Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Zusammenfassung

Die Atemwege stehen in direktem Kontakt mit der äußeren Umgebung und benötigen ein präzise reguliertes Immunsystem, um Schutz zu bieten und gleichzeitig unerwünschte Reaktionen auf Umweltantigene zu unterdrücken. Lungen beherbergen mehrere Populationen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die Immunüberwachung bieten, aber auch schützende Immunantworten vermitteln. Diese Zellen, die das gesunde Lungenimmunsystem im Gleichgewicht halten, nehmen auch an mehreren pathologischen Zuständen wie Asthma, Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebs teil. Die selektive Expression von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen verleiht den Immunzellen der Lunge einzigartige immunphänotypische Eigenschaften. Folglich spielt die Durchflusszytometrie eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung solcher Zellpopulationen während stationärer und pathologischer Zustände. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das eine konsistente und reproduzierbare Methode beschreibt, um die Immunzellen zu identifizieren, die sich in den Lungen gesunder Mäuse unter stationären Bedingungen befinden. Dieses Protokoll kann jedoch auch verwendet werden, um Veränderungen in diesen Zellpopulationen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu identifizieren, um krankheitsspezifische Veränderungen in der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren.

Einleitung

Die murinen Atemwege enthalten ein einzigartiges Immunsystem, das für die Bekämpfung von Krankheitserregern und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich ist. Das pulmonale Immunsystem besteht aus zellulären Populationen mit signifikanter Heterogenität in ihrem Phänotyp, ihrer Funktion, ihrem Ursprung und ihrem Standort. Residente alveoläre Makrophagen (AMs), die hauptsächlich aus fetalen Monozyten stammen, befinden sich im alveolären ^Lumen1, während sich aus dem Knochenmark stammende interstitielle Makrophagen (IMs) im Lungenparenchym ^befinden2. Sofortnachrichten können durch den Ausdruck CD206 weiter unterteilt werden. CD206⁺ IMs bevölkern den peribronchialen und perivaskulären Bereich, während sich CD206-IMs am alveolären Interstitium ^befinden3. In jüngster Zeit wurden einige Unterklassifizierungen von Sofortnachrichten vorgeschlagen3,4,5,6. Obwohl IMs weniger untersucht werden als AMs, unterstützen jüngste Beweise ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung des Immunsystems der ^Lunge7. Darüber hinaus wird CD206 auch in alternativ aktivierten ^AMs8 ausgedrückt.

Pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind eine weitere heterogene Gruppe von Lungenimmunzellen in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften, ihren Ort und ihre Herkunft. Vier Unterkategorien von DCs wurden in der Lunge beschrieben: konventionelle CD103+ DCs (auch bekannt als cDC1), konventionelle CD11b⁺ DCs (auch bekannt als cDC2), Monozyten-abgeleitete DCs (MoDCs) und plasmazytoide DCs9,10,11,12,13. Die ersten drei Unterklassen können als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ^II+CD11c⁺9,10,14,15 definiert werden. Plasmazytoide DCs exprimieren MHC II und sind mittelmäßig positiv für CD11c, exprimieren aber hohe Konzentrationen von B220 und ^{PDCA-19,13,16}. In naiven murinen Lungen befinden sich CD103-DCs und CD11b-DCs im Interstitium der Atemwege, während sich plasmazytoide DCs im alveolären Interstitium ^befinden17.

Zwei Hauptpopulationen von Monozyten befinden sich im stationären Zustand in der Lunge: klassische Monozyten und nicht-klassische Monozyten. Klassische Monozyten sind Ly6C ⁺ und sind entscheidend für die anfängliche Entzündungsreaktion. Im Gegensatz dazu sind nicht-klassische Monozyten Ly6C^- und wurden weithin als entzündungshemmende Zellen angesehen3,16,18^. Kürzlich wurde eine zusätzliche Population von CD64⁺CD16.2+ Monozyten beschrieben, die aus Ly6C^- Monozyten stammen und CD206^{+ IMs3} entstehen lassen.

Eosinophile treten hauptsächlich in der Lunge während einer Helmintheninfektion oder allergischen Erkrankungen auf. Es gibt jedoch eine kleine Anzahl von Eosinophilen im Lungenparenchym während des stationären Zustands, die als ansässige Eosinophile bekannt sind. Im Gegensatz zu den ansässigen Eosinophilen finden sich entzündliche Eosinophile im Lungeninterstitium und in der bronchoalveolären Lavage (BAL). In Mausmodellen der Hausstaubmilbe (HDM) werden entzündliche Eosinophile nach Antigen-vermittelter Stimulation in die Lunge rekrutiert. Es wurde vorgeschlagen, dass ansässige Eosinophile eine regulatorische Rolle bei der Allergie spielen könnten, indem sie die Sensibilisierung von T helper 2 (Th2) gegenüber ^HDM19 hemmen.

Im Gegensatz zum Rest der lungenmyeloischen Zellen exprimieren Neutrophile Ly6G, aber nicht CD68 und zeichnen sich durch eine Signatur des CD68-Ly6G+^-Immunphänotyps16,20,21 aus. Visualisierungsstudien haben gezeigt, dass die Lunge im stationären Zustand einen Pool von Neutrophilen im intravaskulären Kompartiment reserviert und eine beträchtliche Anzahl extravaskulärer Neutrophilen ^{beherbergt22.} Ähnlich wie Eosinophile werden Neutrophile in BAL im stationären Zustand nicht gefunden; Verschiedene Formen der Immunstimulation, wie LPS-Challenge, Asthma oder Lungenentzündung, treiben jedoch Neutrophile in das Alveolarlumen, was zu ihrer Anwesenheit in BAL21,22,23 führt.

Eine beträchtliche Anzahl von CD45⁺-Zellen der Lunge stellt einen natürlichen Killer (NK), T-Zellen und B-Zellen dar und ist für die meisten myeloischen Marker ^negativ24. In den Lungen naiver Mäuse können diese drei Zelltypen anhand der Expression von CD11b und MHC ^II18 identifiziert werden. Etwa 25% der pulmonalen CD45⁺-Zellen sind B-Zellen, während der Prozentsatz der NK-Zellen in der Lunge höher ist als bei anderen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben24,25,26. Unter den pulmonalen ^T-Zellen ist ein beträchtlicher Anteil CD4-CD8^- und spielt eine wichtige Rolle bei Atemwegsinfektionen26.

Da die Lunge ein sehr komplexes und einzigartiges Immunsystem beherbergt, wurden mehrere Gating-Strategien zur Identifizierung von Lungenimmunzellen entwickelt und berichtet16,18,20,27. Die hierin beschriebene Gating-Strategie bietet eine umfassende und reproduzierbare Möglichkeit, bis zu 12 verschiedene pulmonale myeloische und nicht-myeloische Immunpopulationen mit 9 Markern zu identifizieren. Zusätzliche Marker wurden verwendet, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus wird eine detaillierte Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension bereitgestellt, die den Zelltod minimiert und die Identifizierung des vollständigsten Profils des Immunzellkompartiments der Lunge ermöglicht. Es sollte beachtet werden, dass die Identifizierung von Nicht-Immunzellen der Lunge, wie Epithelzellen (CD45-CD326⁺CD31^-), Endothelzellen (CD45-CD326-CD31⁺), und Fibroblasten einen anderen Ansatz ^{erfordert28,29}. Die Identifizierung solcher Populationen ist in dem hier beschriebenen Protokoll und Verfahren nicht enthalten.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Studien und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Sechs bis zehn Wochen alte C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts wurden verwendet, um dieses Protokoll zu entwickeln.

1. Chirurgische Exzision und Gewebevorbereitung

1. Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Tribromethanol (hergestellt nach Standardprotokoll; Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: _{CO2-Erstickung} sollte in Lungenstudien vermieden werden, da sie Lungenverletzungen verursachen und die Eigenschaften und Eigenschaften von Lungenimmunzellen verändern kann. Zervikale Dislokationen sollten ebenfalls vermieden werden, da sie zu mechanischen Verletzungen der Lunge führen können.
2. Übertragen Sie die Maus für chirurgische Eingriffe in einen sauberen und speziellen Bereich.
3. Stabilisieren Sie die dorsale Seite der Maus nach unten, indem Sie Nadeln oder Klebeband an den vier Extremitäten verwenden. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Haut des ventralen Bereichs zu desinfizieren.
4. Führen Sie einen Schnitt in der Haut durch, vom Hals bis zum Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Haut aus dem Brustbereich.
5. Entfernen Sie vorsichtig das Brustbein und die Rippen.
6. Spülen Sie die Lunge, indem Sie 10 ml kaltes PBS direkt in den rechten Ventrikel injizieren, mit einer 18-21 G Nadel, bis die Lunge vollständig weiß wird.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Herz, ohne die Lunge zu berühren.
8. Lösen Sie die Lunge vorsichtig vom umgebenden Gewebe und übertragen Sie sie in eine Röhre mit kaltem BSA-Puffer (Tabelle 1).
   HINWEIS: Es sollten Anstrengungen unternommen werden, um das gesamte angrenzende Fett aus der Lunge zu entfernen, bevor die Einzelzellsuspension weiter vorbereitet wird, da dies die Auslesungen verzerren könnte.

2. Herstellung der Einzelzellsuspension

1. Die Lungen in eine leere Petrischale geben und mit zwei feinen Skalpellen zerkleinern. Übertragen Sie alle Teile der gehackten Lunge in ein neues 50 ml konisches Rohr. Verwenden Sie 5 ml Verdauungspuffer, um die Platte zu waschen und sie dem 50-ml-Röhrchen hinzuzufügen, das die gehackte Lunge enthält (Tabelle 1).
   HINWEIS: Der Verdauungspuffer sollte unmittelbar vor dem Gebrauch vorbereitet werden. Verwenden Sie 5 mg/ml ^{Kollagenase28}. Die Kombination von 1 oder 5 mg Kollagenase mit BSA-Puffer oder proteinfreiem PBS verbesserte die Ergebnisse nicht (Ergänzende Abbildung S1).
2. Befestigen Sie den Deckel des Schlauches und verdauen Sie die Lunge für 30 min auf einem Orbitalschüttler mit einer Geschwindigkeit von 150 U / min bei 37 ° C. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzufügen.
3. Verwenden Sie nach der Verdauung eine 18-G-Nadel, um die Lungenstücke zu mischen und aufzulösen. Legen Sie ein 70-μm-Filtersieb an die Oberseite eines neuen konischen 50-ml-Rohrs.
   HINWEIS: Die Verwendung eines kleineren Mikron-Filters kann zum Verlust wichtiger myeloischer Populationen führen.
4. Übertragen Sie die verdaute Lungenmischung langsam direkt auf das Sieb. Verwenden Sie die Gummiseite eines 10-ml-Spritzenkolbens, um die verbleibenden Lungenstücke auf dem Filter zu zerschlagen. Waschen Sie das verarbeitete Material auf dem Filter mit BSA-Puffer.
5. Die Einzelzellsuspension wird 8 min bei 350 × g bei 4 °C zentrifugiert.
6. Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml ACK-Lysepuffer. Mit einer 1-ml-Pipette gut mischen und bei Raumtemperatur 90 s inkubieren.
7. Fügen Sie 10 ml kalten BSA-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 350 × g für 7 min bei 4 °C.Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet im Färbepuffer, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 5 × ¹⁰⁶ Zellen/ml und verwenden Sie sie zur Oberflächenfärbung (siehe Abschnitt 3).
   HINWEIS: Zu diesem Zweck beschichten Sie die Zellen in einer 96-Well-Rundbodenplatte, gefolgt von Antikörperfärbungen und Waschen. Wenn keine Plattenzentrifuge verfügbar ist, verwenden Sie Durchflussrohre anstelle von Platten. Mit diesem Protokoll können ~ 15-20 × ¹⁰⁶ Zellen pro Lunge von einer 6-10 Wochen alten C57BL / 6-Maus mittlerer Größe erhalten werden.

