Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía por TDP-43

Resumen

La absorción de glucosa aumenta en las neuronas motoras de Drosophila afectadas por la proteinopatía de unión al ADN TAR (TDP-43), según lo indicado por un sensor de glucosa codificado genéticamente basado en FRET.

Resumen

La esclerosis lateral amiotrófica es un trastorno neurodegenerativo que causa debilidad muscular progresiva y muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico. Las manifestaciones clínicas incluyen pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; sin embargo, no está claro cómo se relacionan con la degeneración de las neuronas motoras. Utilizando un modelo de Drosophila de proteinopatía TDP-43 que recapitula varias características de la ELA, incluidas las inclusiones citoplasmáticas, la disfunción locomotora y la reducción de la vida útil, recientemente identificamos déficits metabólicos de amplio alcance. Entre estos, se encontró que la glucólisis estaba regulada al alza y los experimentos de interacción genética proporcionaron evidencia de un mecanismo neuroprotector compensatorio. De hecho, a pesar de la regulación al alza de la fosfofructoquinasa, la enzima limitante de la velocidad en la glucólisis, se demostró que un aumento en la glucólisis mediante manipulaciones dietéticas y genéticas mitiga la disfunción locomotora y aumenta la vida útil en modelos de mosca de la proteinopatía TDP-43. Para investigar más a fondo el efecto de la proteinopatía TDP-43 sobre el flujo glicolítico en las neuronas motoras, se utilizó un sensor basado en FRET codificado genéticamente previamente, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor está compuesto por un dominio bacteriano sensible a la glucosa y proteínas fluorescentes cian y amarillas como el par FRET. Tras la unión a la glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que permite que se produzca FRET. Usando FLII12Pglu-700μδ6, se encontró que la absorción de glucosa aumentaba significativamente en las neuronas motoras que expresan TDP-43^G298S,una variante causante de ELA. Aquí, mostramos cómo medir la absorción de glucosa, ex vivo,en preparaciones larvales del cordón nervioso ventral que expresan el sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Este enfoque se puede utilizar para medir la absorción de glucosa y evaluar el flujo glucolítico en diferentes tipos de células o en el contexto de diversas mutaciones que causan ELA y trastornos neurodegenerativos relacionados.

Introducción

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo que actualmente es incurable. La ELA afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores, lo que lleva a la pérdida de la coordinación motora, parálisis irreversible, insuficiencia respiratoria y eventual muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico¹. La ELA se asocia con defectos metabólicos como pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado en^2); sin embargo, sigue sin estar claro cómo estas alteraciones en el metabolismo se relacionan con la degeneración de la neurona motora. Un denominador común en la ELA y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas es TDP-43, una proteína de unión a ácidos nucleicos implicada en varios pasos del procesamiento del ARN^3,4,5. Aunque las mutaciones en TDP-43 solo afectan al 3%-5% de los pacientes, la proteína TDP-43 de tipo salvaje se encuentra dentro de los agregados citoplasmáticos en >97% de los casos de ELA (revisado en⁶). Esta patología fue modelada en Drosophila por sobreexpresión de tipo salvaje humano o mutante TDP-43 (G298S) en neuronas motoras, que recapitula múltiples aspectos de la ELA, incluyendo inclusiones citoplasmáticas, disfunción locomotora y reducción de la vida útil^7,8. Usando estos modelos, se informó recientemente que la proteinopatía TDP-43 causa un aumento significativo en los niveles de piruvato y ARNm fosfofructoquinasa (PFK), la enzima limitante de la velocidad de la glucólisis^9. Se encontraron aumentos similares en las transcripciones de PFK en las neuronas motoras y la médula espinal derivadas de pacientes, lo que sugiere que la glucólisis está regulada al alza en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Curiosamente, un aumento adicional en la glucólisis utilizando manipulaciones dietéticas y genéticas mitigó varios fenotipos de ELA, como la disfunción locomotora y el aumento de la vida útil en modelos de moscas de proteinopatía TDP-43, consistente con un mecanismo compensatorio y neuroprotector en las neuronas motoras degeneradas.

Para sondear aún más los cambios en la glucólisis y medir la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía TDP-43, un sensor basado en FRET codificado genéticamente flII12Pglu-700μδ6¹⁰ previamente informado se expresó en neuronas motoras utilizando específicamente el sistema de expresión UAS-GAL4. El sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 utiliza la transferencia de energía de resonancia entre dos variantes de proteína fluorescente verde, proteínas fluorescentes cian y amarillas (CFP y YFP) para detectar glucosa a nivel celular. Consiste en un dominio de unión a glucosa bacteriana del gen MglB de E. coli fusionado con CFP y YFP en extremos opuestos de la molécula. Cuando se une a una molécula de glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que acerca cfP y YFP y permite que ocurra FRET, que luego se puede usar para cuantificar los niveles de glucosa intracelular^10,11,12 (Figura 1). Aquí, mostramos cómo el sensor FLII12Pglu-700μδ6 se puede utilizar para determinar los cambios en la absorción de glucosa causados por la proteinopatía TDP-43 en las neuronas motoras. Los experimentos descritos aquí muestran que la sobreexpresión de un mutante asociado a la ELA, TDP-43^G298S,en las neuronas motoras causa un aumento significativo en la absorción de glucosa en comparación con los controles. Este enfoque se puede utilizar en otros tipos de ELA (por ejemplo, SOD1, C9orf72, etc.) y / u otros tipos de células (por ejemplo, glía, músculos) para determinar los cambios en la absorción de glucosa asociados con la neurodegeneración.

Protocolo

Las moscas transgénicas UAS FLII12Pglu-700μδ6 fueron reportadas en Volkenhoff et al.¹⁰ y amablemente proporcionadas por el Dr. S. Schirmeier. Las líneas transgénicas UAS TDP-43^G298S fueron amablemente proporcionadas por el Dr. T. Iwatsubo¹³. Las líneas recombinantes de Drosophila que albergan transgenes UAS FLII12Pglu-700μδ6 y UAS TDP-43 se generaron en el laboratorio zarnescu utilizando enfoques genéticos estándar y se informaron en Manzo et al.⁹. D42 GAL4 se utilizó para impulsar la expresión del sensor de glucosa solo o junto con TDP-43^G298S en neuronas motoras. Todas las líneas de mosca se mantienen en medios de harina de maíz de melaza, a 25 °C en 12 h de ciclo oscuro:claro.

1. Disecciones del cordón nervioso ventral de Drosophila (VNC)

1. Haga platos de disección de elastómero de silicona.
   1. Vierta los componentes del elastómero de silicona en un tubo de 50 ml como se indica en el protocolo del fabricante y revuelva bien.
   2. Llene los platos de cultivo de tejidos de 35 mm con aproximadamente 2 ml de la mezcla de elastómeros. Use una jeringa para eliminar cualquier burbuja. Cubra los platos y colóquelos sobre una superficie nivelada en un horno de 60 ° C durante la noche para curar.
2. Diseccionar larvas de Drosophila para exponer el VNC mientras se mantiene la viabilidad del tejido.
   1. Recoja una tercera larva instar errante, enjuague con ddH₂O y luego colóquela en una gota de tampón HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sacarosa, 5 mM trehalosa, 5 mM HEPES; pH 7.1) en un plato forrado de elastómero.
   2. Usando un par de fórceps (# 5 o 55 fórceps) bajo un microscopio de disección, fije los extremos anterior y posterior del lado dorsal de la larva hacia arriba, estirando cuidadosamente la larva a lo largo con alfileres de insectos (Pines de Minutein).
   3. Haga una incisión justo encima del pasador posterior con un par de tijeras de iris en ángulo. Haga un corte vertical a partir de la incisión hacia el extremo anterior de la larva.
   4. Agregue unas gotas de búfer HL-3 si es necesario. Retire la tráquea y el resto de los órganos flotantes sin perturbar el SNC. Fije los colgajos que estiran la pared del cuerpo para exponer el SNC mientras mantiene intacto el sistema neuromuscular (VNC, axones y uniones neuromusculares).

2. Adquisición de imágenes

1. Optimice los parámetros de imagen.
   1. Encienda el microscopio y los láseres antes de comenzar las disecciones. Las imágenes deben adquirirse utilizando un microscopio confocal vertical con una lente de inmersión en agua de 40x. Utilice un láser de 405 nm para excitar CFP y adquirir las imágenes en los canales de detección CFP (465-499 nm) y FRET (535-695 nm).
   2. Optimice los parámetros de adquisición, como la velocidad de escaneo (6), el promedio (2), el objetivo (40x), el zoom (1x), el tamaño estenopeico (1 UA) y la resolución espacial (512 x 512). Ajuste la ganancia de tal manera que la señal esté en el rango dinámico óptimo. Se deben utilizar los mismos parámetros para todos los genotipos.
2. Imagen de neuronas motoras dentro del VNC.
   1. Coloque el plato de silicona con la muestra diseccionada debajo de la lente. Baje el cristalino para que entre en contacto con el tampón HL3 de trehalosa-sacarosa (véase 1.2.1). Es fundamental asegurarse de que la lente esté completamente sumergida en el búfer. Agregue más búfer si es necesario.
   2. Utilice los canales CFP y FRET para seleccionar manualmente una sección óptica que consta de al menos 6 neuronas motoras enfocadas, ubicadas a lo largo de la línea media VNC. Las neuronas motoras se identifican en función de la expresión del sensor de glucosa y la posición a lo largo del eje anterior-posterior.
   3. Adquiere imágenes cada 10 s durante 10 min. Estas imágenes representan la línea de base.
3. Estimular con glucosa suplementada con HL-3.
   1. Retire la trehalosa-sacarosa que contiene tampón HL3 con una pipeta Pasteur y reemplácela con 5 mM de glucosa suplementada con HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM de sacarosa, 5 mM de glucosa, 5 mM HEPES, pH 7.1). Este paso debe realizarse con mucho cuidado, para evitar el movimiento del VNC tanto como sea posible.
   2. Adquiere imágenes cada 10 s durante otros 10 min. Estas imágenes representan la fase de estimulación.
4. Guarde las imágenes como archivos .czi o cualquier tipo de archivo compatible con el software de imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha, los antecedentes genéticos, la condición experimental (línea de base o estimulación) y los canales utilizados.
5. Reutilizar los parámetros para obtener imágenes de todos los genotipos(Figura 2A).

3. Procesamiento de imágenes y selección de ROI

1. Abra los archivos czi en Fiji/ImageJ y establezca Modo de color: Escala de grises,elija Ver pila con: Hyperstacky seleccione Dividir canales en ventanas separadas.
2. Procese imágenes utilizando los plugins de corrección de deriva: turboreg y stackreg. Cada canal se corrige por separado seleccionando Stackreg en Pluginsy, a continuación, elija Transformación: Traducción.
3. Seleccione manualmente las regiones de interés (ROI) para extraer el valor gris medio de cada canal.
   1. Elija el ROI rastreando todas las neuronas motoras que permanecen enfocadas durante toda la serie de tiempo. Utilice el administrador de ROI para guardar cada contorno de neurona motora.
   2. Utilice la función Multimedida para medir el valor gris medio en cada ROI en cada punto de tiempo. Copie los ROI trazados desde el primer canal hasta el segundo canal para la imagen de preestimulación.
   3. Repita este proceso para las imágenes posteriores a la estimulación en cada canal utilizando las mismas células/ ROI seleccionadas para la imagen de preestimulación.

4. Análisis de datos

1. Calcule la relación FRET/CFP, utilizando los valores grises medios para los canales FRET y CFP. Los cambios en las relaciones FRET/CFP reflejan alteraciones en la concentración intracelular de glucosa.
   1. Traza las relaciones FRET/CFP para cada ROI y punto de tiempo frente al tiempo. Dentro de cada VNC, algunos de los ROI exhibirán una caída en las relaciones FRET / CFP después de la estimulación.
      NOTA: Esto se interpreta como una incapacidad de algunas neuronas para absorber glucosa, posiblemente debido al estrés causado por las disecciones y, por lo tanto, se eliminan del análisis. Las relaciones FRET/CFP restantes para cada ROI y punto de tiempo se promedian para generar una única relación FRET/CFP por punto de tiempo por genotipo (sensor de glucosa solo y sensor de glucosa con TDP-43^G298S). Estas relaciones FRET/CFP únicas se utilizan para todas las normalizaciones posteriores. Se analizaron 31 ROI para los controles del sensor de glucosa y se analizaron 24 ROI para TDP-43^G298S.
2. Normalización basal: Calcule el promedio de las relaciones FRET/CFP durante los primeros 10 minutos (línea de base) y luego normalice las relaciones FRET/CFP individuales para cada punto de tiempo de todo el experimento hasta el promedio de referencia de 10 minutos (consulte la Figura 2B).
3. Normalización del punto de tiempo: Normalice las relaciones TDP-43^G298S FRET/CFP a las relaciones FRET/CFP solo desde el sensor de glucosa en cada punto de tiempo (ver Figura 3A).
4. Gráficos de barras: Para las comparaciones de línea de base versus estimulación en forma de gráficos de barras, use relaciones FRET/CFP de 5-10 min (línea de base) y 15-20 min (estimulación) para cada genotipo. Normalizar la relación de estimulación con respecto a la relación basal (ver Figura 3B).

5. Análisis estadísticos

1. Evalúe los conjuntos de datos normalizados utilizando la corrección de Mann-Whitney (para las normalizaciones basales y de punto de tiempo) o la prueba de Kruskall-Walis (para la representación de gráficos de barras de la estimulación frente a las relaciones FRET/CFP basales).

Resultados

Adquisición de imágenes del sensor de glucosa en el cordón nervioso ventral (VNC), ex vivo
Para determinar las diferencias en la absorción de glucosa en un modelo de ELA de Drosophila basado en TDP-43, se utilizó un sensor de glucosa basado en FRET codificado genéticamente. El sensor comprendía CFP y YFP fusionados al dominio de unión a glucosa del gen E. coli MglB. La unión a la glucosa provoca un cambio conformacional, que puede detectarse media...

Discusión

La técnica descrita en detalle aquí se puede aplicar para medir la absorción de glucosa en un tipo celular específico de interés en Drosophila viva utilizando FLII12Pglu-700μδ6, un sensor basado en FRET que puede detectar cambios en los niveles de glucosa a un rango milimolar^10,11,12. Este sensor se ha utilizado previamente en conjunto con el sistema UAS-GAL4 para dirigir su expresión a tipos celulares específi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A