Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Riepilogo

L'assorbimento del glucosio è aumentato nei motoneuroni Drosophila affetti da proteinopatia TDP-43 (TAR DNA binding protein), come indicato da un sensore di glucosio geneticamente codificato basato su FRET.

Abstract

La sclerosi laterale amiotrofica è una malattia neurodegenerativa che causa progressiva debolezza muscolare e morte entro 2-5 anni dalla diagnosi. Le manifestazioni cliniche includono perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo; tuttavia, non è chiaro come questi si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Utilizzando un modello di Drosophila della proteinopatia TDP-43 che ricapitola diverse caratteristiche della SLA tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e durata della vita ridotta, abbiamo recentemente identificato deficit metabolici ad ampio raggio. Tra questi, la glicolisi è risultata sovraregolata e gli esperimenti di interazione genetica hanno fornito prove di un meccanismo neuroprotettivo compensatorio. Infatti, nonostante l'upregulation della fosfofruttochinasi, l'enzima limitante la velocità nella glicolisi, un aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha dimostrato di mitigare la disfunzione locomotoria e aumentare la durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43. Per studiare ulteriormente l'effetto sulla proteinopatia TDP-43 sul flusso glicolitico nei motoneuroni, è stato utilizzato un sensore basato su FRET geneticamente codificato precedentemente riportato, FLII12Pglu-700μδ6. Questo sensore è composto da un dominio batterico di rilevamento del glucosio e da proteine fluorescenti ciano e gialle come coppia FRET. Dopo il legame con il glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che consente il FRET. Utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, l'assorbimento di glucosio è risultato significativamente aumentato nei motoneuroni che esprimono TDP-43^G298S,una variante che causa la SLA. Qui, mostriamo come misurare l'assorbimento di glucosio, ex vivo, in preparati del cordone nervoso ventrale larvale che esprimono il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 nel contesto della proteinopatia TDP-43. Questo approccio può essere utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio e valutare il flusso glicolitico in diversi tipi di cellule o nel contesto di varie mutazioni che causano la SLA e le relative malattie neurodegenerative.

Introduzione

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva attualmente incurabile. La SLA colpisce i motoneuroni superiori e inferiori portando alla perdita della coordinazione motoria, alla paralisi irreversibile, all'insufficienza respiratoria e all'eventuale morte entro 2-5 anni dalla diagnosi¹. La SLA è associata a difetti metabolici come perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo (esaminato in²); tuttavia, non è chiaro come queste alterazioni del metabolismo si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Un denominatore comune nella SLA e nelle malattie neurodegenerative correlate è il TDP-43, una proteina legante l'acido nucleico coinvolta in diverse fasi dell'elaborazione dell'RNA^3,4,5. Sebbene le mutazioni in TDP-43 colpiscano solo il 3%-5% dei pazienti, la proteina TDP-43 wild-type si trova all'interno di aggregati citoplasmatici in >97% dei casi di SLA (esaminata in⁶). Questa patologia è stata modellata in Drosophila sovraespressione di wildtype umano o mutante TDP-43 (G298S) nei motoneuroni, che ricapitola molteplici aspetti della SLA, tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e ridotta durata della vita^7,8. Utilizzando questi modelli, è stato recentemente riportato che la proteinopatia TDP-43 provoca un aumento significativo dei livelli di piruvato e dell'mRNA della fosfofruttochinasi (PFK), l'enzima limitante la velocità della glicolisi⁹. Aumenti simili nei trascritti PFK sono stati trovati nei motoneuroni derivati dal paziente e nel midollo spinale, suggerendo che la glicolisi è sovraregolata nel contesto della proteinopatia TDP-43. È interessante notare che l'ulteriore aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha mitigato diversi fenotipi della SLA come la disfunzione locomotoria e l'aumento della durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43, coerente con un meccanismo compensatorio e neuroprotettivo nei motoneuroni degenerati.

Per sondare ulteriormente i cambiamenti nella glicolisi e misurare l'assorbimento del glucosio nei modelli Drosophila della proteinopatia TDP-43, un sensore basato su FRET geneticamente codificato FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ precedentemente riportato è stato espresso nei motoneuroni utilizzando specificamente il sistema di espressione UAS-GAL4. Il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 utilizza il trasferimento di energia di risonanza tra due varianti di proteina fluorescente verde, proteine fluorescenti ciano e gialle (CFP e YFP) per rilevare il glucosio a livello cellulare. Consiste in un dominio di legame batterico del glucosio dal gene E. coli MglB fuso a CFP e YFP alle estremità opposte della molecola. Quando è legato a una molecola di glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che avvicina CFP e YFP e consente il FRET, che può quindi essere utilizzato per quantificare i livelli di glucosio intracellulare^10,11,12 (Figura 1). Qui, mostriamo come il sensore FLII12Pglu-700μδ6 può essere utilizzato per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio causati dalla proteinopatia TDP-43 nei motoneuroni. Gli esperimenti qui descritti mostrano che la sovraespressione di un mutante associato alla SLA, TDP-43^G298S, nei motoneuroni provoca un aumento significativo dell'assorbimento del glucosio rispetto ai controlli. Questo approccio può essere utilizzato in altri tipi di SLA (ad esempio, SOD1, C9orf72, ecc.) e / o altri tipi di cellule (ad esempio, glia, muscoli) per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio associati alla neurodegenerazione.

Protocollo

Le mosche transgeniche UAS FLII12Pglu-700μδ6 sono state riportate in Volkenhoff et al.¹⁰ e gentilmente fornite dal Dr. S. Schirmeier. Le linee transgeniche UAS TDP-43^G298S sono state gentilmente fornite dal Dr. T. Iwatsubo^13. Le linee di Drosophila ricombinanti che ospitano entrambi i transgeni UAS FLII12Pglu-700μδ6 e UAS TDP-43 sono state generate nel laboratorio di Zarnescu utilizzando approcci genetici standard e riportate in Manzo et al.⁹. D42 GAL4 è stato utilizzato per guidare l'espressione del sensore di glucosio da solo o insieme a TDP-43^G298S nei motoneuroni. Tutte le linee di mosca sono mantenute su terreni di farina di mais melassa, a 25 °C in 12 ore di ciclo buio-luce.

1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) dissezioni

1. Realizzare piatti di dissezione in elastomero siliconico.
   1. Versare i componenti in elastomero siliconico in un tubo da 50 ml come indicato nel protocollo del produttore e mescolare bene.
   2. Riempire piatti di coltura tissutale da 35 mm con circa 2 ml di miscela di elastomero. Utilizzare una siringa per rimuovere eventuali bolle. Coprire i piatti e metterli su una superficie piana in un forno a 60 °C durante la notte per indurire.
2. Sezionare le larve di Drosophila per esporre il VNC mantenendo la vitalità dei tessuti.
   1. Raccogliere una terza larva instar errante, risciacquare con ddH₂O, quindi metterla in una goccia di tampone HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM saccarosio, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES; pH 7,1) su un piatto rivestito in elastomero.
   2. Usando un paio di pinze (# 5 o 55 pinze) sotto un microscopio sezionante, appuntare le estremità anteriore e posteriore della larva lato dorsale verso l'alto, allungando attentamente la larva longitudinalmente con spilli per insetti (Minutein Pins).
   3. Fai un'incisione appena sopra il perno posteriore usando un paio di forbici angolate dell'iride. Fai un taglio verticale partendo dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva.
   4. Aggiungere alcune gocce di buffer HL-3, se necessario. Rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il SNC. Blocca i lembi che allungano la parete del corpo per esporre il SNC mantenendo intatto il sistema neuromuscolare (VVNC, assoni e giunzioni neuromuscolari).

2. Acquisizione di immagini

1. Ottimizzare i parametri di imaging.
   1. Accendere il microscopio e i laser prima di iniziare le dissezioni. Le immagini devono essere acquisite utilizzando un microscopio confocale verticale con una lente ad immersione in acqua 40x. Utilizzare un laser a 405 nm per eccitare la CFP e acquisire le immagini in entrambi i canali di rilevamento CFP (465-499 nm) e FRET (535-695 nm).
   2. Ottimizza i parametri di acquisizione come velocità di scansione (6), media (2), obiettivo (40x), zoom (1x), dimensione stenopeica (1 AU) e risoluzione spaziale (512 x 512). Regolare il guadagno in modo tale che il segnale sia nella gamma dinamica ottimale. Gli stessi parametri devono essere utilizzati per tutti i genotipi.
2. Immagine dei motoneuroni all'interno del VNC.
   1. Posizionare il piatto in silicone con il campione sezionato sotto la lente. Abbassare la lente in modo che entri in contatto con il tampone HL3 di trealosio-saccarosio (vedere 1.2.1). È fondamentale assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer. Aggiungere più buffer, se necessario.
   2. Utilizzare i canali CFP e FRET per selezionare manualmente una sezione ottica composta da almeno 6 motoneuroni a fuoco, situati lungo la linea mediana VNC. I motoneuroni vengono identificati in base all'espressione del sensore di glucosio e alla posizione lungo l'asse anteriore-posteriore.
   3. Acquisisci immagini ogni 10 s per 10 min. Queste immagini rappresentano la linea di base.
3. Stimolare con glucosio integrato HL-3.
   1. Rimuovere il tampone di trealosio-saccarosio contenente HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e sostituirlo con 5 mM di glucosio integrato HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM di saccarosio, 5 mM di glucosio, 5 mM HEPES, pH 7,1). Questo passaggio deve essere eseguito con grande cura, per evitare il movimento del VNC il più possibile.
   2. Acquisisci immagini ogni 10 s per altri 10 minuti. Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione.
4. Salva le immagini come file .czi o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome di file che includa data, background genetico, condizione sperimentale (linea di base o stimolazione) e canali utilizzati.
5. Riutilizzare i parametri per l'immagine di tutti i genotipi (Figura 2A).

3. Elaborazione delle immagini e selezione del ROI

1. Apri i file czi in Fiji / ImageJ e imposta la modalità colore: Scala di grigi, scegli Visualizza stack con: Hyperstacke seleziona Dividi canali in finestre separate.
2. Elabora le immagini utilizzando i plugin di correzione della deriva: turboreg e stackreg. Ogni canale viene corretto separatamente selezionando Stackreg in Plugine quindi scegliendo Trasformazione: Traduzione.
3. Selezionare manualmente le regioni di interesse (ROI) per estrarre il valore di grigio medio di ciascun canale.
   1. Scegli il ROI tracciando tutti i motoneuroni che rimangono a fuoco per l'intera serie temporale. Usa il ROI manager per salvare ogni contorno di motoneurone.
   2. Utilizzare la funzione Multi-misura per misurare il valore di grigio medio in ogni ROI in ogni punto temporale. Copia i ROI tracciati dal primo canale al secondo canale per l'immagine di pre-stimolazione.
   3. Ripeti questo processo per le immagini post-stimolazione in ciascun canale utilizzando le stesse cellule / ROI selezionate per l'immagine di pre-stimolazione.

4. Analisi dei dati

1. Calcolate il rapporto FRET/CFP utilizzando i valori di grigio medi per i canali FRET e CFP. Le variazioni nei rapporti FRET/CFP riflettono alterazioni della concentrazione intracellulare di glucosio.
   1. Traccia i rapporti FRET/CFP per ogni ROI e time point rispetto al tempo. All'interno di ogni VNC alcuni dei ROI mostreranno un calo dei rapporti FRET / CFP dopo la stimolazione.
      NOTA: Questo è interpretato come un'incapacità di alcuni neuroni di assorbire il glucosio, probabilmente a causa dello stress causato da dissezioni e sono quindi eliminati dall'analisi. I restanti rapporti FRET/CFP per ogni ROI e punto temporale sono mediati per generare un singolo rapporto FRET/CFP per punto temporale per genotipo (sensore di glucosio da solo e sensore di glucosio con TDP-43^G298S). Questi singoli rapporti FRET/CFP vengono utilizzati per tutte le successive normalizzazioni. Sono stati analizzati 31 ROI per i controlli del sensore di glucosio e 24 ROI per TDP-43^G298S.
2. Normalizzazione al basale: calcolare la media dei rapporti FRET/CFP per i primi 10 minuti (baseline), quindi normalizzare i singoli rapporti FRET/CFP per ogni punto temporale dell'intero esperimento alla media basale di 10 min (vedere Figura 2B).
3. Normalizzazione del punto temporale: normalizzare i rapporti TDP-43^G298S FRET/CFP con i rapporti FRET/CFP dal solo sensore di glucosio in ogni punto temporale (vedere Figura 3A).
4. Grafici a barre: per confronti tra basale e stimolazione sotto forma di grafici a barre, utilizzare i rapporti FRET/CFP da 5-10 minuti (basale) e 15-20 minuti (stimolazione) per ciascun genotipo. Normalizzare il rapporto di stimolazione rispetto al rapporto basale (vedere Figura 3B).

5. Analisi statistiche

1. Valutare i set di dati normalizzati utilizzando la correzione di Mann-Whitney (per le normalizzazioni di base e timepoint) o il test di Kruskall-Walis (per la rappresentazione a barre della stimolazione rispetto ai rapporti FRET/CFP al basale).

Risultati

Acquisizione dell'immagine del sensore di glucosio nel cordone nervoso ventrale (VNC), ex vivo
Per determinare le differenze nell'assorbimento del glucosio in un modello di Drosophila di SLA basato su TDP-43, è stato utilizzato un sensore di glucosio a base di FRET geneticamente codificato. Il sensore comprendeva CFP e YFP fusi al dominio di legame del glucosio dal gene E. coli MglB. Il legame del glucosio provoca un cambiamento conformazionale, che può ...

Discussione

La tecnica qui descritta in dettaglio può essere applicata per misurare l'assorbimento di glucosio in uno specifico tipo di cellula di interesse nella Drosophila viva utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, un sensore basato su FRET in grado di rilevare cambiamenti nei livelli di glucosio in un intervallo millimolare^10,11,12. Questo sensore è stato precedentemente utilizzato in combinazione con il sistema UAS-GAL4 per indiri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A