Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

Résumé

Nous décrivons ici un système de reprogrammation directe optimisé pour les mélanocytes et un système d’emballage de virus concentré à haute efficacité qui assure une reprogrammation directe en douceur.

Résumé

La perte de fonction des mélanocytes conduit au vitiligo, qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace à long terme pour le vitiligo. Par conséquent, il est impératif de développer un traitement pratique et efficace pour le vitiligo. La technologie de médecine régénérative pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes semble être un nouveau traitement prometteur du vitiligo. Cela implique la reprogrammation directe des cellules de la peau du patient en mélanocytes fonctionnels pour aider à améliorer la perte de mélanocytes chez les patients atteints de vitiligo. Cependant, cette méthode doit d’abord être testée sur des souris. Bien que la reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe pas de protocole clair pour la reprogrammation directe en mélanocytes. De plus, le nombre de facteurs de transcription disponibles est écrasant.

Ici, un protocole de système d’emballage de lentivirus concentré est présenté pour produire des facteurs de transcription sélectionnés pour reprogrammer les cellules de la peau en mélanocytes, y compris Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2. Des fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris ont été infectés par le lentivirus concentré pour tous ces facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des MEF en mélanocytes induits (iMels) in vitro. De plus, ces facteurs de transcription ont été examinés et le système a été optimisé pour une reprogrammation directe en mélanocytes. L’expression des marqueurs caractéristiques de la mélanine dans iMels au niveau du gène ou de la protéine a été significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique réussie pour le vitiligo et confirmer le mécanisme de développement des mélanocytes, ce qui fournira la base d’une reprogrammation directe ultérieure des fibroblastes en mélanocytes in vivo.

Introduction

Le vitiligo est une maladie de la peau qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Pour diverses raisons, y compris les anomalies métaboliques, le stress oxydatif, la génération de médiateurs inflammatoires, le détachement cellulaire et la réponse auto-immune, les mélanocytes fonctionnels sont perdus et la sécrétion de mélanine est arrêtée, conduisant au développement du vitiligo ^1,2. Cette condition se produit largement et est particulièrement problématique sur le visage. Le traitement principal est l’utilisation systémique de corticostéroïdes et d’immunomodulateurs. La photothérapie peut être utilisée pour des maladies systémiques ou locales, et il existe des traitements chirurgicaux, tels que la greffe de peau perforée et la greffe de mélanocytes^{autologues 3,4,5}. Cependant, les patients qui utilisent la pharmacothérapie et la photothérapie sont sujets aux rechutes, et ces traitements ont de faibles effets thérapeutiques à long terme. Le traitement chirurgical est traumatisant et n’est que modérément efficace ^2,6. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique efficace est nécessaire pour le vitiligo.

La reprogrammation des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) inverse ces cellules de leur état terminal à un état pluripotent, un processus médié par les facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc⁷. Cependant, en raison de la possibilité de tumorigénicité et du long temps de production, cette technologie a été accueillie avec scepticisme lorsqu’elle est appliquée à des contextes cliniques⁸. La reprogrammation directe est une technologie qui transforme un type de cellule terminale en un autre type de cellule terminale⁹. Ce processus est réalisé par des facteurs de transcription appropriés. Diverses cellules ont déjà été directement reprogrammées avec succès, notamment les cardiomyocytes¹⁰, les neurones¹¹ et les cellules ciliées cochléaires¹². Certains chercheurs ont même reprogrammé des tissus cutanés directement in situ, qui peuvent être utilisés pour la réparation des plaies¹³. Les avantages de la reprogrammation directe comprennent la réduction des temps d’attente et des coûts, la réduction du risque de cancer, la réduction des problèmes éthiques et une meilleure compréhension du mécanisme sous-jacent à la détermination du devenir cellulaire⁹.

Bien que la méthode de reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe actuellement aucune méthode précise pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes, en particulier en raison des nombreux facteurs de transcription à considérer^14,15. Les facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et Pax3, ont été utilisés pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes¹⁴. En revanche, la combinaison de MITF, PAX3, SOX2 et SOX9 a également été utilisée pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes humains dans une autre étude¹⁵. Dans ce protocole, malgré l’utilisation d’une méthode de dépistage différente, le même résultat a été obtenu avec la combinaison de Mitf, Sox10 et Pax3 pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes comme décrit précédemment¹⁴. Le développement d’un système pour générer des mélanocytes à partir d’autres cellules de la peau peut fournir un schéma pour transformer d’autres cellules cutanées de patients atteints de vitiligo en mélanocytes. Par conséquent, il est crucial de construire une méthode simple et efficace pour cette reprogrammation directe afin de générer des mélanocytes avec succès.

Protocole

Ce travail a été approuvé par le Comité de gestion et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université du Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Les expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les normes établies par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Il n’y a pas eu d’expériences impliquant des humains, donc ce travail n’a pas eu besoin de l’approbation du comité d’éthique de la recherche humaine. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur les réactifs.

1. Construction d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour les facteurs de transcription

1. Production du virus concentré (Figure 1A, B)
   1. Plaque 1,5 × 10 cellules⁶ HEK-293T dans une cuve de 60 mm et cultiver ces cellules avec un milieu normal (voir tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
      REMARQUE: Si le virus doit être emballé par lots, une boîte de culture cellulaire de 100 mm peut être utilisée (pour plus de détails, voir le tableau 2).
   2. Après 24 h, assurez-vous que les cellules HEK-293T ont atteint 80-90% de confluence le jour de la transduction, et remplacez le milieu par 3,5 mL de DMEM (150 μL de DMEM par 1 cm²). Laisser les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂ pendant 2 h.
      REMARQUE: Le milieu de remplacement doit être sans sérum, de sorte que les cellules puissent être « affamées » pour une meilleure transfection plasmidique.
   3. Préparer le mélange de plasmides (mélange A) contenant 3 μg des plasmides cibles de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 μg du plasmide d’emballage PMD2. G et 2 μg du plasmide d’emballage PSPAX2. Porter le volume du mélange A à 150 μL avec du DMEM sans sérum. Préparer le mélange du réactif de transfection (mélange B) en ajoutant 12 μL du réactif de transfection (le volume est le double de la masse totale de tous les plasmides), et composer le volume du mélange B à 150 μL avec du DMEM sans sérum.
      REMARQUE: Lors de la préparation des mélanges, il est important d’ajouter du liquide lentement pour éviter les bulles d’air.
   4. Mélanger le mélange A et le mélange B après les avoir laissés reposer pendant 5 min à température ambiante. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20-30 min pour former le complexe de transfection.
   5. Sortez les cellules HEK-293T de l’incubateur, remplacez le milieu par du DMEM + 2% FBS, ajoutez le mélange de l’étape 1.1.4 dans le sens des gouttes et mélangez doucement le liquide.
   6. Après 8 h, changer le milieu avec 3,5 mL de milieu normal. Après avoir changé le milieu, collectez le surnageant du virus toutes les 24 h et 48 h.
   7. Mélangez les surnageants du virus collectés à deux moments différents. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Passez le surnageant à travers des filtres de 0,45 μm et collectez-le dans un tube conique stérile de 50 mL.
      REMARQUE: Le virus collecté à 24 h peut être stocké à 4 °C et mélangé avec le virus collecté à 48 h.
   8. Concentrer le surnageant du virus par centrifugation à 6000 × g à 4 °C pendant la nuit (~16 h). Assurez-vous que la pastille virale est visible au fond du tube conique après la centrifugation.
   9. Versez le surnageant lentement. Dissoudre la pastille virale dans un volume de milieu normal qui représente 1/100^ème du volume du surnageant du virus. À l’aide d’une micropipette P1000, pipettez doucement de haut en bas jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène. Divisez le virus concentré en tubes de microcentrifugation au besoin. Conserver à −80 °C.
      REMARQUE: Le virus est concentré 100x avec cette méthode. Le virus concentré (100x) peut être conservé pendant >1 an à −80 °C. Évitez la congélation et la décongélation répétées du virus.
2. Détection du titre de virus concentré (Figure 1C)
   1. La plaque 1 × 10 cellules HEK-293T de⁵ dans un puits d’une plaque de 6 puits. N’oubliez pas d’en ajouter un comme contrôle négatif. Cultiver ces cellules avec un milieu normal à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂.
   2. Ajouter 0,1 μL ou 0,2 μL de virus fluorescent concentré (100x) à chaque puits après 24 h, et ajouter 4 ng/μL du réactif de transfection polymère cationique à chaque puits. Environ 8-12 heures après l’infection, remplacez le milieu par un milieu normal.
      REMARQUE: Pour assurer la précision et l’efficacité de la détection de fluorescence, le taux d’infection doit être de 10 à 30%. L’ajout de 0,1 μL ou 0,2 μL du virus concentré fluorescent peut maintenir l’efficacité de l’infection dans cette plage. Le titre de virus concentré peut atteindre au moins 1 × 10⁸ unités de transduction (UT)/mL.
   3. Environ 48 heures après l’infection, laver la vaisselle avec 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules mortes.
   4. Trypsiniser ces cellules en utilisant 250 μL de 0,05% de trypsine-EDTA par puits dans une plaque de 6 puits pendant 1 min à température ambiante. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C puis retirer le surnageant.
   5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS, ajouter la suspension à un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL et détecter l’efficacité de l’infection de la fluorescence du virus (protéine fluorescente verte, GFP⁺) à l’aide de la cytométrie en flux.
   6. Calculer le titre de virus concentré à l’aide de la formule suivante : 10⁵ (volume cellulaire) × taux d’infection (GFP⁺%)/volume de virus ajouté (0,1 μL ou 0,2 μL).

2. Reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes (Figure 2A)

1. Enduire un puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec 1 mL de solution de gélatine à 0,1% à température ambiante pendant 15-30 min. Assurez-vous que le puits est complètement recouvert de la solution de gélatine à 0,1%. Aspirer la solution de gélatine à 0,1% après revêtement.
   REMARQUE: Préparer une solution de gélatine à 0,1% (100 mL) comme suit: 0,1 g de poudre de gélatine est dissous dans 100 mL d’eau ultrapure dans un flacon en verre autoclavé, puis conservé à 4 ° C pendant 2 mois au maximum.
2. La plaque 5 × 10⁴ MEF dans un puits d’une plaque de 6 puits recouverte de 0,1% de gélatine (comme à l’étape 2.1), et cultiver ces cellules avec un milieu normal à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂ pendant la nuit.
3. Après 24 h, confirmez que les MEF ont atteint 40-50% de confluence. Remplacez le milieu par un milieu normal.
4. Le jour 0, retirez le virus concentré du congélateur et faites fondre le virus sur la glace. Calculer le volume du virus à ajouter à l’aide de l’égalisation (1). Ajouter le virus concentré pour les six facteurs de transcription, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 et Snai2 (voir tableau des matériaux) à chaque puits en fonction du volume calculé, puis ajouter 4 μg/mL de l’agent de transfection polymère cationique.
   Nombre de cellules (5 × 10⁴) × 30 (multiplicité de l’infection, MOI)/titre de virus (1)
5. Le jour 1, 8 à 12 h après l’infection, retirer le milieu contenant le virus et le remplacer par un milieu normal frais tout en ajoutant 0,5 μg/mL de puromycine pour dépister les lignées cellulaires infectées stables.
6. Le jour 2, 48 h après l’infection, remplacez progressivement le milieu surnageant par le milieu de reprogrammation. Tout d’abord, changez 1/4^ème du volume moyen total et ajoutez 3 μM CHIR99021.
7. Du jour 3 au jour 7, selon l’état des cellules, changez progressivement le milieu en le remplaçant par une proportion plus élevée de milieu de reprogrammation (voir tableau 1) et passez au milieu de reprogrammation complet dans les 5 jours.
   REMARQUE: Pendant cette période, la puromycine et le CHIR99021 doivent être utilisés tous les jours. De nombreuses cellules mortes apparaîtront le premier et le deuxième jour du changement de support de reprogrammation. Ceci est normal car les cellules s’adaptent progressivement à la transformation. Par conséquent, le milieu doit être modifié progressivement pour assurer la prolifération saine des cellules.
8. Pour passer les cellules, ajouter 500 μL de 0,05% de trypsine-EDTA pour digérer les cellules pendant 3 min à température ambiante. Lorsque ~ 60% des cellules ont flotté, arrêtez la digestion en ajoutant un milieu normal 2x le volume de l’enzyme digestive. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL, centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant, remettre la pastille cellulaire avec le milieu de reprogrammation et plaquer les cellules dans une parabole stérile de 60 mm à une densité de 3 × 10⁴/cm². Cultivez ces cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
   REMARQUE: Du jour 8 au jour 21, ces cellules sont sous-cultivées tous les 3-5 jours et cultivées dans des plats stériles de 60 mm pour se dilater. Ils peuvent être cultivés pour atteindre au moins le passage 5.

3. Optimisation pour la reprogrammation directe et l’identification

1. Dépistage des facteurs de transcription optimisés
   1. Répétez les étapes 2.1 à 2.7, en réduisant l’un des six facteurs de transcription à chaque fois. Infecter les MEF avec le virus avec des combinaisons de cinq facteurs de transcription.
   2. Sept jours après l’infection, extraire l’ARN de ces cellules¹⁶ et analyser les niveaux d’expression de leurs gènes mélanocytaires à l’aide de la PCR à transcription inverse (RT-PCR)¹⁷ pour dépister les facteurs de transcription ayant le plus grand impact sur la conversion en mélanocytes en les enlevant un par un (Figure 3A).
   3. Utilisez les trois principaux facteurs de transcription ayant un impact sur la conversion en mélanocytes pour infecter les MEF. Répétez les étapes 2.1 à 2.7.
      REMARQUE : Sept jours après l’infection, les gènes mélanocytaires devraient être détectables dans ces cellules transformées (figure 3B). Les informations d’introduction pour la caractérisation des iMels sont incluses dans le tableau 3.
2. Identification des mélanocytes induits (iMels)
   1. Utilisez la coloration par immunofluorescence¹⁸ pour vérifier que les iMels expriment des protéines mélanocytaires, y compris TYRP-1 et DCT (Figure 4A).
   2. Coloration de la 3,4-dihydroxyphénylalanine (DOPA) spécifique à la mélanine (figure 4B)
      1. Préparer le paraformaldéhyde à 4 % (10 mL) comme suit : dissoudre 0,4 g de poudre de paraformaldéhyde dans 10 mL de PBS. Placer la solution dans un four à 56 °C pendant 2 h pour favoriser la dissolution.
         REMARQUE: La solution peut être conservée à 4 ° C pendant un mois au maximum.
      2. Cultivez les iMels dans un plat de 30 mm et lavez le plat deux fois avec du PBS préchauffé. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pour fixer les cellules pendant 20 min, et laver la vaisselle 3 fois avec du PBS.
      3. Préparer une solution de coloration à 0,1 % de DOPA (10 mL) juste avant utilisation en dissolvant 0,01 g de poudre de L-DOPA dans 10 mL de PBS. Placer la solution au bain-marie à 37 °C pendant 30 min; secouez-le plusieurs fois pour favoriser la dissolution.
      4. Ajouter 1 mL de solution de coloration DOPA à 0,1 % fraîchement préparée. Incuber dans un four à 37 °C pendant 2-5 h. S’il n’y a pas de particules brun-noir, continuer à incuber à 37 °C pendant encore 2 h, mais pas pendant >5 h. Vérifiez les échantillons toutes les 30 minutes.
      5. Lavez le plat 3 fois avec PBS pendant 1 min à chaque fois. Tacher le noyau avec 1 mL de solution de coloration à l’hématoxyline pendant 2 min.
      6. Pour un stockage à long terme, déshydrater les échantillons à l’aide d’éthanol à 95 % pendant 3 min, puis d’éthanol à 100 % pendant 5 min. Scellez le plat avec du xylène et du baume neutre.
   3. Coloration Masson-Fontana spécifique à la mélanine (Figure 4B)
      1. Plaque iMels dans un plat de 30 mm et fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 20 min; laver la vaisselle 3 fois avec PBS.
      2. Ajouter 1 mL de solution A (solution d’ammoniac et d’argent) du kit de coloration Masson-Fontana (voir Tableau des matériaux), placer le plat dans une boîte sombre et placer la boîte sombre dans un four à 56 °C pendant 15-40 min.
         REMARQUE: Si les particules brun-noir ne sont pas visibles après 15 min dans le four, retourner les échantillons au four à 56 °C pour continuer l’incubation mais pas pendant >40 min. Un peu d’eau peut être ajoutée à la boîte sombre pour éviter le dessèchement.
      3. Aspirer la solution A et laver le plat 5-6 fois avec de l’eau distillée, 1-2 min à chaque fois.
      4. Ajouter 1 mL de solution B (hypo solution) du kit de coloration Masson-Fontana et laisser le plat à température ambiante pendant 3-5 min.
      5. Aspirer la solution B et laver la vaisselle avec de l’eau du robinet 3 fois, 1 min à chaque fois.
      6. Ajouter 1 mL de solution C (colorant rouge neutre) du kit de coloration Masson-Fontana et laisser le plat à température ambiante pendant 3-5 min.
      7. Aspirer la solution C et laver le plat 3 fois avec de l’eau distillée, 1 min à chaque fois.
      8. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % pour une déshydratation rapide et aspirer l’éthanol après 3 min.
         REMARQUE: Les échantillons colorés peuvent être conservés longtemps après avoir été scellés avec du xylène et du baume neutre.

Résultats

Cet article comprend les protocoles d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour produire le lentivirus des facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes et les protocoles pour le dépistage des facteurs de transcription et la reprogrammation directe des mélanocytes à partir de MEF.

Le succès de la production de lentivirus concentré a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP (Figure...

Discussion

La qualité du virus est cruciale pour le succès de la reprogrammation directe en mélanocytes dans ce protocole. La méthode d’emballage et de concentration des virus dans ce protocole est simple et facile à répéter et ne repose sur aucun autre réactif concentré auxiliaire. Ce protocole peut être suivi avec succès dans la plupart des laboratoires. Pour garantir la qualité du virus concentré, les points suivants nécessitent une attention particulière. L’un est le statut cellulaire de HEK-293T. Bien que le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT