Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Resumen

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Resumen

El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.

Introducción

El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima ^pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206⁺ pueblan el área peribronquial y perivascular, mientras que los IM CD206^- se encuentran en el intersticio alveolar3. Recientemente se han propuesto algunas subclasificaciones de IM3,4,5,6. Aunque los IM están menos estudiados que los AM, la evidencia reciente apoya su papel crucial en la regulación del sistema inmune del ^pulmón7. Además, CD206 también se expresa en AMs8 activado alternativamente.

Las células dendríticas pulmonares (CD) son otro grupo heterogéneo de células inmunes pulmonares con respecto a sus propiedades funcionales, ubicación y origen. Se han descrito cuatro subcategorías de DC en el pulmón: DC CD103⁺ convencionales (también conocidos como cDC1), CD CD11b⁺ convencionales (también conocidos como cDC2), DC derivados de monocitos (MoDC) y DC plasmocitoides9,10,11,12,13. Las tres primeras subclases se pueden definir como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Los DC plasmocitoides expresan MHC II y son intermediamente positivos para CD11c, pero expresan altos niveles de B220 y PDCA-19,13,16. En los pulmones murinos naïve, los CD CD103 y cd11b se localizan en el intersticio de las vías respiratorias, mientras que los CD plasmocitoides se localizan en el intersticio ^alveolar17.

Dos poblaciones principales de monocitos residen en el pulmón durante el estado estacionario: monocitos clásicos y monocitos no clásicos. Los monocitos clásicos son Ly6C⁺ y son críticos para la respuesta inflamatoria inicial. Por el contrario, los monocitos no clásicos son Ly6C^- y han sido ampliamente vistos como células antiinflamatorias3,16,18. Recientemente, se describió una población adicional de monocitos CD64⁺CD16.2⁺, que se originan a partir de monocitos Ly6C^- y dan lugar a IM CD206⁺³.

Los eosinófilos aparecen principalmente en los pulmones durante la infección por helmintos o afecciones alérgicas. Sin embargo, hay un pequeño número de eosinófilos en el parénquima pulmonar durante el estado estacionario, conocidos como eosinófilos residentes. A diferencia de los eosinófilos residentes, los eosinófilos inflamatorios se encuentran en el intersticio pulmonar y el lavado broncoalveolar (BAL). En modelos de ratón de ácaros del polvo doméstico (HDM), los eosinófilos inflamatorios se reclutan en el pulmón después de la estimulación mediada por antígenos. Se ha propuesto que los eosinófilos residentes podrían tener un papel regulador en la alergia al inhibir la sensibilización del T helper 2 (Th2) a ^HDM19.

A diferencia del resto de células mieloides pulmonares, los neutrófilos expresan Ly6G pero no CD68 y se caracterizan por una firma del inmunofenotipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Los estudios de visualización han demostrado que durante el estado estacionario, el pulmón reserva un grupo de neutrófilos en el compartimento intravascular y alberga un número considerable de neutrófilos ^{extravasculares22}. Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos no se encuentran en BAL en estado estacionario; sin embargo, varias formas de estimulación inmune, como el desafío LPS, el asma o la neumonía, conducen a los neutrófilos a la luz alveolar, lo que resulta en su presencia en BAL21,22,23.

Un número sustancial de células CD45⁺ del pulmón representan un asesino natural (NK), células T y células B y son negativas para la mayoría de los marcadores ^mieloides24. En los pulmones de ratones ingenuos, estos tres tipos de células se pueden identificar en función de la expresión de CD11b y MHC ^II18. Alrededor del 25% de las células CD45⁺ pulmonares son células B, mientras que el porcentaje de células NK es mayor en el pulmón que en otros tejidos linfoides y no linfoides24,25,26. Entre las células T pulmonares, una fracción considerable es ^CD4-CD8- y juega un papel importante en las infecciones ^{respiratorias26}.

Debido a que el pulmón alberga un sistema inmune muy complejo y único, se han desarrollado y reportado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares16,18,20,27. La estrategia de cierre descrita en este documento proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones diferentes de inmunitarias mieloides pulmonares y no mieloides utilizando 9 marcadores. Se han utilizado marcadores adicionales para validar los resultados. Además, se proporciona un método detallado para la preparación de una suspensión unicelular que minimiza la muerte celular y permite la identificación del perfil más completo del compartimiento de células inmunes del pulmón. Cabe destacar que la identificación de células no inmunes del pulmón, como las células epiteliales (CD45-CD326⁺CD31^-), las células endoteliales (CD45-CD326-CD31⁺) y los fibroblastos requiere un abordaje ^{diferente28,29}. La identificación de tales poblaciones no está incluida en el protocolo y método descritos aquí.

Protocolo

Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo pautas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Beth Israel Deaconess. Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis a diez semanas de edad de ambos sexos para desarrollar este protocolo.

1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos

1. Eutanasiar al ratón inyectando intraperitonealmente 1 ml de tribromoetanol (preparado según protocolo estándar; Tabla de Materiales).
   NOTA: La asfixia por _CO2 debe evitarse en los estudios pulmonares, ya que podría causar lesiones pulmonares y alterar las características y propiedades de las células inmunes pulmonares. La dislocación cervical también debe evitarse, ya que podría causar lesiones mecánicas del pulmón.
2. Transfiera el mouse a un área limpia y dedicada para la operación quirúrgica.
3. Estabilice el lado dorsal del ratón hacia abajo mediante el uso de agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades. Use etanol al 70% para desinfectar la piel del área ventral.
4. Realice una incisión en la piel, desde el cuello hasta el abdomen. Retire con cuidado la piel del área torácica.
5. Retire con cuidado el esternón y las costillas.
6. Enjuague los pulmones inyectando 10 ml de PBS frío directamente en el ventrículo derecho, usando una aguja de 18-21 G, hasta que los pulmones se vuelvan completamente blancos.
7. Retire con cuidado el timo y el corazón sin tocar los pulmones.
8. Separe suavemente los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo con tampón BSA frío (Tabla 1).
   NOTA: Se debe hacer un esfuerzo para eliminar toda la grasa adyacente de los pulmones antes de preparar aún más la suspensión unicelular, ya que esto podría sesgar las lecturas.

2. Preparación de la suspensión unicelular

1. Transfiera los pulmones a una placa de Petri vacía y pica con dos bisturíes finos. Transfiera todas las piezas del pulmón picado a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Use 5 ml de tampón de digestión para lavar la placa y agréguela al tubo de 50 ml que contiene el pulmón picado (Tabla 1).
   NOTA: El tampón de digestión debe prepararse inmediatamente antes de su uso. Utilizar 5 mg/ml de ^colagenasa28. La combinación de 1 o 5 mg de colagenasa con tampón de BSA o PBS libre de proteínas no mejoró los resultados (Figura suplementaria S1).
2. Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rpm a 37 °C. Detenga la reacción agregando 10 ml de tampón BSA frío.
3. Después de la digestión, use una aguja de 18 G para mezclar y disolver las piezas pulmonares. Coloque un filtro de 70 μm en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: El uso de un filtro de micras más pequeño podría resultar en la pérdida de las principales poblaciones mieloides.
4. Transfiera lentamente la mezcla pulmonar digerida directamente sobre el colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 ml para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro. Lave el material procesado en el filtro con tampón BSA.
5. Centrifugar la suspensión monocelular a 350 × g durante 8 min a 4 °C.
6. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de tampón de lisis ACK. Mezclar bien con una pipeta de 1 ml, e incubar durante 90 s a temperatura ambiente.
7. Agregue 10 ml de tampón BSA frío para detener la reacción y centrífuga a 350 × g durante 7 min a 4 ° C.Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en Staining Buffer para contar las células con un hemocitómetro.
8. Resuspend las células a una concentración de 5 × ¹⁰⁶ células/ml y utilizarlas para la tinción superficial (ver sección 3).
   NOTA: Para este propósito, coloque las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos seguida de tinción y lavado de anticuerpos. Si no hay disponible una centrífuga de placas, use tubos de flujo en lugar de placas. Con este protocolo, se pueden obtener ~ 15-20 × ¹⁰⁶ células por pulmón de un ratón C57BL / 6 de 6-10 semanas de edad de tamaño promedio.

3. Tinción de anticuerpos de superficie

1. Transfiera 1 × ¹⁰⁶ células en 200 μL por pozo en una placa de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 350 × g durante 7 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo fc diluyendo el anticuerpo anti-16/32 (1:100) en tampón de tinción (Tabla 1).
2. Resuspend las células en 50 μL de la solución de bloqueo de Fc preparada previamente (Tabla de Materiales) e incubar durante 15-20 min a 4 °C o en hielo.
3. Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugar la placa a 350 × g durante 5 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie (1:100; Tabla 2) en tampón de tinción.
   NOTA: (i) El anticuerpo anti-16/32 para el bloqueo de Fc se puede usar con los anticuerpos de superficie en la misma mezcla. ii) Si se utiliza un colorante de viabilidad fijable, agréguelo al cóctel de anticuerpos de superficie a una dilución de 1:1.000.
4. Resuspend las células en 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie pre-preparado e incubar durante 30-40 min a 4 °C en la oscuridad. Lave las células con tampón de tinción dos veces.
   NOTA: Si no se requiere tinción intracelular, resuspender las células en 200 μL de tampón de tinción y proceder directamente a la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Alternativamente, las células pueden fijarse y almacenarse a 4 °C para su adquisición posterior. Recomendamos usar las células para la citometría de flujo dentro de las 24 h.

4. Fijación celular y tinción intracelular

1. Prepare el búfer de fijación/permeabilización (Fix/Perm Buffer) mezclando tres partes de concentrado de fijación/permeabilización y 1 parte del diluyente de fijación/permeabilización del FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Tabla 1).
2. Resuspendir las células en 50 μL del Fix/Perm Buffer pre-preparado por pocillo de la placa de 96 pocillos, donde las células fueron chapadas como se describe en la sección 3, e incubarlas durante 20-25 min a 4 °C en la oscuridad.
3. Diluya el tampón de permeabilización 10x como 1: 10 en agua desionizada purificada para preparar 1x tampón de permeabilización.
4. Lave las células una vez con 1x tampón de permeabilización. Mientras tanto, prepare el cóctel de anticuerpos intracelulares diluyendo los anticuerpos intracelulares (1:100) en 1 ml de tampón de permeabilización.
5. Resuspend las células usando 50 μL del cóctel de anticuerpos de superficie pre-preparado por célula de la placa de 96 pocillos e incubar durante 40 min a 4 °C en la oscuridad.
6. Lave las células una vez con tampón de permeabilización y una vez con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción.
   NOTA: Si no hay ningún citómetro de flujo con lector de placas disponible, transfiera las células a tubos de citometría de flujo.
7. Adquirir un mínimo de 1,5 × ¹⁰⁶ células por muestra en el citómetro de flujo.
   NOTA: Para colores individuales y muestras de control no teñidas, 0.5-1 × ¹⁰⁶ celdas por muestra serán suficientes. Se recomienda titular los anticuerpos individuales utilizados para lograr una tinción óptima y reducir los costos. El protocolo actual se ha optimizado utilizando Fix/Perm Buffer preparado utilizando el conjunto de búferes de tinción FoxP3. Debido a que CD68 es un citoplasmático y no un marcador nuclear, otras soluciones de permeabilización, como una baja concentración de paraformaldehído o kits de citofijo / citopermo de varios proveedores podrían ser suficientes.

Resultados

Estrategia de cierre
El primer paso de nuestra estrategia de cierre es la exclusión de los escombros y dobletes (Figura 1A). La exclusión cuidadosa de los dobletes es fundamental para evitar poblaciones falsamente positivas (Figura suplementaria S2). Luego, las células inmunes se identifican utilizando CD45⁺, un marcador para las células hematopoyéticas (Figura 1B). La mancha de muerto vivo se puede agregar pa...

Discusión

La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co