유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

요약

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

미토콘드리아 Ca^2+는 세포경색 Ca²⁺ 버퍼링, 에너지 대사 및 세포 신호 변환을 제어하는 데 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 Ca^2+의 과부하는 신경 질환의 신경 변성 및 세포 사멸을 포함한 다양한 병리학 적 조건에 기여합니다. 여기서 우리는 시험관 내 및 생체 내 성상세포 및 뉴런에서 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징을 위한 분자 접근법을 표적으로 하는 세포 형 특이성 및 미토콘드리아를 제시한다. 미토콘드리아 표적을 유전적으로 인코딩한 DNA 플라스미드(GECIs) GCaMP5G 또는 GCaMP6s(GCaMP5G/6s)와 성상세포 및 뉴런 특이적 프로모터 gfaABC1D 및 CaMKII 및 미토콘드리아 표적 시퀀스(미토콘드리아 표적 시퀀스)를 생성했습니다. 시험관 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징의 경우, 플라스미드는 GCaMP5G/6s를 발현하기 위해 배양된 성상세포 및 뉴런에서 전형되었다. 생체 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징의 경우, 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 마우스 뇌에 주입하여 성상세포및 뉴런의 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 발현하였다. 우리의 접근 은 성상 세포와 뉴런의 미토콘드리아 Ca²⁺ 역학을 이미지화하여 세포와 미토콘드리아 Ca^{2 +} 신호 사이의 관계뿐만 아니라 성상 세포 뉴런 상호 작용 사이의 관계를 연구하는 유용한 방법을 제공합니다.

서문

미토콘드리아는 동적 세포 세포 세포 기관이며 에너지 생산을위한 세포 강국으로 간주됩니다. 한편, 미토콘드리아는 국소 또는 세포색 Ca²⁺ 상승에 대응하여 매트릭스에 Ca^2+를 차지할 수 있다. 미토콘드리아 Ca²⁺ 섭취량은 삼환산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 반응과 같은 대사 과정을 포함한 미토콘드리아 기능에 영향을 미치며, 생리조건 하에서 Ca²⁺민감한 단백질을 조절한다^1,2,3,4. 미토콘드리아 Ca²⁺ 과부하는 또한 다양한 뇌^{질환5,6,7에서}괴사 및 세포멸을 포함하는 세포 사멸을 위한 결정요인이다. 그것은 미토콘드리아 투과성 전이 모공 (mPTPs)의 개방과 세포 사멸 세포 죽음을 시작하는 caspase 공동 인자의 방출을 일으킵니다. 따라서, 세포 생리학 및 병리학을 더 잘 이해하기 위하여 살아있는 세포에 있는 미토콘드리아 Ca²⁺ 역학 및 취급을 공부하는 것이 중요합니다.

미토콘드리아는 Ca²⁺ 섭취량과 효능 사이의 균형을 통해 매트릭스 Ca²⁺ 항상성을 유지합니다. 미토콘드리아 Ca²⁺ 섭취량은 주로 미토콘드리아 Ca²⁺ 유니포터(MCUs)에 의해 매개되며, 미토콘드리아 Ca²⁺ efflux는 Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ 교환기(NCLXs) 및 H⁺/Ca²⁺ 교환기(mHCX)^8에의해 중재된다. 균형은 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)^9의자극을 통해 교란 될 수있다. 미토콘드리아 Ca²⁺ 항상성 또한 용해성 xCa²⁺-xPO₄x-xOH 복합체^8의형성에 의해 미토콘드리아 버퍼링에 의해 영향을 받습니다.

Ca²⁺ 농도([Ca^2+])의세포내 및 미토콘드리아 변화는 형광 또는 발광 Ca²⁺ 지표에 의해 평가될 수 있다. 지표에 결합Ca²⁺ 라이브 셀에서 실시간으로 무료 셀룰러 [Ca^2+]를기록 할 수 있도록 스펙트럼 수정을 야기한다. 두 가지 유형의 프로브는 현재 세포의 Ca²⁺ 변화를 모니터링할 수 있습니다: 유기 화학 지표 및 유전자 인코딩된 Ca²⁺ 지표(GECIs). 일반적으로, 다른 Ca²⁺ 친화성(Kd 기준), 스펙트럼 특성(흥분 및 방출 파장), 동적 범위 및 민감성을 가진 다른 변이체는 조사 중인 생물학적 질문에 사용할 수 있습니다. 많은 합성 유기 Ca²⁺ 지표는 세포성 Ca²⁺ 이미징에 사용되었지만, 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징을 위한 미토콘드리아 매트릭스에 선택적으로 적재될 수 있으며, 로드-2가 가장 널리 사용되고 있습니다(리뷰는^{10,11참조).} 그러나, Rhod-2는 긴 시간 과정 실험 도중 누설의 중요한 단점이 있습니다; 또한 미토콘드리아, 다른 소기관 및 사이토솔 사이에 분할되어 다른 서브컴터에서 절대 측정이 어려워집니다. 대조적으로, 세포형 특이적 프로모터 및 세포전 구획 표적화 서열을 이용하여, GECI는 체외 또는 생체 내에서 세포 및 구획 별 Ca²⁺ 이미징을 위한 상이한 세포 유형 및 세포전 구획으로 발현될 수 있다. 단일 파장 형광 강도 계 GCaMP Ca²⁺ 지표는 최근 주요 GECIs^{12,13,14,15,16으로}부상했다. 이 문서에서는, 우리는 성상세포 및 뉴런에서 GCaMP5G 및 GCaMP6s (GCaMP5G/6s)의 미토콘드리아 표적화 및 세포 형 특이적 발현을 위한 프로토콜을 제공하고, 이러한 세포 모형에 있는 미토콘드리아 Ca²⁺ 섭취를 화상 진찰합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 개별 미토콘드리아에서 GCaMP6G/6s의 발현이 드러나고, 단일 미토콘드리아 분해능에서 Ca²⁺ 섭취는 시험관내 및 생체내성상세포에서 달성될 수 있다.

프로토콜

동물과 관련된 절차는 미주리 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. DNA 플라스미드 건설

참고: 시험관 내 및 생체 내 이미징의 경우, 성상세포 및 뉴런 특이적 프로모터 및 미토콘드리아 표적 시퀀스를 사용하여 GCaMP5G/6s를 인코딩하는 DNA 플라스미드가 생성됩니다.

1. 미토콘드리아 매트릭스(MM)-표적화 서열(mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGCGGGGGGGGGGGGGCGGCGGCGGGGGGGGGGGCGGGGGGGGGCGGCCCGGCGGCCGGGCGGGGGGGCGGCCGGCCCCGTGCGCCGCGCCAA 가트CCATTCG TTG¹⁷ 복제 부위에코리 및 밤HI는 아데노 관련 바이러스(AAV) 플라스미드 pZac2.1의 중추에서 성상체 gfaABC₁D 프로모터 또는 뉴런 CaMKII 프로모터^18,19,20을함유한 플라스미드를 획득한다.
2. 서브클론 GCaMP5G/6s 는 복제 부위에 BamH I 및 Not 1을 위의 플라스미드에서 획득하여 새로운 플라스미드 pZac-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G/6s 및 pZac-CaMKII-Mito-GCaMP5G/6s를 획득하여 미토콘디아시리아에서유전자 발현을 표적으로 하는^20개 뉴런(20).
3. 시험관 내 연구를 위한 트랜스퍼바이스용 pZac-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G 및 pZac-CaMKII-Mito-GCaMP6s DNA 플라스미드를 준비한다(섹션 2). 생체 내 ^연구를 위한 뉴런용 성상세포 및 혈청형 9용 세로형 5형(3절)을 가진 AAV 벡터를 생성한다( 섹션 3).

2. 성상세포및 뉴런에서 체외 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징

1. E1 신생아 마우스의 피질과 E15-16 배아^{18,22,23,24의}피질로부터 1차 성상세포를 준비하고 12mm 직경유리 커버립에 배양합니다. 덜벡코의 변형독수리 매체(DMEM)를 사용하는 24웰 플레이트는 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유하고 있으며, 2% B27을 함유한 뉴런 기저배지(NBM), 각각.
2. 트랜스펙트 성숙한 성상세포및 뉴런pZac-gfaABC1D-GCaMP6s 및 pZac-CaMKII-GCaMP5G 플라스미드를 사용하여 지질 계 형 트랜스페이언시약을 사용하여 성상 세포와 GCaMP5G의 미토콘드리아에서 GCaMP6s를 발현하기 위해 뉴런^18,201. DNA의 0.5 μg를 가진 각 우물의 트랜스펙트 세포는 6 시간 후에 배지를 변경합니다.
   참고: 성상 세포와 뉴런은 형질 전환 후 1-2 일 동안 이미징할 준비가 되어 있습니다.
3. 체외 미토콘드리아 Ca²⁺ 화상 진찰 1-2 일 후에 수행합니다.
   1. 상화세포 또는 뉴런으로 배양된 유리 커버립을 EPIfluorescence 또는 2개의 광자 현미경하에서 PH-1 관류 챔버로 옮는다.
   2. ACSF에서 100 μM ATP로 성상체 미토콘드리아 Ca²⁺ 섭취를 자극하거나, 100 μM 글루타메이트/10 μM 글리신^20,25(도 2 및도 3)로뉴런 미토콘드리아를 자극한다.
      참고: ACSF에서 ATP로의 솔루션 변경 및 글루타민/글리신 함유 ACSF는 ALA-VM8 관류^{시스템(21)에}의해 제어된다. 밸브를 조정하여 솔루션 교체 속도를 1-2mL/min으로 제어합니다.

3. 생체 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 성상세포 및 뉴런에서 이미징

1. AAV 준비.
   1. rAAV2/5-gfaABC1D-미토-GCaMP5G 및 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 벡터에서 제조된 DNA 플라스미드를 사용하여 다음과 같은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 준비한다.
      참고: 본 실험에서, 혈청형 5의 rAAV 벡터는 혈청형 9의 성상세포 및 rAAV 벡터에서 미토콘드리아에서 GCaMP5G를 발현할 준비가 되어 뉴런에서 미토콘드리아에서 GCaMP6s를 발현할 수 있었다.
2. 스테레오 탁스 AAV 주입.
   1. 마우스를 3% 이소플루란으로 마취합니다.
      참고: 수술 중 나중에 이소플루란 수치가 2%로 감소합니다.
   2. 마우스가 마취의 수술 수준에 도달 한 후, 꼬리와 발가락 핀치에 의해 결정, 수술 부위, 모터 또는 somatosensory 피질, 머리 트리머와 함께 머리를 면도.
   3. 마우스 스테레오탁스 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 고정합니다. 수술 중 안과 연고를 눈에 적용하여 보호하십시오. 가열 패드를 사용하여 수술 내내 마우스의 체온을 37 °C에서 유지하십시오.
      참고: 무균 절차를 사용하여 수술을 수행합니다. 모든 수술 도구는 오토클레이브 또는 뜨거운 비드 멸균기로 멸균되어야 합니다.
   4. 마우스가 스테레오탁스 장치에 장착된 후, 요오드 기반 스크럽과 70% 에탄올을 3번 번 으로 두피를 살균합니다. 주사 부위를 노출하기 위해 두피의 중간선에 절개를 합니다.
   5. 브레그마-라다 축에서 피부를 열고 모터 또는 소마토 감각 피질의 의도된 주입 위치에서 고속 드릴로 ~1mm 직경의 버 구멍을 만듭니다.
   6. 아데노 관련 바이러스(rAAV2/5-gfaABC1D-Mito-GCaMP5G 벡터[1 x 10¹¹ GC] 또는 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 벡터[1 x 10¹¹ GC]를 함유한 33G 해밀턴 주사기를 사용하여 1μ바이러스 의 1μ까지 주입한다.
      참고: 예를 들어, 피질 바이러스 전달의 경우 바이러스 솔루션을 여러 단계로 두 깊이에서 주입합니다. 먼저 바늘을 두라에서 1mm 깊이로 삽입하고 뇌가 회복할 수 있도록 5분이 허용합니다. 이어서, 바늘을 ~700 μm 깊이까지 이동하고 마이크로주링펌프 컨트롤러에 의해 제어되는 해밀턴 주사기를 사용하여 10nL/s의 사출 속도로 500nL의 바이러스 용액을 주입한다. 주사가 완료 된 후, 바이러스가 뇌로 확산 될 수 있도록 5 분 기다립니다. 그런 다음 바늘을 300 μm 깊이에서 두 번째 주입 위치로 이동합니다. 여기서, 바이러스 용액의 추가 500 nL을 주입한다. 바이러스가 뇌로 확산 될 수 있도록 10 분 기다립니다.
   7. 조직 접착제를 사용하여 두피와 피부를 닫습니다. 쥐가 가열 패드에서 회복하도록하십시오. 복구 후 동물 시설로 마우스를 다시 보내십시오.
3. 두개골 창 실및 생체 내 2-광자 (2-P) 미토콘드리아 Ca²⁺ 신호의 이미징.
   참고: 두개골 창 이식은 3주 후 AAV 주입 후 모터 또는 소마토 감각^{피질(26,27,28,29)을}통해 수행됩니다. Carprofen (10 mg/kg) 수술 전에 잠재적인 통증에서 구호를 제공 하기 위해 피하 주입. 두개골 창 외과 적 절차는 AAV 주사 수술 절차와 동일하며 무균 조건에서 수행됩니다.
   1. 마우스를 3% 이소플루란으로 마취합니다.
      참고: 이것은 초기 복용량 및 감소 2% 나중에 수술에 대 한. 이미징 하는 동안, 내 peritoneal (IP) 주입 130 mg 케타민/10 mg 자일라진/kg 체중 ACSF에 용해 된 마취에 사용 됩니다.
   2. 마우스 스테레오탁스 장치에 마우스를 배치하고 이어 바으로 머리를 고정합니다. 안과 연고를 눈에 바치게 합니다. 가열 패드를 사용하여 수술 내내 마우스의 체온을 37 °C에서 유지하십시오.
      참고: 모든 수술 도구를 소독해야 합니다.
   3. 두피 의 중간선에 5-8mm 길이의 절개를하고 가위 쌍을 사용하여 피부플랩을 제거합니다.
   4. 두개골이 노출된 후, 바이러스 주입 영역(즉, 모터 피질 또는 소마토 감각 피질, 도 1B)을통해 고속 드릴을 사용하여 2.0-3.0mm 직경의 두개골 절제술을 수행합니다. 먼저 네 개의 작은 구멍을 만들어 구멍을 연결하는 원을 따라 드릴합니다. 그런 다음 날카로운 가위로 뼈를 들어 올리고 제거합니다. 노출된 듀라 메이트는 두개골 창의 방해를 위해 제거하거나 그대로 보관할 수 있습니다.
   5. 직경 3-5mm의 유리 커버슬립을 두개부 절제술 위에 투명 실리콘을 장착합니다. 이쑤시개를 사용하여 두개골 창을 뇌 표면으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 소량의 실리콘 접착제로 가장자리를 밀봉하십시오.
      참고 : 또는 실리콘 디스크 대신 1.2 % 낮은 융점 아가로즈 젤은 커버 유리와 뇌 조직 사이에 사용할 수 있습니다.
   6. 마지막으로, 치과 시멘트로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 강한 결합을 위해 두개골 창의 가장자리에 시멘트를 약간 적용하십시오. 치과 시멘트와 두개골에 사용자 정의 만든 금속 헤드 플레이트를 부착합니다.
      참고: 금속판은 이미징세션(도 1C)에서마우스의 머리를 2-P 현미경의 단계로 고정하는 데 사용됩니다.
   7. 이미징 중에 물에 잠기위해 두개골 창의 커버슬립 위에 ACSF 용액 0.5mL를 추가합니다.
   8. 두개골 창을 통해 910 nm 파장을 가진 뉴런에서 성상 세포 및 미토-GCaMP6s에서 미토-GCaMP5G의 생체 2-P 이미징에서 시간^경과를수행(도 1C)^18,20,27.
      참고 : 이미징 하는 동안, 마우스생리성 온도를 유지 하기 위해 가열 패드에. 마우스는 이미징 세션이 완료된 직후에 희생됩니다.
   9. 상시화를 결정할 필요가 있는 경우 설포호다민 101(SR101)을 사용하여 생체내성상세포에 라벨을 부착한다.
      1. 3.3.4 단계의 끝에서, 1-5 분 동안 피질 표면에 ACSF에 100 μM SR101의 100 μL을 적용합니다.
      2. ACSF로 표면을 헹니 언바운드 SR101을 씻어내도록 합니다. 2-P 이미징을 사용하여, 성상세포에서 미토-GCaMP5G 및 SR101의 공동 라벨링은 45-60분 후에 관찰될 수있다(그림 4A).

결과

이 연구의 목적은 시험관 내 및 생체내 성상세포 및 뉴런에서 GECIs를 사용하여 미토콘드리아 Ca²⁺ 신호를 이미지하는 방법론을 제공하는 것이었습니다. 시험관 내 및 생체 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 이미징의 결과는 여기에서 제시됩니다.

시험관 내 미토콘드리아 Ca²⁺ 배양 된 성?...

토론

이 문서에서는 성상 세포와 뉴런에서 미토콘드리아 Ca²⁺ 신호를 이미징하는 방법과 프로토콜을 제공합니다. 우리는 GECI GCaMP5G/6s를 표현하기 위하여 미토콘드리아 표적화 및 세포 모형 특정 전략을 구현했습니다. 미토콘드리아에서 GCaMP5G/6s를 대상으로 하기 위해 플라스미드에 미토콘드리아 표적 시퀀스를 포함시켰습니다. 생체 내 성상 세포및 뉴런에서GCaMP5G/6s를 표현하기 위해, 우?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight