Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Riepilogo

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca²⁺ in astrociti e neuroni.

Abstract

Il Ca²⁺ mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel controllo del buffering citosolico di Ca^2+, del metabolismo energetico e della trasduzione del segnale cellulare. Il sovraccarico di Ca²⁺ mitocondriale contribuisce a varie condizioni patologiche, tra cui la neurodegenerazione e la morte cellulare apoptotica nelle malattie neurologiche. Qui presentiamo un approccio molecolare specifico per tipo cellulare e mitocondri per l'imaging mitocondriale Ca²⁺ in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. Abbiamo costruito plasmidi di DNA che codificano gli indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) con promotori astrociti e neuronali specifici gfaABC1D e CaMKII e sequenza di targeting dei mitocondri (mito-). Per l'imaging mitocondriale in vitro Di Ca^2+, i plasmidi sono stati trasfettati in astrociti e neuroni in coltura per esprimere GCaMP5G/6s. Per l'imaging mitocondriale in vivo di Ca^2+, sono stati preparati vettori virali adeno-associati (AAV) e iniettati nel cervello del topo per esprimere GCaMP5G/6s nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni. Il nostro approccio fornisce un mezzo utile per visualizzare la dinamica mitocondriale Ca²⁺ in astrociti e neuroni per studiare la relazione tra segnalazione citosolica e mitocondriale Ca^2+, così come le interazioni astrociti-neuroni.

Introduzione

I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici e sono considerati le centrali cellulari per la produzione di energia. D'altra parte, i mitocondri possono assorbire Ca²⁺ alla matrice in risposta a aumenti locali o citosolici di Ca^2+. L'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ influenza la funzione mitocondriale, compresi i processi metabolici come le reazioni nel ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la fosforilazione ossidativa, e regola le proteine sensibili al Ca²⁺in condizioni fisiologiche^1,2,3,4. Il sovraccarico mitocondriale di Ca²⁺ è anche un fattore determinante per la morte cellulare, compresa la necrosi e l'apoptosi in vari disturbi cerebrali^5,6,7. Provoca l'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTPs) e il rilascio di cofattore caspasi, che avvia la morte cellulare apoptotica. Pertanto, è importante studiare la dinamica e la manipolazione mitocondriale di Ca²⁺ nelle cellule viventi per comprendere meglio la fisiologia e la patologia cellulare.

I mitocondri mantengono l'omeostasi della matrice Ca²⁺ attraverso un equilibrio tra l'assorbimento di Ca²⁺ e l'efflusso. L'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ è mediato principalmente dagli uniportatori mitocondriali Di Ca²⁺ (MCU), mentre l'efflusso mitocondriale di Ca²⁺ è mediato dagli scambiatori Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) e dagli scambiatori H⁺/Ca²⁺ (mHCX)⁸. L'equilibrio può essere perturbato attraverso la stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)⁹. L'omeostasi mitocondriale di Ca²⁺ è anche influenzata dal tamponamento mitocondriale dalla formazione di complessi insolubili xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Le variazioni intracellulari e mitocondriali della concentrazione di Ca²⁺ ([Ca^2+])possono essere valutate mediante indicatori fluorescenti o luminescenti di Ca^2+. Il legame di Ca²⁺ agli indicatori provoca modifiche spettrali, consentendo la registrazione di cellule libere [Ca^2+]in tempo reale in cellule vive. Attualmente sono disponibili due tipi di sonde per monitorare i cambiamenti di Ca²⁺ nelle cellule: indicatori chimici organici e indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI). Generalmente, diverse varianti con diverse affinità di Ca²⁺ (basate su K_d),proprietà spettrali (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione), intervalli dinamici e sensibilità sono disponibili per le questioni biologiche in esame. Sebbene molti indicatori organici sintetici di Ca²⁺ siano stati utilizzati per l'imaging citosolico di Ca^2+, solo pochi possono essere caricati selettivamente nella matrice mitocondriale per l'imaging mitocondriale Ca^2+, con Rhod-2 che è il più utilizzato (per le recensioni vedi^10,11). Tuttavia, Rhod-2 ha un grosso svantaggio di perdite durante esperimenti a lungo termine; inoltre, è suddiviso tra mitocondri, altri organelli e il citosol, rendendo difficili le misurazioni assolute in diversi sottocompartimenti. Al contrario, utilizzando promotori specifici per tipo cellulare e sequenze di targeting del compartimento subcellulare, i GECI possono essere espressi in diversi tipi di cellule e compartimenti subcellulari per l'imaging Ca²⁺ specifico per cellula e compartimento in vitro o in vivo. Gli indicatori GCaMP Ca²⁺ basati sull'intensità di fluorescenza a lunghezza d'onda singola sono recentemente emersi come principali GECI^{12,13,14,15,16.} In questo articolo, forniamo un protocollo per il targeting dei mitocondri e l'espressione specifica del tipo cellulare di GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrociti e neuroni e l'imaging dell'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ in questi tipi di cellule. Utilizzando questo protocollo, l'espressione di GCaMP6G/6s nei singoli mitocondri può essere rivelata e l'assorbimento di Ca²⁺ in risoluzione mitocondriale singola può essere ottenuto in astrociti e neuroni in vitro e in vivo.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Missouri-Columbia.

1. Costruzione di plasmidi a DNA

NOTA: Per l'imaging in vitro e in vivo, vengono costruiti plasmidi di DNA che codificano GCaMP5G/6s con promotori astrociti e neuroni specifici e sequenze di targeting mitocondriale.

1. Inserire matrice mitocondriale (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ nei siti di clonazione EcoRI e BamHI nella spina dorsale del plasmide adeno-associato (AAV) pZac2.1 per ottenere plasmidi contenenti promotore astrocitico gfaABC₁D o promotore caMKII neuronale^18,19,20.
2. Subclone GCaMP5G/6s nei siti di clonazione BamH I e Non 1 nei plasmidi di cui sopra per ottenere nuovi plasmidi pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s che mirano all'espressione transgenica nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni^20,21 (Figura 1A).
3. Preparare i plasmidi del DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s per la trasfezione per lo studio in vitro (Sezione 2). Produrre vettori AAV con sierotipo 5 per gli astrociti e sierotipo 9 per i neuroni per lo studio in vivo ¹⁸ (Sezione 3).

2. Imaging mitocondriale In vitro Ca²⁺ in astrociti e neuroni

1. Preparare astrociti primari dalla corteccia di topi neonatali P1 e neuroni primari dalla corteccia degli embrioni E15-16^{18,22,23, 24}e coltivarli su coperture di vetro di 12 mm di diametro in piastre a 24 pozzetti utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e il mezzo basale neuronale (NBM) contenente il 2% di B27, rispettivamente.
2. Trasfettare astrociti e neuroni maturi con pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e plasmidi pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizzando reagenti di trasfezione a base lipidica per esprimere GCaMP6 nei mitocondri degli astrociti e GCaMP5G nei mitocondri dei neuroni^18,20,21. Trasfettate le cellule in ogni pozzetto con 0,5 μg di DNA e cambiate il mezzo 6 ore dopo.
   NOTA: Gli astrociti e i neuroni sono pronti per l'imaging 1-2 giorni dopo la trasfezione.
3. Eseguire l'imaging mitocondriale in vitro Ca²⁺ 1-2 giorni dopo la trasfezione.
   1. Trasferire le coperture di vetro coltivate con astrociti o neuroni nella camera di perfusione PH-1 sotto un microscopio a epifluorescenza o due fotoni.
   2. Stimolare l'assorbimento astrocitico mitocondriale di Ca²⁺ con 100 μM di ATP in ACSF, o stimolare i mitocondri neuronali con 100 μM di glutammato/10 μM di glicina^20,25 (Figura 2 e Figura 3).
      NOTA: le modifiche della soluzione da ACSF ad ACSF contenente ATP e glutammato/glicina sono controllate da un sistema di perfusione ALA-VM8²¹. La velocità del cambio di soluzione è controllata a 1-2 ml/min regolando una valvola.

3. Imaging mitocondriale In vivo Ca²⁺ in astrociti e neuroni

1. Preparazioni AAV.
   1. Preparare i seguenti vettori di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) utilizzando i plasmidi del DNA preparati nella sezione 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vettori.
      NOTA: In questo esperimento, i vettori rAAV del sierotipo 5 sono stati preparati per esprimere GCaMP5G nei mitocondri negli astrociti e i vettori rAAV del sierotipo 9 sono stati preparati per esprimere GCaMP6 nei mitocondri nei neuroni.
2. Iniezione stereotassica di AAV.
   1. Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
      NOTA: Più tardi durante l'intervento chirurgico, i livelli di isoflurano sono ridotti al 2%.
   2. Dopo che il topo raggiunge un livello chirurgico di anestesia, come determinato dal pizzico della coda e della punta, radere i capelli sul sito chirurgico, sulla corteccia motoria o somatosensoriale, con un tagliacapelli.
   3. Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per proteggerli durante l'intervento chirurgico. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico.
      NOTA: Eseguire interventi chirurgici utilizzando procedure asettiche. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave o con uno sterilizzatore a caldo.
   4. Dopo che il mouse è stato montato sul dispositivo stereotassico, sterilizzare il cuoio capelluto con scrub alternato a base di iodio e etanolo al 70% tre volte. Fare un'incisione nella linea mediana del cuoio capelluto per esporre il sito di iniezione.
   5. Aprire la pelle nell'asse bregma-lamda e creare un foro di bava di circa 1 mm di diametro con un trapano ad alta velocità nella posizione di iniezione prevista del motore o della corteccia somatosensoriale.
   6. Utilizzare una siringa Hamilton da 33 G contenente virus adeno-associato (vettori rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 10¹¹ GC] o vettori rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 10¹¹ GC]) per iniettare fino a 1 μL di virus nell'area bersaglio.
      NOTA: ad esempio, per la somministrazione virale corticale, iniettare la soluzione virale a due profondità in più passaggi. In primo luogo, inserire l'ago a una profondità di 1 mm dalla dura e consentire 5 minuti per il recupero del cervello. Quindi, spostare l'ago fino a ~ 700 μm di profondità e iniettare 500 nL della soluzione virale ad una velocità di iniezione di 10 nL/s utilizzando una siringa hamilton controllata da un controller della pompa a microsiringa. Al termine dell'iniezione, attendere 5 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. Quindi, spostare l'ago fino alla seconda posizione di iniezione a una profondità di 300 μm. Qui, iniettare altri 500 nL della soluzione virale. Attendere 10 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello.
   7. Chiudere il cuoio capelluto e la pelle utilizzando un adesivo tissutale. Lascia che i topi si riprendano sulla piastra riscaldante. Rimanda i topi alla struttura per animali dopo il recupero.
3. Installazione della finestra cranica e imaging in vivo a due fotoni (2-P) dei segnali mitocondriali Ca^2+.
   NOTA: L'impianto della finestra cranica viene eseguito 3 settimane dopo l'iniezione di AAV sulla corteccia motoria o somatosensoriale^26,27,28,29. Carprofene (10 mg / kg) viene iniettato per via sottocutanea per fornire sollievo dal potenziale dolore prima dell'intervento chirurgico. Le procedure chirurgiche della finestra cranica sono identiche alle procedure chirurgiche di iniezione AAV e vengono eseguite in condizioni asettiche.
   1. Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
      NOTA: Questa è la dose iniziale e ridurre al 2% per l'intervento chirurgico in seguito. Durante l'imaging, per l'anestesia viene utilizzata un'iniezione intraperitoneale (IP) di 130 mg di ketamina/10 mg di xilazina/kg di peso corporeo disciolto in ACSF.
   2. Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico agli occhi. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico.
      NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati.
   3. Fai un'incisione di 5-8 mm di lunghezza nella linea mediana del cuoio capelluto e rimuovi un lembo di pelle usando un paio di forbici.
   4. Dopo che il cranio è stato esposto, eseguire la craniotomia di 2,0-3,0 mm di diametro utilizzando un trapano ad alta velocità sull'area iniettata dal virus (ad esempio, corteccia motoria o corteccia somatosensoriale, Figura 1B). In primo luogo, fare quattro piccoli fori, quindi praticare in un cerchio che collega i fori. Quindi, sollevare e rimuovere l'osso con forbici affilate e rimuovere. La dura madre esposta può essere rimossa o mantenuta intatta per l'impantazione della finestra cranica.
   5. Posizionare una copertura di vetro di 3-5 mm di diametro che trasporta un silicone trasparente sopra la craniotomia. Usa uno stuzzicadenti per spingere delicatamente la finestra cranica sulla superficie del cervello. Quindi, sigillare il bordo con una piccola quantità di adesivo siliconico.
      NOTE: In alternativa, invece del disco di silicone, è possibile utilizzare gel di agarosio a basso punto di fusione all'1,2% tra il vetro di copertura e il tessuto cerebrale.
   6. Infine, sigillare i bordi del coperchio con cemento dentale. Fare attenzione ad applicare leggermente il cemento sul bordo della finestra cranica per un forte incollaggio. Attaccare una piastra metallica su misura al cranio con cemento dentale.
      NOTA: La piastra metallica viene utilizzata per fissare la testa del mouse allo stadio del microscopio 2-P durante la sessione di imaging (Figura 1C).
   7. Aggiungere 0,5 mL di soluzione ACSF sopra il coperchio sulla finestra cranica per l'immersione in acqua durante l'imaging.
   8. Eseguire l'imaging 2-P time-lapse in vivo di mito-GCaMP5G in astrociti e mito-GCaMP6 in neuroni con lunghezza d'onda di 910 nm attraverso la finestra cranica(Figura 1C)^18,20,27.
      NOTA: durante l'imaging, i topi sono sulla piastra riscaldante per mantenere la temperatura fisiologica. I topi saranno sacrificati immediatamente dopo il completamento della sessione di imaging.
   9. Etichettare gli astrociti in vivo con sulforodamina 101 (SR101) quando è necessario determinare la colocalizzazione.
      1. Alla fine del passaggio 3.3.4, applicare 100 μL di 100 μM SR101 in ACSF sulla superficie corticale per 1-5 min.
      2. Risciacquare la superficie con ACSF per lavare via l'SR101 non legato. Utilizzando l'imaging 2-P, la co-marcatura di mito-GCaMP5G e SR101 negli astrociti può essere osservata 45-60 minuti dopo (Figura 4A).

Risultati

Lo scopo di questo studio è stato quello di fornire una metodologia per l'immagine di segnali mitocondriali Ca²⁺ utilizzando GECI in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. I risultati dell'imaging mitocondriale Ca²⁺ sia in vitro che in vivo sono presentati qui.

Segnalazione mitocondriale invitro Ca²⁺ in astrociti e neuroni in coltura
L'assorbi...

Discussione

In questo articolo, forniamo un metodo e un protocollo per l'imaging dei segnali mitocondriali Ca²⁺ in astrociti e neuroni. Abbiamo implementato strategie di targeting dei mitocondri e specifiche per tipo cellulare per esprimere GECI GCaMP5G/6s. Per indirizzare GCaMP5G / 6 nei mitocondri, abbiamo incluso una sequenza di targeting dei mitocondri nei plasmidi. Per esprimere GCaMP5G/6s in astrociti e neuroni in vivo,abbiamo inserito un promotore astrocitario specifico gfaABC1D e un promotore neurone-spec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight