Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

Resumo

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Resumo

A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador.

Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.

Introdução

O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo ^1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratamentos cirúrgicos, como transplante de pele perfurado e transplante de melanócitos autólogos ^3,4,5. No entanto, pacientes que usam terapia medicamentosa e fototerapia são propensos a recaídas, e esses tratamentos têm efeitos terapêuticos de longo prazo ruins. O tratamento cirúrgico é traumático e apenas moderadamente eficaz ^2,6. Portanto, uma nova e eficaz estratégia terapêutica é necessária para o vitiligo.

A reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reverte essas células de seu estado terminal para um estado pluripotente, um processo mediado pelos fatores de transcrição, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc⁷. No entanto, devido à possibilidade de tumorigenicidade e ao longo tempo de produção, essa tecnologia tem sido recebida com ceticismo quando aplicada aos cenários clínicos⁸. Reprogramação direta é uma tecnologia que faz com que um tipo de célula terminal se transforme em outro tipo de célula terminal⁹. Esse processo é alcançado por fatores adequados de transcrição. Várias células já foram diretamente reprogramadas com sucesso, incluindo cardiomiócitos¹⁰, neurônios¹¹ e células ciliadas cocleares¹². Alguns pesquisadores até reprogramaram tecido da pele diretamente in situ, que pode ser usado para reparação de feridas¹³. As vantagens da reprogramação direta incluem redução do tempo de espera e custos, menor risco de câncer, menos problemas éticos e uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à determinação do destino^{celular 9}.

Embora o método de reprogramação direta seja amplamente utilizado, atualmente não há um método definido para a reprogramação direta das células da pele em melanócitos, especialmente por causa dos numerosos fatores de transcrição a serem considerados^14,15. Os fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e Pax3, têm sido usados para reprogramação direta de células da pele em melanócitos¹⁴. Em contraste, a combinação de MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 também tem sido usada para reprogramação direta de células da pele em melanócitos humanos em outro estudo¹⁵. Neste protocolo, apesar do uso de um método de triagem diferente, o mesmo resultado foi obtido com a combinação de Mitf, Sox10 e Pax3 para reprogramação direta de células da pele em melanócitos como descrito anteriormente¹⁴. Desenvolver um sistema para gerar melanócitos de outras células da pele pode fornecer um esquema para transformar outras células da pele de pacientes com vitiligo em melanócitos. Por isso, é fundamental construir um método simples e eficiente para essa reprogramação direta para gerar melanócitos com sucesso.

Protocolo

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes.

1. Construção de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para fatores de transcrição

1. Produção do vírus concentrado (Figura 1A, B)
   1. Placa 1,5 × 10^células HEK-293T em um prato de 60 mm e cultivar essas células com meio normal (ver Tabela 1) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
      NOTA: Se o vírus precisar ser embalado em lotes, um prato de cultura celular de 100 mm pode ser usado (para detalhes, consulte Tabela 2).
   2. Após 24 horas, certifique-se de que as células HEK-293T atingiram 80-90% de confluência no dia da transdução, e substitua o meio por 3,5 mL de DMEM (150 μL de DMEM por 1 cm²). Deixe as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por 2 h.
      NOTA: O meio de substituição deve ser livre de soro, para que as células possam ficar "famintas" para uma melhor transfecção plasmíida.
   3. Prepare a mistura de plasmídeos (mix A) contendo 3 μg dos plasmídeos alvos de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 μg da embalagem plasmid PMD2. G e 2 μg da embalagem plasmid PSPAX2. Coma o volume da mistura de A a 150 μL com DMEM sem soro. Prepare a mistura do reagente de transfecção (mix B) adicionando 12 μL do reagente de transfecção (o volume é o dobro da massa total de todos os plasmídeos), e compor o volume da mistura B a 150 μL com DMEM sem soro.
      NOTA: Ao preparar as misturas, é importante adicionar líquido lentamente para evitar bolhas de ar.
   4. Misture a mistura A e misture B depois de deixá-los ficar em pé por 5 minutos à temperatura ambiente. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min para formar o complexo de transfecção.
   5. Retire as células HEK-293T da incubadora, substitua o meio por DMEM + 2% FBS, adicione a mistura da etapa 1.1.4 dropwise e misture o líquido suavemente.
   6. Após 8h, troque o meio com 3,5 mL de meio normal. Depois de mudar o meio, colete o vírus sobrenante a cada 24h e 48 h.
   7. Misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Passe o supernatante através de filtros de 0,45 μm e colete-o em um tubo cônico estéril de 50 mL.
      NOTA: O vírus coletado às 24h pode ser armazenado a 4 °C e misturado com o vírus coletado às 48h.
   8. Concentre o vírus sobrenante por centrifugação a 6000 × g a 4 °C durante a noite (~16 h). Certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico após a centrifugação.
   9. Despeje o supernatante lentamente. Dissolva a pelota do vírus em um volume de meio normal que é 1/100^do volume do vírus supernante. Usando uma micropipette P1000, pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea seja obtida. Divida o vírus concentrado em tubos de microcentrifuuagem conforme necessário. Armazenar a −80 °C.
      NOTA: O vírus está concentrado 100x com este método. O vírus concentrado (100x) pode ser armazenado por >1 ano a −80 °C. Evite o congelamento repetido e o descongelamento do vírus.
2. Detecção de titulação de vírus concentrado (Figura 1C)
   1. Placa 1 × 10^células HEK-293T em um poço de uma placa de 6 poços. Lembre-se de adicionar um bem como um controle negativo. Cultura essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
   2. Adicione 0,1 μL ou 0,2 μL de vírus concentrado fluorescente (100x) a cada poço após 24 horas, e adicione 4 ng/μL do reagente de transfecção polimérica cationic a cada poço. Cerca de 8-12 h após a infecção, substitua o meio por meio normal.
      NOTA: Para garantir a precisão e eficiência da detecção de fluorescência, a taxa de infecção deve ser de 10 a 30%. Adicionar 0,1 μL ou 0,2 μL do vírus concentrado fluorescente pode manter a eficiência da infecção dentro desta faixa. O titulador de vírus concentrado pode atingir 1 × 10⁸ unidades transdutoras (TU)/mL pelo menos.
   3. Aproximadamente 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) para remover células mortas.
   4. Trypsinize essas células usando 250 μL de 0,05% de trypsin-EDTA por poço em uma placa de 6 poços para 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C e, em seguida, remover o sobrenatante.
   5. Resuspenque a pelota celular em 1 mL de PBS, adicione a suspensão a um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e detecte a eficiência da infecção da fluorescência do vírus (proteína fluorescente verde, GFP⁺) usando citometria de fluxo.
   6. Calcule o titulador concentrado do vírus usando a seguinte fórmula: 10⁵ (volume celular) × taxa de infecção (GFP⁺%)/volume de vírus adicionado (0,1 μL ou 0,2 μL).

2. Reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos (Figura 2A)

1. Cubra um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 15-30 min. Certifique-se de que o poço está completamente coberto com a solução de gelatina de 0,1%. Aspire a solução de gelatina de 0,1% após o revestimento.
   NOTA: Prepare 0,1% solução de gelatina (100 mL) da seguinte forma: 0,1 g de gelatina em pó é dissolvido em 100 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro autoclaved e depois armazenado a 4 °C por no máximo 2 meses.
2. Placa 5 × 10⁴ MEFs em um poço de uma placa de 6 poços revestida com 0,1% de gelatina (como na etapa 2.1), e cultivar essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ durante a noite.
3. Após 24 h, confirme que os MEFs atingiram 40-50% de confluência. Substitua o meio por meio normal.
4. No dia 0, retire o vírus concentrado do congelador e derreta o vírus no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando eq. (1). Adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de acordo com o volume calculado, e depois adicione 4 μg/mL do agente de transfecção polimérica cáfônica.
   Número celular (5 × 10⁴) × 30 (multiplicidade de infecção, MOI)/titulante de vírus (1)
5. No dia 1, 8-12 h após a infecção, remova o meio contendo o vírus e substitua-o por um meio normal fresco, adicionando 0,5 μg/mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.
6. No dia 2, 48 h após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Primeiro, altere 1^{/4 do} volume médio total e adicione 3 μM CHIR99021.
7. Do dia 3 ao dia 7, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-se por uma maior proporção de meio de reprogramação (ver Tabela 1) gradualmente, e mude para meio de reprogramação completa dentro de 5 dias.
   NOTA: Durante este período, a puromicina e CHIR99021 devem ser utilizadas todos os dias. Muitas células mortas aparecerão no primeiro e segundo dia de mudança do meio de reprogramação. Isso é normal à medida que as células gradualmente se adaptam à transformação. Portanto, o meio precisa ser alterado gradualmente para garantir a proliferação saudável das células.
8. Para passar as células, adicione 500 μL de 0,05% de trypsin-EDTA para digerir as células por 3 minutos à temperatura ambiente. Quando ~60% das células flutuarem para cima, pare a digestão adicionando meio normal 2x o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL, centrífuga a 200 × g por 5 min a 4 °C, remova o supernasce, resuspenque a pelota celular com o meio de reprogramação e coloque as células em um prato estéril de 60 mm a uma densidade de 3 × 10⁴/cm². Cultume essas células a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO₂ .
   NOTA: Do dia 8 ao dia 21, essas células são subculturadas a cada 3-5 dias e cultivadas em pratos estéreis de 60 mm para expandir. Eles podem ser cultivados para alcançar pelo menos a passagem 5.

3. Otimização para reprogramação direta e identificação

1. Triagem para os fatores de transcrição otimizados
   1. Repita as etapas 2.1-2.7, reduzindo um dos seis fatores de transcrição de cada vez. Infecte os MEFs com o vírus com combinações de cinco fatores de transcrição.
   2. Sete dias após a infecção, extrair o RNA dessas células¹⁶ e analisar os níveis de expressão de seus genes melanócitos usando PCR de transcrição reversa (RT-PCR)¹⁷ para testar os fatores de transcrição com maior impacto na conversão para melanócitos, removendo-os um a um (Figura 3A).
   3. Use os três principais fatores de transcrição que afetam a conversão para melanócitos para infectar os MEFs. Repetir as etapas 2.1-2.7.
      NOTA: Sete dias após a infecção, os genes melanocíticos devem ser detectáveis nessas células transformadas (Figura 3B). As informações de primer para caracterização de iMels estão incluídas na Tabela 3.
2. Identificação de melanócitos induzidos (iMels)
   1. Use a coloração de imunofluorescência¹⁸ para verificar se os iMels expressam proteínas melanocíticas, incluindo TYRP-1 e DCT (Figura 4A).
   2. Mancha específica de melanina 3,4-dihidroxyfenylalanina (DOPA) (Figura 4B)
      1. Prepare 4% paraformaldeído (10 mL) da seguinte forma: dissolver 0,4 g de pó de paraformaldeído em 10 mL PBS. Coloque a solução em forno a 56 °C por 2h para promover a dissolução.
         NOTA: A solução pode ser mantida a 4 °C por no máximo um mês.
      2. Cultura os iMels em um prato de 30 mm e lavar o prato duas vezes com PBS pré-aquecido. Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído para fixar as células por 20 minutos, e lave o prato 3 vezes com PBS.
      3. Prepare 0,1% solução de mancha DOPA (10 mL) pouco antes de usar dissolvendo 0,01 g de pó L-DOPA em 10 mL de PBS. Coloque a solução em um banho de água a 37 °C por 30 min; sacudi-lo várias vezes para promover a dissolução.
      4. Adicione 1 mL de solução de coloração DOPA recém-preparada de 0,1%. Incubar em forno a 37 °C por 2-5 h. Se não houver partículas marrom-pretas, continue a incubar a 37 °C por mais 2 h, mas não por >5 h. Verifique as amostras a cada 30 minutos.
      5. Lave o prato 3 vezes com PBS por 1 min cada vez. Manche o núcleo com 1 mL de solução de coloração de hematoxilina por 2 min.
      6. Para armazenamento a longo prazo, desidratar as amostras usando 95% de etanol por 3 min e depois 100% etanol por 5 min. Sele o prato com xileno e bálsamo neutro.
   3. Mancha masson-fontana específica de melanina (Figura 4B)
      1. Placa iMels em um prato de 30 mm e fixar as células com 4% de paraformaldeído por 20 min; lave o prato 3 vezes com PBS.
      2. Adicione 1 mL de solução A (solução prata amônia) do kit de coloração Masson-Fontana (ver Tabela de Materiais), coloque o prato em uma caixa escura e coloque a caixa escura em um forno a 56 °C por 15-40 min.
         NOTA: Se as partículas marrom-pretas não forem visíveis após 15 minutos no forno, devolva as amostras ao forno de 56 °C para continuar incubando, mas não por >40 min. Um pouco de água pode ser adicionada à caixa escura para evitar a secagem.
      3. Solução aspirada A e lave o prato 5-6 vezes com água destilada, 1-2 min cada vez.
      4. Adicione 1 mL de solução B (solução hipo) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.
      5. Aspirar solução B e lavar o prato com água da torneira 3 vezes, 1 min cada vez.
      6. Adicione 1 mL de solução C (corante vermelho neutro) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.
      7. Aspirar solução C e lavar o prato 3 vezes com água destilada, 1 min cada vez.
      8. Adicione 1 mL de 100% de etanol para desidratação rápida, e aspire o etanol após 3 min.
         NOTA: As amostras manchadas podem ser armazenadas por muito tempo após a vedação com xileno e bálsamo neutro.

Resultados

Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs.

O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (

Discussão

A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortaliz...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	Stored at -20 °C
0.45 μM filter	Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube	Falcon	352052
95%/100% ethanol	LANBAO	210106	Stored at RT
Adenine	Sigma	A2786	Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody	Millipore	MABC592	Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody	Abcam	ab74073	Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM
Cholera toxin	Sigma	C8052	Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stored at 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Stored at RT
FBS	Gibco	10270-106	Stored at -20 °C Heat-inactivated before use
Gelatin	Sigma	G9391	Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stored at -20 °C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	Stored at RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stored at RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit	Solarbio	G2032	Stored at 4 °C
Neutral balsam	Solarbio	G8590	Stored at 4 °C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Stored at RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL
Puromycin	Gibco	A11138-03	Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF	Invitrogen	13256-029	Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin	Sigma	I3536	Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF	R&D	255-SC-010	Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stored at 4 °C
Xylene	Sigma	1330-20-7	Stored at RT