.
8. Para pasar las células, agregue 500 μL de tripsina-EDTA al 0.05% para digerir las células durante 3 minutos a temperatura ambiente. Cuando ~ 60% de las células han flotado, detenga la digestión agregando un medio normal 2 veces el volumen de la enzima digestiva. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 15 ml, centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante, resuspendir el pellet celular con el medio de reprogramación y colocar las células en una placa estéril de 60 mm a una densidad de 3 × 10⁴/cm². Cultive estas células a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO₂ .
   NOTA: Desde el día 8 hasta el día 21, estas células se subcultivan cada 3-5 días y se cultivan en platos estériles de 60 mm para expandirse. Se pueden cultivar para llegar al menos al pasaje 5.

3. Optimización para la reprogramación e identificación directa

1. Detección de los factores de transcripción optimizados
   1. Repita los pasos 2.1-2.7, reduciendo uno de los seis factores de transcripción cada vez. Infectar los MEF con el virus con combinaciones de cinco factores de transcripción.
   2. Siete días después de la infección, extraer el ARN de estas células¹⁶ y analizar los niveles de expresión de sus genes melanocíticos mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR)¹⁷ para detectar los factores de transcripción con mayor impacto en la conversión a melanocitos eliminándolos uno por uno (Figura 3A).
   3. Utilice los tres principales factores de transcripción que afectan la conversión a melanocitos para infectar los MEF. Repita los pasos 2.1 a 2.7.
      NOTA: Siete días después de la infección, los genes melanocíticos deben ser detectables en estas células transformadas (Figura 3B). La información de imprimación para la caracterización de iMels se incluye en la Tabla 3.
2. Identificación de melanocitos inducidos (iMels)
   1. Utilice la tinción de inmunofluorescencia¹⁸ para verificar que los iMels expresan proteínas melanocíticas, incluyendo TYRP-1 y DCT (Figura 4A).
   2. Tinción de 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) específica de melanina (Figura 4B)
      1. Prepare paraformaldehído al 4% (10 ml) de la siguiente manera: disuelva 0,4 g de polvo de paraformaldehído en 10 ml de PBS. Coloque la solución en un horno a 56 °C durante 2 h para promover la disolución.
         NOTA: La solución se puede mantener a 4 °C durante no más de un mes.
      2. Cultive los iMels en un plato de 30 mm y lave el plato dos veces con PBS precalentado. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% para fijar las células durante 20 minutos y lave el plato 3 veces con PBS.
      3. Prepare la solución de tinción de DOPA al 0,1% (10 ml) justo antes de su uso disolviendo 0,01 g de polvo de L-DOPA en 10 ml de PBS. Coloque la solución en un baño de agua a 37 °C durante 30 min; agitarlo varias veces para promover la disolución.
      4. Agregue 1 ml de solución de tinción de DOPA al 0,1% recién preparada. Incubar en un horno a 37 °C durante 2-5 h. Si no hay partículas marrón-negras, continúe incubando a 37 °C durante otras 2 h, pero no durante >5 h. Compruebe las muestras cada 30 minutos.
      5. Lave el plato 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez. Mante el núcleo con 1 ml de solución de tinción de hematoxilina durante 2 min.
      6. Para el almacenamiento a largo plazo, deshidrate las muestras con etanol al 95% durante 3 minutos y luego etanol al 100% durante 5 minutos. Selle el plato con xileno y bálsamo neutro.
   3. Tinción de Masson-Fontana específica de melanina (Figura 4B)
      1. Placa iMels en un plato de 30 mm y fijar las células con 4% de paraformaldehído durante 20 min; lavar el plato 3 veces con PBS.
      2. Agregue 1 ml de solución A (solución de plata de amoníaco) del kit de tinción Masson-Fontana (consulte la Tabla de materiales), coloque el plato en una caja oscura y coloque la caja oscura en un horno a 56 ° C durante 15-40 min.
         NOTA: Si las partículas marrón-negras no son visibles después de 15 min en el horno, devuelva las muestras al horno de 56 °C para continuar incubando, pero no durante >40 min. Se puede agregar un poco de agua a la caja oscura para evitar que se seque.
      3. Aspirar la solución A y lavar el plato 5-6 veces con agua destilada, 1-2 min cada vez.
      4. Agregue 1 ml de solución B (hipo solución) del kit de tinción Masson-Fontana y deje el plato a temperatura ambiente durante 3-5 min.
      5. Aspire la solución B y lave el plato con agua del grifo 3 veces, 1 min cada vez.
      6. Agregue 1 ml de solución C (tinte rojo neutro) del kit de tinción Masson-Fontana y deje el plato a temperatura ambiente durante 3-5 min.
      7. Aspirar la solución C y lavar el plato 3 veces con agua destilada, 1 min cada vez.
      8. Agregue 1 ml de etanol al 100% para una deshidratación rápida y aspire el etanol después de 3 min.
         NOTA: Las muestras teñidas se pueden almacenar durante mucho tiempo después del sellado con xileno y bálsamo neutro.

Resultados

Este artículo incluye los protocolos de un sistema concentrado de empaquetado de lentivirus para producir lentivirus de factores de transcripción para la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos y protocolos para la detección de factores de transcripción y reprogramación directa de melanocitos a partir de MEFs.

El éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP (Figura 1A) o por citom...

Discusión

La calidad del virus es crucial para el éxito de la reprogramación directa a los melanocitos en este protocolo. El método de envasado y concentración de virus en este protocolo es simple y fácil de repetir y no depende de ningún otro reactivo concentrado auxiliar. Este protocolo se puede seguir con éxito en la mayoría de los laboratorios. Para garantizar la calidad del virus concentrado, los siguientes puntos necesitan una atención especial. Uno es el estado celular de HEK-293T. Aunque las células HEK-293T son ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT