遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

要約

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリア^Ca2+ イメージングの方法を提供することを目的としています。

要約

ミトコンドリア^Ca2+は、細胞質^Ca2+緩衝、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達を制御する上で重要な役割を果たしています。ミトコンドリア^Ca2+の過負荷は、神経変性および神経疾患におけるアポトーシス細胞死を含む様々な病理学的状態に寄与する。ここでは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリア^Ca2+イメージングに対する細胞型特異的およびミトコンドリア標的分子アプローチを提示する。ミトコンドリア標的化遺伝子組み換え^Ca2+指標(GECIs)GCaMP5GまたはGCaMP6s(GCaMP5G/6s)をコードするDNAプラスミドをアストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターgfaABC1DおよびCaMKIIおよびミトコンドリアターゲティング配列(ミトコンドリア標的配列)で構築した。インビトロミトコンドリア^Ca2+イメージングでは、PMIDを培養したアストロサイトおよびニューロンにトランスフェクトしてGCaMP5G/6sを発現させた。インビボミトコンドリア^Ca2+イメージングでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を調製し、マウス脳に注入し、アストロサイトおよびニューロンのミトコンドリアでGCaMP5G/6sを発現させた。我々のアプローチは、細胞質とミトコンドリア^Ca2+シグナル伝達の関係を研究するために、アストロサイトとニューロンにおけるミトコンドリア^Ca2+ダイナミクスを画像化する有用な手段を提供する。

概要

ミトコンドリアは、細胞内の動的な小器官であり、エネルギー生産のための細胞大国と考えられています。一方、ミトコンドリアは、局所的または細胞質^Ca2+上昇に応答して、母体に^Ca2+を取ることができます。ミトコンドリア^Ca2+取り込みは、三カルボン酸(TCA)サイクルおよび酸化リン酸化における反応などの代謝過程を含むミトコンドリア機能に影響を及ぼし、生理学的条件下で^Ca2+感受性タンパク質^{を調節する1、2、3、4。}ミトコンドリア^Ca2+過負荷はまた、細胞死の決定要因であり、様々な脳障害における壊死およびアポトーシスを含む^5、6、7。これは、ミトコンドリア透過性遷移細孔(mpPPs)の開口部とアポトーシス細胞死を開始するカスパーゼ補因子の放出を引き起こす。したがって、細胞生理学と病理をよりよく理解するために、生きている細胞におけるミトコンドリアCa²⁺のダイナミクスと取り扱いを研究することが重要です。

ミトコンドリアは^、Ca2+取り込みと流出のバランスをとってマトリックス^Ca2+ホメオスタシスを維持します。ミトコンドリアCa²⁺取り込みは主にミトコンドリアCa²⁺ユニポーター(MCUs)によって媒介され、ミトコンドリアCa²⁺流出はNa⁺-Ca²⁺-Li⁺交換器(NCLX)とH⁺/Ca²⁺交換器(mHCXs)8によって媒介される。バランスは、Gタンパク質共役受容体(GPDR)9の刺激を通じて摂動することができる。ミトコンドリア^Ca2+ホメオスタシスも、不溶性xCa 2+-xPO4 x-xOH複合体⁸の形成によるミトコンドリア緩衝の影響を受ける。

^細胞内およびミトコンドリア濃度の変化([Ca2+])は、蛍光または発光^Ca2+指標によって評価することができる。標識へのCa²⁺結合はスペクトル修飾を引き起こし、生細胞でのリアルタイムでの自由な細胞^[Ca2+]の記録を可能にする。現在、細胞内の^Ca2+の変化を監視するために、有機化学指標と遺伝的にコード化されたCa²⁺指標(GECI)の2種類のプローブが利用可能です。一般的に、異なるCa²⁺親和性_(Kdに基づく)、スペクトル特性(励起および発光波長)、動的範囲、および感度が調査中の生物学的問題に対して利用可能である異なる変異体が利用可能である。多くの合成有機^Ca2+指標が細胞質^Ca2+イメージングに使用されていますが、ミトコンドリア^Ca2+イメージング用のミトコンドリアマトリックスに選択的にロードできるのはごくわずかですが、Rhod-2が最も広く使用されています(レビューでは^10,11を参照)。しかし、Rhod-2 は、長い時間経過実験の間に漏れの大きな欠点があります。さらに、ミトコンドリア、他のオルガネラ、サイトゾルの間で分割され、異なるサブコンパートメントでの絶対測定が困難になります。対照的に、細胞型プロモーターおよび細胞内区画ターゲティング配列を用いることによって、GECIは、インビトロまたはインビボで細胞およびコンパートメント特異的な^Ca2+イメージング用の異なる細胞タイプおよび細胞下コンパートメントで発現することができる。単一波長蛍光強度ベースのGCaMP Ca²⁺指標は、最近、主要なGEIS^{12、13、14、15、16}として登場しました。本稿では、アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5GおよびGCaMP6s(GCaMP5G/6s)のミトコンドリア標的化および細胞型特異的発現のプロトコルと、これらの細胞タイプにおけるミトコンドリア^Ca2+の取り込みについて説明する。このプロトコルを用いて、個々のミトコンドリアにおけるGCaMP6G/6sの発現が明らかにでき、そして単一ミトコンドリア分解能における^Ca2+取り込みは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおいて達成することができる。

プロトコル

動物に関する手続きは、ミズーリ大学コロンビア校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. DNAプラスミドの構築

注: インビトロ および インビボ イメージングでは、アストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターおよびミトコンドリア標的配列を有するGCaMP5G/6sをコードするDNAプラスミドが構築される。

1. ミトコンドリアマトリックス(MM)ターゲティングシーケンス(ミト-)ATGT CCGTCCCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGGGCTCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAG GATCCATTCG TTG¹⁷クローニング部位にエコRIとバムHIアデノ関連ウイルスの骨格内の(AAV)プラスミドpZac2.1は、アストロサイトgfaABC₁DプロモーターまたはニューロンCaMKIIプロモーター^18、19、20を含むプラスミドを得る。
2. サブクローンGCaMP5G/6sをクローニング部位にBamH IとNot 1を上のプラスミドで、新しいプラスミドpZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6sおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6sのミトコンドリアインストロサイトおよび²¹¹ニューロンで遺伝子の遺伝子発現を標的とする。
3. pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNAプラスミドを インビトロ 試験用トランスフェクション用に準備します(セクション2)。 インビボ 研究¹⁸ のためのニューロンのためのアストロサイトと血清型9のための血清型5でAAVベクターを生成する(セクション3)。

2. インビトロ ミトコンドリアCa²⁺ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング

1. E15-16胚^{18、22、23、24}の皮質からP1新生児マウスおよび一次ニューロンの皮質から一次アストロサイトを調製し^、10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して直径12mmのガラスカバーリップで培養する それぞれ。
2. pZac-gfaABC1D-GCaMP6sおよびpZac-CaMKII-GCaMP5Gプラスミドを有するトランスフェクト成熟した星細胞およびニューロンは、脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、アストロサイトのミトコンドリアおよびGCaMP5GのミトコンドリアでGCaMP6を発現^させる。各ウェルの細胞を0.5μgのDNAでトランスフェクトし、後で培地を6時間変更します。
   注:アストロサイトとニューロンは、トランスフェクションの1〜2日後にイメージングする準備ができています。
3. トランスフェクション後1~2日目 にインビトロ ミトコンドリア^Ca2+ イメージングを行う。
   1. アストロサイトまたはニューロンで培養したガラスのカバーリップを、蛍光または2つの光子顕微鏡下でPH-1灌流室に移します。
   2. ACSFで100 μM ATPで占星ミトコンドリア^Ca2+取り込みを刺激するか、100 μMグルタミン酸/10 μMグリシン^20,25で神経細胞ミトコンドリアを刺激する(図2および図3)。
      注: ACSF から ATP およびグルタミン酸/グリシン含有 ACSF へのソリューションの変更は、ALA-VM8 灌流システム²¹によって制御されます。溶液の変化の速度は弁を調節することによって1-2 mL/minで制御される。

3. 生体内 ミトコンドリアCa²⁺ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング

1. AAV製剤。
   1. セクション1で作成したDNAプラスミドを使用して、次の組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターを調製する:rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびrAAV2/9-CaMKII-ミト-GCaMP6sベクター。
      注:本実験では、血清型5のrAAVベクターを、細胞球中のミトコンドリアでGCaMP5Gを発現し、血清型9のrAAVベクターを作製し、細胞内のミトコンドリアでGCaMP6を発現するように調製した。
2. 立体的なAAV注射。
   1. 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
      注:手術中の後、イオブルランレベルは2%に減少します。
   2. マウスが手術レベルの麻酔に達した後、尾とつま先のピンチによって決定されるように、手術部位、運動または体性感覚皮質の上に髪を剃り、毛トリマーで剃る。
   3. マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼の軟膏を眼に適用して、手術中に保護します。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。
      注:無菌の手順を使用して手術を行います。すべての外科用具は、オートクレーブまたはホットビード滅菌装置によって滅菌される必要があります。
   4. マウスを立体装置に取り付けた後、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールを3回交互に頭皮を殺菌します。注射部位を露出させるために頭皮の正中線に切開を行います。
   5. ブレグマ・ラムダ軸で皮膚を切り開き、運動または体性感覚皮質の意図された注入位置に高速ドリルで〜1mmの直径のバリ穴を作成します。
   6. アデノ関連ウイルス(rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5Gベクター[1 x 10¹¹ GC]またはrAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6sベクター[1 x 10¹¹ GC])を含む33 Gハミルトン注射器を使用して、標的領域に最大1μLのウイルスを注入する。
      注: たとえば、皮質ウイルスの配信の場合は、複数の手順で 2 つの深さでウイルス溶液を注入します。まず、針を硬膜から1mmの深さまで挿入し、脳が回復するために5分を許します。次に、マイクロシリンジポンプコントローラで制御されるハミルトンシリンジを使用して、針を~700 μmの深さまで移動し、500 nLの注入速度で500 nLのウイルス溶液を注入します。注射が完了したら、ウイルスが脳に拡散できるように5分間待ちます。次に、針を300μmの深さで第2の注入位置まで移動します。ここでは、さらに500nLのウイルス溶液を注入する。ウイルスが脳に拡散できるように10分待ちます。
   7. ティッシュ接着剤を使って頭皮と皮膚を閉じます。マウスは、加熱パッド上で回復してみましょう。回復後にマウスを動物施設に送り返す。
3. 頭蓋窓の内接および 生体内2光子(2-P)ミトコンドリア^Ca2+ 信号のイメージング。
   注:頭蓋窓の移植は、運動または体性感覚皮質^{26、27、28、29}の上にAAV注入の3週間後に行われます。カルプロフェン(10mg/kg)は、手術前に潜在的な痛みから救済を提供するために皮下注射される。頭蓋窓の外科処置はAAVの注入の外科プロシージャと同一であり、無菌状態で行われる。
   1. 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
      注:これは最初の用量であり、後で手術のために2%に減らします。イメージングの際、ACSFに溶解した130mgケタミン/10mgのキシラジン/kg体重の腹腔内(IP)注射が麻酔に使用されます。
   2. マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼科軟膏を目に適用する。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。
      注:すべての外科用具は殺菌される必要がある。
   3. 頭皮の中線に長さ5〜8mmの切開を行い、はさみを使用して皮膚のフラップを取り除きます。
   4. 頭蓋骨が露出した後、ウイルス注入領域(すなわち、運動皮質または体性感覚皮質、 図1B)上の高速ドリルを使用して直径2.0〜3.0mmの開頭術を行う。まず、4つの小さな穴を作り、その後、穴を接続する円でドリルします。その後、鋭いはさみで骨を持ち上げて取り除き、取り除きます。露出した硬膜は頭蓋窓の突起のために取除くか、またはそのまま保つことができる。
   5. 透明なシリコーンを担い、直径3~5mmのガラスカバースリップを開きます。爪楊枝を使って頭蓋の窓を脳の表面にそっと押し込みます。次に、少量のシリコーン接着剤で縁を密封する。
      注:または、シリコーンディスクの代わりに、1.2%低融点アガロースゲルは、カバーガラスと脳組織の間で使用することができます。
   6. 最後に、カバースリップの端を歯科用セメントで密封します。強い結合のために頭蓋窓の端にセメントをわずかに適用するように注意してください。歯科用セメントで、カスタムメイドの金属製ヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けます。
      メモ:金属板は、イメージングセッション中にマウスの頭部を2-P顕微鏡のステージに固定するために使用されます(図1C)。
   7. イメージング中に水浸漬のために頭蓋窓のカバースリップの上に0.5 mLのACSFソリューションを追加します。
   8. 脳の窓を通して910 nm波長のニューロンにおける星状細胞およびミトGCaMP6sのミト-GCaMP5Gのイメージングのin vivo 2-Pの時間経過を行う(図1C)、20、27。
      注:イメージング中、マウスは生理学的温度を維持するために加熱パッド上にあります。マウスは、イメージングセッションが完了した直後に犠牲になります。
   9. 共局在化を決定する必要がある場合 には、インビボに スルフォホダミン101(SR101)を標識する。
      1. ステップ3.3.4の終わりに、100 μM SR101の100 μLを1-5分間皮質表面のACSFに塗布して下さい。
      2. ACSF で表面を洗い流して、非結合 SR101 を洗い流します。2-Pイメージングを使用して、星状細胞におけるmito-GCaMP5GおよびSR101の共標識は、45〜60分後に観察することができる(図4A)。

結果

本研究の目的は、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるGECを用いたミトコンドリア^Ca2+シグナルを画像化する方法論を提供することであった。インビトロおよびインビボミトコンドリア^Ca2+イメージングの結果をここに提示する。

培養されたアストロサイトおよびニューロンにおける...

ディスカッション

本稿では、アストロサイトやニューロンにおけるミトコンドリア^Ca2+信号をイメージングする方法とプロトコルを提供します。GECI GCaMP5G/6sを表現するために、ミトコンドリアターゲティングおよび細胞型特異的戦略を実施しました。ミトコンドリアでGCaMP5G/6sを標的にするために、プラスミドにミトコンドリアターゲティング配列を含む。生体内のアストロサイトおよびニューロ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight