Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43

Resumo

A absorção de glicose é aumentada em neurônios motores Drosophila afetados pela proteína de ligação de DNA TAR (TDP-43), como indicado por um sensor de glicose à base de FRET, geneticamente codificado.

Resumo

A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa que causa fraqueza muscular progressiva e morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico. As manifestações clínicas incluem perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; no entanto, ainda não está claro como estes se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Usando um modelo de Drosophila de proteinopatia TDP-43 que recapitula várias características da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotor e redução da vida útil, recentemente identificamos amplos déficits metabólicos. Entre elas, verificou-se que a glicólise era regulada e os experimentos de interação genética forneceram evidências para um mecanismo neuroprotetor compensatório. De fato, apesar da regulação da fosfofructokinase, a taxa que limita a enzima na glicólise, um aumento da glicólise usando manipulações dietéticas e genéticas foi mostrado para mitigar a disfunção locomotor e o aumento da vida útil em modelos de moscas da proteinopatia TDP-43. Para investigar melhor o efeito sobre a proteinopatia TDP-43 no fluxo glicóglitico em neurônios motores, foi utilizado um sensor geneticamente codificado geneticamente, baseado em FRET, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor é composto por um domínio bacteriano de sensoriamento de glicose e proteínas fluorescentes ciano e amarela como o par FRET. Após a ligação de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional permitindo que o FRET ocorra. Utilizando FLII12Pglu-700μδ6, a absorção de glicose foi significativamente aumentada em neurônios motores expressando TDP-43^G298S, uma variante causadora de ELA. Aqui, mostramos como medir a absorção de glicose, ex vivo,nas preparações do cabo do nervo ventral larval expressando o sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 no contexto da proteinopatia TDP-43. Essa abordagem pode ser usada para medir a absorção de glicose e avaliar o fluxo glicóltico em diferentes tipos de células ou no contexto de várias mutações que causam ELA e distúrbios neurodegenerativos relacionados.

Introdução

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva que atualmente é incurável. A ELA afeta neurônios motores superiores e inferiores levando à perda da coordenação motora, paralisia irreversível, insuficiência respiratória e eventual morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico¹. A ELA está associada a defeitos metabólicos como perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado em²); no entanto, ainda não está claro como essas alterações no metabolismo se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Um denominador comum em ELA e doenças neurodegenerativas relacionadas é o TDP-43, uma proteína de ligação nucleica de ácido envolvida em várias etapas do processamento de RNA^3,4,5. Embora as mutações no TDP-43 afetem apenas 3%-5% dos pacientes, a proteína TDP-43 de tipo selvagem é encontrada dentro de agregados citoplasmicos em >97% dos casos de ELA (revisados em⁶). Esta patologia foi modelada em Drosophila por superexpressão do tipo selvagem humano ou mutante TDP-43 (G298S) em neurônios motores, que recapitula múltiplos aspectos da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotora e redução da vida útil^7,8. Usando esses modelos, foi recentemente relatado que a proteinopatia TDP-43 causa um aumento significativo nos níveis de piruvato e mRNA de fosfofructokinase (PFK), a enzima que limita a taxa da glicólise⁹. Aumentos semelhantes nas transcrições de PFK foram encontrados em neurônios motores derivados do paciente e medulas espinhais, sugerindo que a glicólise é regulada no contexto da proteinopatia TDP-43. Curiosamente, o aumento da glicolise usando manipulações dietéticas e genéticas mitigau vários fenótipos da ALS, como disfunção locomotor e aumento da vida útil em modelos de moscas de proteinopatia TDP-43, consistente com um mecanismo compensatório e neuroprotetor na degeneração de neurônios motores.

Para sondar ainda mais mudanças na glicólise e medir a absorção de glicose em modelos de Drosophila de proteinopatia TDP-43, um sensor baseado em FRET geneticamente codificado anteriormente FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ foi expresso em neurônios motores especificamente usando o sistema de expressão UAS-GAL4. O sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 utiliza a transferência de energia de ressonância entre duas variantes de proteína fluorescente verde, ciano e proteínas fluorescentes amarelas (CFP e YFP) para detectar glicose no nível celular. Consiste em um domínio de ligação de glicose bacteriana do gene E. coli MglB fundido a CFP e YFP em extremidades opostas da molécula. Quando ligado a uma molécula de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional aproximando o PCP e o YFP e permitindo que o FRET ocorra, que pode ser usado para quantificar os níveis de glicose intracelulares^10,11,12 (Figura 1). Aqui, mostramos como o sensor FLII12Pglu-700μδ6 pode ser usado para determinar alterações na absorção de glicose causadas pela proteinopatia TDP-43 em neurônios motores. Os experimentos descritos aqui mostram que a superexpressão de um mutante associado à ALS, TDP-43^G298S,em neurônios motores causa um aumento significativo na absorção de glicose em comparação com os controles. Essa abordagem pode ser usada em outros tipos de ELA (por exemplo, SOD1, C9orf72, etc.) e/ou outros tipos de células (por exemplo, glia, músculos) para determinar alterações na absorção de glicose associadas à neurodegeneração.

Protocolo

As moscas transgênicas UAS FLII12Pglu-700μδ6 foram relatadas em Volkenhoff et al.¹⁰ e gentilmente fornecidas pelo Dr. S. Schirmeier. As linhas transgênicas UAS TDP-43^G298S foram gentilmente fornecidas pelo Dr. T. Iwatsubo¹³. As linhas recombinantes de Drosophila que abrigam tanto os transgênicos UAS FLII12Pglu-700μδ6 quanto uas TDP-43 foram gerados no laboratório Zarnescu utilizando abordagens genéticas padrão e relatados em Manzo et al.⁹. D42 GAL4 foi usado para conduzir a expressão do sensor de glicose sozinho ou junto com TDP-43^G298S em neurônios motores. Todas as linhas de mosca são mantidas em mídia de farinha de milho de melaço, a 25 °C em ciclo escuro de 12 h: luz.

1. Dissecções do cabo nervoso ventral drosophila (VNC)

1. Faça pratos de dissecção de elastômero de silicone.
   1. Despeje componentes de elastômero de silicone em um tubo de 50 mL, conforme indicado no protocolo do fabricante e mexa bem.
   2. Encha pratos de cultura de tecido de 35 mm com aproximadamente 2 mL da mistura de elastômero. Use uma seringa para remover quaisquer bolhas. Cubra os pratos e coloque-os em uma superfície nivelada em um forno de 60 °C durante a noite para curar.
2. Disseque larvas de Drosophila para expor o VNC, mantendo a viabilidade tecidual.
   1. Colete uma terceira larva instar errante, enxágue com ddH₂O, e depois coloque-o em uma gota de HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM de sacarose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) em um prato forrado de elatômero.
   2. Usando um par de fórceps (#5 ou 55 fórceps) sob um microscópio dissecando, fixar as extremidades anterior e posterior do lado dorsal da larva para cima, esticando cuidadosamente a larva longitudinalmente com pinos de inseto (Pinos minutein).
   3. Faça uma incisão logo acima do pino posterior usando um par de tesouras de íris angulares. Faça um corte vertical a partir da incisão para a extremidade anterior da larva.
   4. Adicione algumas gotas de buffer HL-3, se necessário. Remova a traqueia e o resto dos órgãos flutuantes sem perturbar o CNS. Fixar os retalhos que esticam a parede do corpo para expor o CNS, mantendo intacto o sistema neuromuscular (VNCs, axônios e junções neuromusculares).

2. Aquisição de imagens

1. Otimize os parâmetros de imagem.
   1. Ligue o microscópio e os lasers antes de iniciar as dissecções. As imagens devem ser adquiridas usando um microscópio confocal vertical com uma lente de imersão de água de 40x. Use um laser de 405 nm para excitar o CFP e adquirir as imagens tanto nos canais de detecção CFP (465-499 nm) quanto nos canais de detecção FRET (535-695 nm).
   2. Otimizar parâmetros de aquisição como velocidade de varredura (6), média (2), objetivo (40x), zoom (1x), tamanho do pinhole (1 UA) e resolução espacial (512 x 512). Ajuste o ganho de tal forma que o sinal esteja no intervalo dinâmico ideal. Os mesmos parâmetros devem ser utilizados para todos os genótipos.
2. Neurônios motores de imagem dentro do VNC.
   1. Coloque o prato de silicone com a amostra dissecada sob a lente. Baixe a lente para que ela entre em contato com o tampão HL3 trehalose-sucrose (ver 1.2.1). É fundamental garantir que a lente esteja completamente submersa no buffer. Adicione mais buffer, se necessário.
   2. Use os canais CFP e FRET para selecionar manualmente uma seção óptica que consiste em pelo menos 6 neurônios motores em foco, localizados ao longo da linha média VNC. Os neurônios motores são identificados com base na expressão do sensor de glicose e posição ao longo do eixo anterior-posterior.
   3. Adquira imagens a cada 10 s por 10 minutos. Essas imagens representam a linha de base.
3. Estimular com glicose suplementada HL-3.
   1. Remova a trehalose-sacarose contendo HL3-tampão usando uma pipeta Pasteur e substitua-a por 5 mM de glicose suplementada HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM de sacarose, 5 mM de glicose, 5 mM HEPES, pH 7.1). Essa etapa precisa ser realizada com muito cuidado, para evitar o movimento do VNC o máximo possível.
   2. Adquira imagens a cada 10 s por mais 10 minutos. Essas imagens representam a fase de estimulação.
4. Salve as imagens como arquivos .czi ou qualquer tipo de arquivo suportado pelo software de imagem com um nome de arquivo, incluindo data, fundo genético, condição experimental (linha de base ou estimulação) e canais utilizados.
5. Reutilizar os parâmetros para imagem de todos os genótipos(Figura 2A).

3. Processamento de imagens e seleção de ROI

1. Abra os arquivos czi em Fiji/ImageJ e defina Modo de Cor: Escala de cinza,escolha Exibir pilha com: Hyperstacke selecione Canais divididos em Windows separado.
2. Processe imagens usando os plugins de correção de deriva: turboreg e stackreg. Cada canal é corrigido separadamente selecionando Stackreg em Pluginse, em seguida, escolha Transformação: Tradução.
3. Selecione manualmente as Regiões de Interesse (ROIs) para extrair o valor cinza médio de cada canal.
   1. Escolha os ROIs rastreando todos os neurônios motores que permanecem em foco durante toda a série temporal. Use o gerenciador de ROI para salvar cada contorno do neurônio motor.
   2. Use a função Multi-medida para medir o valor cinza médio em cada ROI em cada ponto de tempo. Copie os ROIs rastreados do primeiro canal para o segundo canal para a imagem de pré-estimulação.
   3. Repita este processo para as imagens pós-estimulação em cada canal usando as mesmas células/ROIs selecionadas para a imagem pré-estimulação.

4. Análise de dados

1. Calcule a razão FRET/CFP, utilizando os valores cinza médios para os canais FRET e CFP. Alterações nas relações FRET/CFP refletem alterações na concentração de glicose intracelular.
   1. Plote as relações FRET/CFP para cada ROI e ponto de tempo versus tempo. Dentro de cada VNC, alguns dos ROIs apresentarão uma queda nas relações FRET/CFP após a estimulação.
      NOTA: Isso é interpretado como uma incapacidade de alguns neurônios de captar glicose, possivelmente devido ao estresse causado por dissecções e, portanto, são eliminados da análise. As demais razões FRET/CFP para cada ROI e ponto de tempo são mediadas para gerar uma única razão FRET/CFP por ponto de tempo por genótipo (sensor de glicose sozinho e sensor de glicose com TDP-43^G298S). Estas únicas relações FRET/CFP são usadas para todas as normalizações subsequentes. Foram analisados 31 ROIs para controles de sensores de glicose e 24 ROIs para TDP-43^G298S.
2. Normalização da linha de base: Calcule a média das relações FRET/CFP para os primeiros 10 minutos (linha de base) e, em seguida, normalize as relações individuais de FRET/CFP para cada ponto de tempo de todo o experimento até a média da linha de base de 10 minutos (ver Figura 2B).
3. Normalização do ponto de tempo: Normalizar as relações TDP-43^G298S FRET/CFP para as relações FRET/CFP apenas a partir do sensor de glicose em cada ponto de tempo (ver Figura 3A).
4. Gráficos de barras: Para comparações de linha de base versus estimulação na forma de gráficos de barras, use razões FRET/CFP de 5-10 min (linha de base) e 15-20 min (estimulação) para cada genótipo. Normalizar a razão de estimulação para a razão da linha de base (ver Figura 3B).

5. Análises estatísticas

1. Avalie os conjuntos de dados normalizados usando correção Mann-Whitney (para normalização da linha de base e ponto de tempo) ou teste kruskall-Walis (para representação de gráfico de barras de estimulação versus taxas de FRET/CFP de linha de base).

Resultados

Aquisição de imagem do sensor de glicose no fio do nervo ventral (VNC), ex vivo
Para determinar diferenças na absorção de glicose em um modelo de Drosophila de ALS baseado no TDP-43, foi utilizado um sensor de glicose à base de FRET geneticamente codificado. O sensor era composto por CFP e YFP fundidos ao domínio de ligação de glicose do gene E. coli MglB. A ligação de glicose provoca uma alteração conformacional, que pode ser detectada por tr...

Discussão

A técnica descrita em detalhes aqui pode ser aplicada para medir a absorção de glicose em um tipo específico de interesse celular em Drosophila viva usando FLII12Pglu-700μδ6, um sensor baseado em FRET que pode detectar alterações nos níveis de glicose para uma faixa mililitro^10,11,12. Este sensor foi usado anteriormente em conjunto com o sistema UAS-GAL4 para direcionar sua expressão para tipos celulares espec...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A