Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Resumen

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca²⁺ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Resumen

El Ca²⁺ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca^2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca²⁺ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca^2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca^2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca^{2 +,} así como las interacciones astrocito-neurona.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca²⁺ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca^2+. La absorción mitocondrial de Ca²⁺ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca²⁺en condiciones fisiológicas^1,2,3,4. La sobrecarga mitocondrial de Ca²⁺ también es un determinante para la muerte celular, incluyendo necrosis y apoptosis en diversos trastornos cerebrales^5,6,7. Provoca la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTPs) y la liberación del cofactor caspasa, que inician la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, es importante estudiar la dinámica y el manejo del Ca²⁺ mitocondrial en las células vivas para comprender mejor la fisiología y la patología celular.

Las mitocondrias mantienen la homeostasis de Ca²⁺ de la matriz a través de un equilibrio entre la absorción de Ca²⁺ y el eflujo. La absorción mitocondrial de Ca²⁺ está mediada principalmente por uniportadores mitocondriales de Ca²⁺ (MCU), mientras que el eflujo mitocondrial de Ca²⁺ está mediado por los intercambiadores Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) y los intercambiadores H⁺/ Ca^{2 +} (mHCX)⁸. El equilibrio puede ser perturbado a través de la estimulación de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR)⁹. La homeostasis mitocondrial de Ca²⁺ también se ve afectada por la amortiguación mitocondrial por la formación de complejos insolubles xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Los cambios intracelulares y mitocondriales en la concentración de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) pueden evaluarse mediante indicadores fluorescentes o luminiscentes de Ca^2+. La unión de Ca²⁺ a los indicadores provoca modificaciones espectrales, lo que permite el registro de células libres [Ca^2+]en tiempo real en células vivas. Actualmente hay dos tipos de sondas disponibles para monitorear los cambios de Ca²⁺ en las células: indicadores químicos orgánicos e indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI). En general, diferentes variantes con diferentes afinidades de Ca²⁺ (basadas en K_d),propiedades espectrales (longitudes de onda de excitación y emisión), rangos dinámicos y sensibilidades están disponibles para las preguntas biológicas bajo investigación. Aunque se han utilizado muchos indicadores sintéticos orgánicos de Ca²⁺ para imágenes de Ca²⁺ citosólico, solo unos pocos pueden cargarse selectivamente en la matriz mitocondrial para imágenes mitocondriales de Ca^2+, siendo Rhod-2 el más utilizado (para revisiones ver^10,11). Sin embargo, Rhod-2 tiene un gran inconveniente de fuga durante los experimentos de largo plazo; además, se divide entre mitocondrias, otros orgánulos y el citosol, dificultando las mediciones absolutas en diferentes subcompartimentos. Por el contrario, mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y secuencias de orientación de compartimentos subcelulares, los GECI se pueden expresar en diferentes tipos de células y compartimentos subcelulares para imágenes de Ca²⁺ específicas de células y compartimentos in vitro o in vivo. Los indicadores GCaMP Ca²⁺ basados en la intensidad de fluorescencia de longitud de onda única han surgido recientemente como los principales GECI^{12,13,14,15,16.} En este artículo, proporcionamos un protocolo para la orientación de las mitocondrias y la expresión específica del tipo celular de GCaMP5G y GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) en astrocitos y neuronas, y la obtención de imágenes de la absorción mitocondrial de Ca^{2 +} en estos tipos de células. Usando este protocolo, se puede revelar la expresión de GCaMP6G/6s en mitocondrias individuales, y se puede lograr la absorción de Ca²⁺ en resolución mitocondrial única en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo.

Protocolo

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia.

1. Construcción de plásmidos de ADN

NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial.

1. Insertar la secuencia dirigida a la matriz mitocondrial (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ en los sitios de clonación EcoRI y BamHI en la columna vertebral del plásmido del virus adenoasociado (AAV) pZac2.1 para obtener plásmidos que contengan promotor astrocítico gfaABC₁D o promotor neuronal CaMKII^18,19,20.
2. Subclón GCaMP5G/6s en los sitios de clonación BamH I y Not 1 en los plásmidos anteriores para obtener nuevos plásmidos pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s y pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s que se dirigen a la expresión transgénica en mitocondrias en astrocitos y neuronas^20,21 (Figura 1A).
3. Preparar plásmidos de ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s para transfección para estudio in vitro (Sección 2). Producir vectores AAV con serotipo 5 para astrocitos y serotipo 9 para neuronas para estudio in vivo ¹⁸ (Sección 3).

2. Imágenes de Ca²⁺ mitocondrial in vitro en astrocitos y neuronas

1. Preparar astrocitos primarios de la corteza de ratones neonatales P1 y neuronas primarias de la corteza de embriones E15-16^18,22,23,24,y cultivarlos en fundas de vidrio de 12 mm de diámetro en placas de 24 pocillos utilizando el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y medio basal neuronal (NBM) que contiene 2% de B27, respectivamente.
2. Transfectar astrocitos y neuronas maduras con plásmidos pZac-gfaABC1D-GCaMP6s y pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizando reactivo de transfección basado en lípidos para expresar GCaMP6s en las mitocondrias de los astrocitos y GCaMP5G en las mitocondrias de las neuronas^18,20,21. Transfecta células en cada pozo con 0,5 μg de ADN, y cambia el medio 6 h más tarde.
   NOTA: Los astrocitos y las neuronas están listos para la obtención de imágenes 1-2 días después de la transfección.
3. Realizar imágenes mitocondriales in vitro de Ca²⁺ 1-2 días después de la transfección.
   1. Transfiera los cubrehojas de vidrio cultivados con astrocitos o neuronas a la cámara de perfusión PH-1 bajo un microscopio de epifluorescencia o dos fotones.
   2. Estimular la absorción astrocítica mitocondrial de Ca²⁺ con 100 μM de ATP en ACSF, o estimular las mitocondrias neuronales con 100 μM de glutamato/10 μM de glicina^20,25 (Figura 2 y Figura 3).
      NOTA: Los cambios en la solución de ACSF a ACSF que contienen ATP y glutamato/glicina están controlados por un sistema de perfusión ALA-VM8²¹. La velocidad del cambio de solución se controla a 1-2 ml/min ajustando una válvula.

3. Imágenes mitocondriales in vivo de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas

1. Preparaciones AAV.
   1. Preparar los siguientes vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) utilizando los plásmidos de ADN preparados en la sección 1: vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G y rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      NOTA: En este experimento, se prepararon vectores rAAV del serotipo 5 para expresar GCaMP5G en mitocondrias en astrocitos y vectores rAAV del serotipo 9 para expresar GCaMP6s en mitocondrias en neuronas.
2. Inyección estereotáxica de AAV.
   1. Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
      NOTA: Más tarde durante la cirugía, los niveles de isoflurano se reducen al 2%.
   2. Después de que el ratón alcance un nivel quirúrgico de anestesia, según lo determinado por el pellizco de la cola y el dedo del pie, afeite el cabello sobre el sitio de la cirugía, la corteza motora o somatosensorial, con un recortador de cabello.
   3. Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para protegerlos durante la cirugía. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía.
      NOTA: Realice la cirugía utilizando procedimientos asépticos. Todas las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave o en un esterilizador de cuentas calientes.
   4. Después de montar el ratón en el dispositivo estereotáxico, esterilice el cuero cabelludo con exfoliantes alternados a base de yodo y etanol al 70% tres veces. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer el sitio de inyección.
   5. Abra la piel en el eje bregma-lamda y cree un orificio de rebabas de ~ 1 mm de diámetro con un taladro de alta velocidad en la ubicación de inyección prevista del motor o la corteza somatosensorial.
   6. Utilice una jeringa Hamilton de 33 G que contenga virus adenoasociados (vectores rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 10¹¹ GC] o vectores rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 10¹¹ GC]) para inyectar hasta 1 μL de virus en el área objetivo.
      NOTA: Por ejemplo, para la administración viral cortical, inyecte la solución del virus a dos profundidades en varios pasos. Primero, inserte la aguja a una profundidad de 1 mm desde la duramadre y espere 5 minutos para que el cerebro se recupere. Luego, mueva la aguja hasta ~ 700 μm de profundidad e inyecte 500 nL de la solución de virus a una velocidad de inyección de 10 nL / s usando una jeringa hamilton controlada por un controlador de bomba de microjeringa. Después de completar la inyección, espere 5 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro. Luego, mueva la aguja hasta el segundo lugar de inyección a una profundidad de 300 μm. Aquí, inyecte 500 nL adicionales de la solución del virus. Espere 10 minutos para permitir que el virus se difunda en el cerebro.
   7. Cierre el cuero cabelludo y la piel con un adhesivo tisular. Deje que los ratones se recuperen en la almohadilla térmica. Envíe los ratones de regreso a la instalación de animales después de la recuperación.
3. Intalación de ventana craneal e imágenes in vivo de dos fotones (2-P) de señales mitocondriales de Ca^2+.
   NOTA: La implantación de la ventana craneal se realiza 3 semanas después de la inyección de AAV sobre la corteza motora o somatosensorial^26,27,28,29. El carprofeno (10 mg/kg) se inyecta por vía subcutánea para aliviar el dolor potencial antes de la cirugía. Los procedimientos quirúrgicos de ventana craneal son idénticos a los procedimientos quirúrgicos de inyección de AAV y se realizan en condiciones asépticas.
   1. Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano.
      NOTA: Esta es la dosis inicial y se reduce al 2% para la cirugía más adelante. Durante la toma de imágenes, se utiliza una inyección intraperitoneal (IP) de 130 mg de ketamina/10 mg de xilazina/kg de peso corporal disuelto en ACSF para la anestesia.
   2. Coloque el mouse en el dispositivo estereotáxico del mouse y fije la cabeza con barras para los oídos. Aplique ungüento oftálmico en los ojos. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C durante toda la cirugía.
      NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas.
   3. Haga una incisión de 5-8 mm de largo en la línea media del cuero cabelludo y retire un colgajo de piel con un par de tijeras.
   4. Después de exponer el cráneo, realice una craneotomía de 2.0-3.0 mm de diámetro utilizando un taladro de alta velocidad sobre el área inyectada por el virus (es decir, la corteza motora o la corteza somatosensorial, Figura 1B). Primero, haga cuatro agujeros pequeños y luego perfore a lo largo de un círculo que conecte los agujeros. Luego, levante y retire el hueso con tijeras afiladas y retírelo. La duramadre expuesta se puede quitar o mantener intacta para la impantación de la ventana craneal.
   5. Coloque una cubierta de vidrio de 3-5 mm de diámetro que lleve una silicona transparente sobre la craneotomía. Use un palillo de dientes para empujar la ventana craneal suavemente sobre la superficie del cerebro. Luego, selle el borde con una pequeña cantidad de adhesivo de silicona.
      NOTAS: Alternativamente, en lugar de disco de silicona, se puede usar un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1.2% entre el vidrio de la cubierta y el tejido cerebral.
   6. Finalmente, selle los bordes de la cubierta con cemento dental. Tenga cuidado de aplicar el cemento ligeramente en el borde de la ventana craneal para una unión fuerte. Coloque una placa de cabeza de metal hecha a medida en el cráneo con cemento dental.
      NOTA: La placa de metal se utiliza para fijar la cabeza del ratón a la etapa del microscopio 2-P durante la sesión de imágenes(Figura 1C).
   7. Agregue 0,5 ml de solución de ACSF sobre la cubierta de la ventana craneal para la inmersión en agua durante la toma de imágenes.
   8. Realizar imágenes time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G en astrocitos y mito-GCaMP6s en neuronas con longitud de onda de 910 nm a través de la ventana craneal(Figura 1C)^18,20,27.
      NOTA: Durante la toma de imágenes, los ratones están en la almohadilla térmica para mantener la temperatura fisiológica. Los ratones serán sacrificados inmediatamente después de que se complete la sesión de imágenes.
   9. Etiquetar astrocitos in vivo con sulforhodamine 101 (SR101) cuando sea necesario determinar la colocalización.
      1. Al final del paso 3.3.4, aplicar 100 μL de 100 μM SR101 en ACSF sobre la superficie cortical durante 1-5 min.
      2. Enjuague la superficie con ACSF para lavar el SR101 sin encuadernar. Utilizando imágenes 2-P, el co-etiquetado de mito-GCaMP5G y SR101 en astrocitos se puede observar 45-60 minutos más tarde (Figura 4A).

Resultados

El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca²⁺ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca²⁺ in vitro e in vivo.

Señalización in vitro mitocondrial de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas cultivadas

Discusión

En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de ne...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight