Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Zusammenfassung

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Zusammenfassung

Amyotrophe Lateralsklerose ist eine neurodegenerative Erkrankung, die innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnose zu fortschreitender Muskelschwäche und Tod führt. Klinische Manifestationen umfassen Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus; Es bleibt jedoch unklar, wie diese mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Unter Verwendung eines Drosophila-Modells der TDP-43-Proteinopathie, das mehrere Merkmale von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer, haben wir kürzlich weitreichende Stoffwechseldefizite identifiziert. Unter diesen wurde festgestellt, dass die Glykolyse hochreguliert ist, und genetische Interaktionsexperimente lieferten Hinweise auf einen kompensatorischen neuroprotektiven Mechanismus. Trotz der Hochregulierung der Phosphofructokinase, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym in der Glykolyse, wurde gezeigt, dass eine Zunahme der Glykolyse unter Verwendung diätetischer und genetischer Manipulationen die Funktionsstörung des Lokomotors und die erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie abschwächt. Um die Wirkung der TDP-43-Proteinopathie auf den glykolytischen Fluss in Motoneuronen weiter zu untersuchen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter, FRET-basierter Sensor, FLII12Pglu-700μδ6, verwendet. Dieser Sensor besteht aus einer bakteriellen Glukosesensordomäne und cyan- und gelb fluoreszierenden Proteinen als FRET-Paar. Bei der Glukosebindung erfährt der Sensor eine Konformationsänderung, die FRET ermöglicht. Unter Verwendung von FLII12Pglu-700μδ6 wurde festgestellt, dass die Glukoseaufnahme in Motoneuronen, die TDP-43^G298Sexprimieren, signifikant erhöht ist, eine ALS-verursachende Variante. Hier zeigen wir, wie die Glukoseaufnahme ex vivoin larvalen ventralen Nervenstrangpräparaten gemessen werden kann, die den Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 im Rahmen der TDP-43-Proteinopathie exprimieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Glukoseaufnahme zu messen und den glykolytischen Fluss in verschiedenen Zelltypen oder im Zusammenhang mit verschiedenen Mutationen, die ALS und verwandte neurodegenerative Erkrankungen verursachen, zu bewerten.

Einleitung

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die derzeit unheilbar ist. ALS betrifft obere und untere Motoneuronen, was zu einem Verlust der motorischen Koordination, irreversibler Lähmung, Atemversagen und schließlich zum Tod innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnose^{führt 1}. ALS ist mit Stoffwechseldefekten wie Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus assoziiert (überprüft in²); Es bleibt jedoch unklar, wie diese Veränderungen im Stoffwechsel mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Ein gemeinsamer Nenner bei ALS und verwandten neurodegenerativen Erkrankungen ist TDP-43, ein Nukleinsäure-bindendes Protein, das an mehreren Schritten der RNA-Verarbeitung beteiligt ist^3,4,5. Obwohl Mutationen in TDP-43 nur 3% -5% der Patienten betreffen, wird das Wildtyp-TDP-43-Protein in zytoplasmatischen Aggregaten in >97% der ALS-Fälle (überprüft in⁶) gefunden. Diese Pathologie wurde in Drosophila durch Überexpression von menschlichem Wildtyp oder mutantem TDP-43 (G298S) in Motoneuronen modelliert, was mehrere Aspekte von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer^7,8. Unter Verwendung dieser Modelle wurde kürzlich berichtet, dass die TDP-43-Proteinopathie einen signifikanten Anstieg der Pyruvatspiegel und der Phosphofructokinase (PFK) mRNA, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym der Glykolyse, verursacht⁹. Ähnliche Erhöhungen der PFK-Transkripte wurden in patienteneigenen Motoneuronen und Rückenmark gefunden, was darauf hindeutet, dass die Glykolyse im Zusammenhang mit der TDP-43-Proteinopathie hochreguliert ist. Interessanterweise milderte ein weiterer Anstieg der Glykolyse durch diätetische und genetische Manipulationen mehrere ALS-Phänotypen wie Lokomotorische Dysfunktion und erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie, die mit einem kompensatorischen, neuroprotektiven Mechanismus in degenerierenden Motoneuronen übereinstimmen.

Um Veränderungen in der Glykolyse weiter zu untersuchen und die Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie zu messen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter FRET-basierter Sensor FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ in Motoneuronen speziell mit dem UAS-GAL4-Expressionssystem exprimiert. Der Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 nutzt den Resonanzenergietransfer zwischen zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins, cyanfarbene und gelb fluoreszierende Proteine (CFP und YFP), um Glukose auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Es besteht aus einer bakteriellen Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen, das an gegenüberliegenden Enden des Moleküls mit CFP und YFP fusioniert ist. Wenn der Sensor an ein Glukosemolekül gebunden ist, erfährt er eine Konformationsänderung, die CFP und YFP näher zusammenbringt und FRET ermöglicht, die dann zur Quantifizierung der intrazellulären Glukosespiegel verwendet werden kann^10,11,12 ( Abbildung1). Hier zeigen wir, wie der FLII12Pglu-700μδ6-Sensor verwendet werden kann, um Veränderungen der Glukoseaufnahme zu bestimmen, die durch TDP-43-Proteinopathie in Motoneuronen verursacht werden. Die hier beschriebenen Experimente zeigen, dass die Überexpression einer ALS-assoziierten Mutante, TDP-43^G298S,in Motoneuronen einen signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme im Vergleich zu Kontrollen verursacht. Dieser Ansatz kann in anderen Arten von ALS (z. B. SOD1, C9orf72 usw.) und / oder anderen Zelltypen (z. B. Glia, Muskeln) verwendet werden, um Veränderungen der Glukoseaufnahme im Zusammenhang mit Neurodegeneration zu bestimmen.

Protokoll

Die UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenen Fliegen wurden in Volkenhoff et al.¹⁰ berichtet und freundlicherweise von Dr. S. Schirmeier zur Verfügung gestellt. Die transgenen UAS TDP-43^G298S Leitungen wurden freundlicherweise von Dr. T. Iwatsubo¹³zur Verfügung gestellt. Rekombinante Drosophila-Linien, die sowohl UAS FLII12Pglu-700μδ6- als auch UAS TDP-43-Transgene beherbergen, wurden im Zarnescu-Labor unter Verwendung genetischer Standardansätze erzeugt und in Manzo et al.⁹berichtet. D42 GAL4 wurde verwendet, um die Expression des Glukosesensors allein oder zusammen mit TDP-43^G298S in Motoneuronen zu steuern. Alle Fliegenschnuren werden auf Melasse-Maismehlmedien bei 25 °C im Dunkel-Licht-Zyklus gehalten.

1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) Dissektionen

1. Machen Sie Silikonelastomer-Dissektionsschalen.
   1. Gießen Sie Silikonelastomerkomponenten in ein 50-ml-Röhrchen, wie im Protokoll des Herstellers angegeben, und rühren Sie gut um.
   2. Füllen Sie 35 mm Gewebekulturschalen mit ca. 2 ml der Elastomermischung. Verwenden Sie eine Spritze, um Blasen zu entfernen. Das Geschirr abdecken und über Nacht in einem 60 °C warmen Ofen auf eine ebene Fläche stellen, um es auszuhärten.
2. Sezieren Sie Drosophila-Larven, um die VNC freizulegen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
   1. Sammeln Sie eine wandernde Larve im dritten Stadium, spülen Sie sie mit ddH₂O ab und legen Sie sie dann in einen Tropfen HL3-Puffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) auf eine mit Elastomeren ausgekleidete Schale.
   2. Mit einer Pinzette (# 5 oder 55 Pinzette) unter einem Seziermikroskop die vorderen und hinteren Enden der Larve dorsal mit der Seite nach oben fixieren und die Larve vorsichtig der Länge nach mit Insektenstiften (Minutein Pins) dehnen.
   3. Machen Sie einen Schnitt direkt über dem hinteren Stift mit einer abgewinkelten Irisschere. Machen Sie einen vertikalen Schnitt, beginnend mit dem Einschnitt in Richtung des vorderen Endes der Larve.
   4. Fügen Sie bei Bedarf ein paar Tropfen HL-3-Puffer hinzu. Entfernen Sie die Luftröhre und den Rest der schwimmenden Organe, ohne das ZNS zu stören. Stecken Sie die Klappen, die die Körperwand dehnen, um das ZNS freizulegen, während das neuromuskuläre System (VNCs, Axone und neuromuskuläre Verbindungen) intakt bleibt.

2. Bilderfassung

1. Optimieren Sie die Bildgebungsparameter.
   1. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein, bevor Sie mit den Dissektionen beginnen. Die Bilder müssen mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse aufgenommen werden. Verwenden Sie einen 405-nm-Laser, um CFP anzuregen und die Bilder sowohl im CFP- (465-499 nm) als auch im FRET- (535-695 nm) Detektionskanal aufzunehmen.
   2. Optimieren Sie Erfassungsparameter wie Scangeschwindigkeit (6), Durchschnitt (2), Objektiv (40x), Zoom (1x), Lochgröße (1 AE) und räumliche Auflösung (512 x 512). Stellen Sie die Verstärkung so ein, dass sich das Signal im optimalen Dynamikbereich befindet. Für alle Genotypen müssen die gleichen Parameter verwendet werden.
2. Bilden Sie Motoneuronen innerhalb des VNC ab.
   1. Legen Sie die Silikonschale mit der sezierten Probe unter die Linse. Senken Sie die Linse ab, so dass sie mit Trehalose-Saccharose-HL3-Puffer in Berührung kommt (siehe 1.2.1). Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Fügen Sie bei Bedarf weiteren Puffer hinzu.
   2. Verwenden Sie die CFP- und FRET-Kanäle, um manuell einen optischen Abschnitt auszuwählen, der aus mindestens 6 fokussierten Motoneuronen besteht und sich entlang der VNC-Mittellinie befindet. Die Motoneuronen werden anhand der Expression des Glukosesensors und der Position entlang der vorder-hinteren Achse identifiziert.
   3. Erfassen Sie Bilder alle 10 Minuten für 10 Minuten. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.
3. Stimulieren Sie mit Glukose ergänzt HL-3.
   1. Entfernen Sie den Trehalose-Saccharose-haltigen HL3-Puffer mit einer Pasteur-Pipette und ersetzen Sie ihn durch 5 mM Glucose ergänzt HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM Saccharose, 5 mM Glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Dieser Schritt muss mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, um die Bewegung des VNC so weit wie möglich zu vermeiden.
   2. Erfassen Sie Bilder alle 10 Sekunden für weitere 10 Minuten. Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar.
4. Speichern Sie die Bilder als .czi-Dateien oder einen anderen von der Imaging-Software unterstützten Dateityp mit einem Dateinamen einschließlich Datum, genetischem Hintergrund, experimentellem Zustand (Baseline oder Stimulation) und verwendeten Kanälen.
5. Verwenden Sie die Parameter wieder, um alle Genotypen abzubilden (Abbildung 2A).

3. Bildverarbeitung und ROI-Auswahl

1. Öffnen Sie die CZI-Dateien in Fiji/ImageJ und legen Sie Farbmodus: Graustufenfest, wählen Sie View Stack with: Hyperstackund wählen Sie Split Channels into Separate Windows.
2. Verarbeiten Sie Bilder mit den Driftkorrektur-Plugins: Turboreg und Stackreg. Jeder Kanal wird separat korrigiert, indem Sie unter Pluginsdie Option Stackreg auswählen und dann Transformation: Translationauswählen.
3. Wählen Sie manuell die Regions of Interest (ROIs) aus, um den grauen Mittelwert jedes Kanals zu extrahieren.
   1. Wählen Sie die ROIs, indem Sie alle Motoneuronen verfolgen, die über die gesamte Zeitreihe im Fokus bleiben. Verwenden Sie den ROI-Manager, um jede Motoneuron-Gliederung zu speichern.
   2. Verwenden Sie die Multi-Measure-Funktion, um den mittleren Grauwert in jedem ROI zu jedem Zeitpunkt zu messen. Kopieren Sie die ROIs, die vom ersten Kanal zum zweiten Kanal für das Bild vor der Stimulation verfolgt werden.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Post-Stimulationsbilder in jedem Kanal mit den gleichen Zellen/ROIs, die für das Pre-Stimulationsbild ausgewählt wurden.

4. Datenanalyse

1. Berechnen Sie das FRET/CFP-Verhältnis unter Verwendung der mittleren Grauwerte für die FRET- und CFP-Kanäle. Änderungen der FRET/CFP-Verhältnisse spiegeln Veränderungen der intrazellulären Glukosekonzentration wider.
   1. Zeichnen Sie FRET/CFP-Verhältnisse für jeden ROI und Zeitpunkt im Vergleich zur Zeit auf. Innerhalb jedes VNC zeigen einige der ROIs nach Stimulation einen Rückgang der FRET/CFP-Verhältnisse.
      HINWEIS: Dies wird als Unfähigkeit einiger Neuronen interpretiert, Glukose aufzunehmen, möglicherweise aufgrund von Stress, der durch Dissektionen verursacht wird, und wird daher aus der Analyse eliminiert. Die verbleibenden FRET/CFP-Verhältnisse für jeden ROI und Zeitpunkt werden gemittelt, um ein einzelnes FRET/CFP-Verhältnis pro Zeitpunkt und Genotyp zu erzeugen (Glukosesensor allein und Glukosesensor mit TDP-43^G298S). Diese einzelnen FRET/CFP-Verhältnisse werden für alle nachfolgenden Normalisierungen verwendet. 31 ROIs wurden für Glukosesensorkontrollen und 24 ROIs für TDP-43^G298Sanalysiert.
2. Baseline-Normalisierung: Berechnen Sie den Durchschnitt der FRET/CFP-Verhältnisse für die ersten 10 Minuten (Baseline) und normalisieren Sie dann die einzelnen FRET/CFP-Verhältnisse für jeden Zeitpunkt des gesamten Experiments auf den 10-minütigen Basisliniendurchschnitt (siehe Abbildung 2B).
3. Timepoint-Normalisierung: Normalisieren Sie TDP-43^G298S FRET/CFP-Verhältnisse in FRET/CFP-Verhältnisse vom Glukosesensor allein zu jedem Zeitpunkt (siehe Abbildung 3A).
4. Balkendiagramme: Für Vergleiche zwischen Baseline und Stimulation in Form von Balkendiagrammen verwenden Sie FRET/CFP-Verhältnisse von 5-10 min (Baseline) und 15-20 min (Stimulation) für jeden Genotyp. Normalisieren Sie das Stimulationsverhältnis zum Ausgangswertverhältnis (siehe Abbildung 3B).

5. Statistische Auswertungen

1. Bewerten Sie die normalisierten Datensätze mit Hilfe der Mann-Whitney-Korrektur (für Baseline- und Zeitpunktnormalisierungen) oder des Kruskall-Walis-Tests (für die Balkendiagrammdarstellung der Stimulation im Vergleich zu den FRET/CFP-Verhältnissen der Baseline).

Ergebnisse

Bildaufnahme des Glukosesensors im ventralen Nervenstrang (VNC), ex vivo
Um Unterschiede in der Glukoseaufnahme in einem Drosophila-Modell von ALS basierend auf TDP-43 zu bestimmen, wurde ein genetisch kodierter FRET-basierter Glukosesensor verwendet. Der Sensor bestand aus CFP und YFP, die mit der Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen fusionierten. Die Glucosebindung löst eine Konformationsänderung aus, die durch Fluoreszenzresonanz-Energietra...

Diskussion

Die hier im Detail beschriebene Technik kann angewendet werden, um die Glukoseaufnahme in einem bestimmten Zelltyp von Interesse in lebender Drosophila mit FLII12Pglu-700μδ6 zu messen, einem FRET-basierten Sensor, der Änderungen des Glukosespiegels in einem Millimolarbereich^10,11,12erkennen kann. Dieser Sensor wurde zuvor in Verbindung mit dem UAS-GAL4-System verwendet, um seine Expression auf bestimmte Zelltypen aus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A