3. Oberflächen-Antikörper-Färbung

1. Übertragen Sie 1 × 106 Zellen in 200 μL pro Vertiefung in einer ^{96-Well-Platte.} Zentrifugieren Sie die Platte bei 350 × g für 7 min bei 4 °C. In der Zwischenzeit wird die Fc-Blocklösung durch Verdünnung des Anti-16/32-Antikörpers (1:100) im Färbepuffer hergestellt (Tabelle 1).
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL der vorgefertigten Fc-blockierenden Lösung (Table of Materials) und inkubieren Sie für 15-20 min bei 4 °C oder auf Eis.
3. 150 μL Färbepuffer zugeben und die Platte bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit den Oberflächenantikörpercocktail vor, indem Sie Oberflächenantikörper verdünnen (1:100; Tabelle 2) im Färbepuffer.
   HINWEIS: (i) Anti-16/32-Antikörper zur FC-Blockierung können mit den Oberflächenantikörpern in derselben Mischung verwendet werden. (ii) Wenn fixierbarer Lebensfähigkeitsfarbstoff verwendet wird, fügen Sie ihn dem Oberflächenantikörpercocktail bei einer Verdünnung von 1:1.000 hinzu.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL des vorgefertigten Oberflächenantikörpercocktails und inkubieren Sie für 30-40 min bei 4 °C im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Färbepuffer.
   HINWEIS: Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL Färbepuffer und fahren Sie direkt mit der Erfassung von Daten auf dem Durchflusszytometer fort. Alternativ können Zellen fixiert und bei 4 °C gelagert werden, um sie später zu erfassen. Wir empfehlen, die Zellen innerhalb von 24 Stunden für die Durchflusszytometrie zu verwenden.

4. Zellfixierung und intrazelluläre Färbung

1. Bereiten Sie den Fixations-/Permeabilisierungspuffer (Fix/Perm-Puffer) vor, indem Sie drei Teile des Fixations-/Permeabilisierungskonzentrats und 1 Teil des Fixations-/Permeabilisierungsverdünnungsmittels des FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set mischen (Tabelle 1).
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL des vorgefertigten Fix/Perm-Puffers pro Vertiefung der 96-Well-Platte, wo die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben plattiert wurden, und inkubieren Sie sie für 20-25 min bei 4 °C im Dunkeln.
3. Verdünnen Sie den 10-fachen Permeabilisierungspuffer als 1: 10 in gereinigtem entionisiertem Wasser, um einen 1x-Permeabilisierungspuffer herzustellen.
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x Permeabilisierungspuffer. In der Zwischenzeit bereiten Sie den intrazellulären Antikörpercocktail vor, indem Sie intrazelluläre Antikörper (1:100) in 1 ml Permeabilisierungspuffer verdünnen.
5. Resuspendieren Sie die Zellen mit 50 μL des vorgefertigten Oberflächenantikörpercocktails pro Zelle der 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 40 min bei 4 °C im Dunkeln.
6. Waschen Sie die Zellen einmal mit Permeabilisierungspuffer und einmal mit Färbepuffer. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL Färbepuffer.
   HINWEIS: Wenn kein Durchflusszytometer mit Plattenleser verfügbar ist, übertragen Sie die Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen.
7. Erwerben Sie mindestens 1,5 × ¹⁰⁶ Zellen pro Probe auf dem Durchflusszytometer.
   HINWEIS: Für einzelne Farben und ungefärbte Kontrollproben sind 0,5-1 × ¹⁰⁶ Zellen pro Probe ausreichend. Es wird empfohlen, die einzelnen verwendeten Antikörper zu titern, um eine optimale Färbung zu erreichen und die Kosten zu senken. Das vorliegende Protokoll wurde mit Fix/Perm Buffer optimiert, das mit dem FoxP3-Färbepuffersatz erstellt wurde. Da CD68 ein zytoplasmatischer und kein nuklearer Marker ist, können andere Permeabilisierungslösungen wie eine niedrige Konzentration von Paraformaldehyd oder Cytofix/Cytoperm-Kits verschiedener Anbieter ausreichen.

Ergebnisse

Gating-Strategie
Der erste Schritt unserer Gating-Strategie ist der Ausschluss der Ablagerungen und Dubletten (Abbildung 1A). Der sorgfältige Ausschluss von Dubletten ist entscheidend, um falsch-positive Populationen zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S2). Anschließend werden Immunzellen mit CD45⁺, einem Marker für hämatopoetische Zellen, identifiziert (Abbildung 1B). Der lebende tote Fleck kann hinzugefügt w...

Diskussion

Die Identifizierung pulmonaler Immunzellen kann aufgrund der in der Lunge lebenden multiplen Immunzelltypen und ihrer einzigartigen immunphänotypischen Eigenschaften im Vergleich zu ihren in anderen Geweben lebenden Gegenstücken eine Herausforderung darstellen. Unter verschiedenen pathologischen Bedingungen treten Zellen mit ausgeprägten phänotypischen Merkmalen in der Lunge auf. Zum Beispiel führt eine Bleomycin-induzierte Lungenverletzung zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten-abgeleiteten Makrophagen im Al...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co