マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

要約

この研究では、マウス呼吸器系の免疫集団を単離するための効果的で再現可能なプロトコルを提示する。また、9色ベースのフローサイトメトリーパネルを使用して、健康なマウスの肺に存在するすべての自然免疫細胞および適応免疫細胞を同定する方法も提供しています。

要約

気道は外部環境と直接接触しており、環境抗原に対する望ましくない反応を抑制しながら保護を提供するために、正確に制御された免疫系を必要とする。肺は、免疫監視を提供するだけでなく、防御免疫応答を媒介する自然免疫細胞および適応免疫細胞のいくつかの集団を宿主とする。健康な肺免疫系のバランスを保つこれらの細胞は、喘息、感染症、自己免疫疾患、癌などのいくつかの病理学的状態にも関与しています。表面および細胞内タンパク質の選択的発現は、肺の免疫細胞にユニークな免疫表現型特性を提供する。その結果、フローサイトメトリーは、定常状態および病理学的状態におけるそのような細胞集団の同定において重要な役割を果たしている。この論文は、定常状態条件下で健康なマウスの肺に存在する免疫細胞を同定するための一貫した再現性のある方法を説明するプロトコルを提示する。しかし、このプロトコルは、肺免疫ランドスケープにおける疾患特異的変化の同定に役立つように、様々な疾患モデルにおけるこれらの細胞集団の変化を同定するためにも使用することができる。

概要

マウス気道には、病原体と戦い、免疫恒常性を維持するためのユニークな免疫系が含まれています。肺免疫系は、その表現型、機能、起源、および位置に有意な不均一性を有する細胞集団からなる。主に胎児単球に由来する常在歯槽マクロファージ(AM)は歯槽内腔¹に存在し、骨髄由来間質マクロファージ(IM)は肺実質²に存在する。IMsは、CD206の発現によってさらに細分類することができる。CD206⁺ IMは気管支周囲および血管周囲領域に分布し、一方CD206-IMは肺胞間質³に位置する。IMのいくつかの下位分類が最近提案されています3,4,5,6。IMはAMよりも研究されていませんが、最近の証拠は肺の免疫系の調節におけるIMの重要な役割を支持しています⁷。加えて、CD206は、代替的に活性化されたAMs8においても発現される。

肺樹状細胞(DC)は、その機能的特性、位置、および起源に関して、肺免疫細胞の別の不均一なグループである。従来のCD103+ DC(cDC1としても知られる)、従来のCD11b⁺ DC(cDC2としても知られる)、単球由来DC(MoDC)、および形質細胞様^DCs9、^{10、11、12、13}の4つのサブカテゴリが肺に記載されています。最初の3つのサブクラスは、主要組織適合性複合体(MHC)II⁺CD11c⁺9,10,14,15として定義することができる。形質細胞様DCはMHC IIを発現し、CD11cに対して中間陽性であるが、高レベルのB220およびPDCA-19,13,16を発現する。ナイーブマウス肺では、CD103 DCおよびCD11b DCは気道間質に位置し、形質細胞様DCは肺胞間質に位置する¹⁷。

単球の2つの主要な集団は、定常状態の間肺に存在する:古典的単球および非古典的単球。古典的な単球はLy6C ⁺であり、初期炎症反応に重要である。対照的に、非古典的単球はLy6C⁻であり、抗炎症細胞として広く見なされている³、^16、18。最近、CD64⁺CD16.2⁺単球のさらなる集団が記載され、これはLy6C^-単球に由来し、CD206⁺ IMs3を生じる。

好酸球は、主に蠕虫感染またはアレルギー状態の間に肺に現れる。しかしながら、定常状態時の肺実質には少数の好酸球が存在し、常在型好酸球として知られている。常在の好酸球とは対照的に、炎症性好酸球は肺間質および気管支肺胞洗浄(BAL)に見られる。ハウスダストダニ(HDM)のマウスモデルでは、抗原媒介刺激後に炎症性好酸球が肺に動員される。常在の好酸球は、^HDM19に対するTヘルパー2(Th2)感作を阻害することによって、アレルギーにおいて調節的役割を有する可能性があることが提案されている。

他の肺骨髄系細胞とは対照的に、好中球はLy6Gを発現するがCD68は発現せず、CD68-Ly6G⁺免疫表現型のシグネチャーによって特徴付けられる^16,20,21。可視化研究は、定常状態の間、肺が血管内区画に好中球のプールを留保し、かなりの数の血管外好中球を宿主とすることを示した²²。好酸球と同様に、好中球は定常状態でBALには見出されない。しかし、LPSチャレンジ、喘息、肺炎などのいくつかの形態の免疫刺激は、好中球を肺胞内腔に誘導し、^{BAL21、22、23}にそれらの存在をもたらす。

肺のかなりの数のCD45⁺細胞は、ナチュラルキラー(NK)、T細胞、およびB細胞を表し、ほとんどの骨髄系マーカーに対して陰性である²⁴。ナイーブマウスの肺において、これら3つの細胞型は、CD11bおよびMHC ^II18の発現に基づいて同定することができる。肺CD45⁺細胞の約25%はB細胞であるが、NK細胞の割合は他のリンパ系および非リンパ系組織よりも肺内で高い^24,25,26。肺T細胞のうち、かなりの画分が^CD4-CD8-であり、呼吸器感染症において重要な役割を果たしている²⁶。

肺は非常に複雑でユニークな免疫系を宿主としているため、肺免疫細胞を同定するためのいくつかのゲーティング戦略が開発され、報告されています16,18,20,27。本明細書に記載されるゲーティング戦略は、9つのマーカーを用いて最大12個の異なる肺骨髄系および非骨髄系免疫集団を同定するための包括的かつ再現可能な方法を提供する。追加のマーカーを使用して、結果を検証しています。さらに、細胞死を最小限に抑え、肺の免疫細胞区画の最も完全なプロファイルの同定を可能にする単一細胞懸濁液の調製のための詳細な方法が提供される。上皮細胞(CD45-CD326⁺CD31-)、内皮細胞(CD45-CD326-CD31⁺)、および線維芽細胞などの肺の非免疫細胞の同定には、異なるアプローチが必要であることに留意すべきである^28,29。このような集団の同定は、本明細書に記載されるプロトコルおよび方法には含まれない。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての研究および実験は、ベスイスラエルディーコネス医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)に準拠したガイドラインの下で実施されました。どちらの性別の6〜10週齢のC57BL/6マウスも、このプロトコールを開発するために使用された。

1. 外科的切除および組織調製

1. 1mLのトリブロモエタノールを腹腔内注射することによってマウスを安楽死させる(標準的なプロトコールに従って調製; 材料表)。
   注:_CO2 窒息は、肺傷害を引き起こし、肺免疫細胞の特徴および特性を変化させる可能性があるため、肺試験では避けるべきである。子宮頸部脱臼は、肺の機械的損傷を引き起こす可能性があるため、避けるべきである。
2. 外科手術のためにマウスを清潔で専用の領域に移します。
3. マウスの背側を下に安定させるには、4つの四肢に針またはテープを付けます。腹側の皮膚を消毒するために70%エタノールを使用してください。
4. 皮膚の切開を行います, 首から腹部へ.胸部から皮膚を慎重に取り除きます。
5. 胸骨と肋骨を慎重に取り外します。
6. 肺が完全に白くなるまで、18-21G針を使用して、10mLの冷たいPBSを右心室に直接注射して肺を洗い流す。
7. 肺に触れずに胸腺と心臓を慎重に取り除きます。
8. 肺を周囲の組織から静かに取り外し、冷たいBSA緩衝液でチューブに移します(表1)。
   注:単一細胞懸濁液をさらに調製する前に、肺から隣接するすべての脂肪を除去する努力をする必要があります。

2. 単細胞懸濁液の調製

1. 肺を空のペトリ皿に移し、2つの細かいメスでそれらをミンチにします。細切った肺のすべての部分を新しい50mL円錐管に移す。5 mLの消化バッファーを使用してプレートを洗浄し、細切した肺を入れた50 mLチューブに加えます(表1)。
   注:消化バッファーは、使用直前に準備する必要があります。5 mg/mLのコラゲナーゼ^{28を使用してください}。1または5mgのコラゲナーゼをBSA緩衝液またはタンパク質非含有PBSと組み合わせても、結果は改善されなかった(補足図S1)。
2. チューブの蓋を固定し、37°Cで150rpmの速度でオービタルシェーカーで30分間肺を消化する。 10 mLの冷BSA緩衝液を加えて反応を停止した。
3. 消化後、18G針を使用して肺片を混合して溶解します。新しい 50 mL 円錐管の上部に 70 μm のフィルターストレーナーを置きます。
   注:より小さなミクロンフィルターを使用すると、主要な骨髄系集団が失われる可能性があります。
4. 消化された肺混合物をゆっくりとストレーナーに直接移します。10 mLシリンジプランジャーのゴム側を使用して、フィルター上の残りの肺片を粉砕します。フィルター上の処理済み材料をBSAバッファーで洗浄します。
5. この単細胞懸濁液を350× g で4°Cで8分間遠心分離する。
6. 上清を慎重に廃棄し、細胞を1mLのACK溶解緩衝液に再懸濁する。1mLのピペットを用いてよく混合し、室温で90秒間インキュベートする。
7. 10 mLの冷BSAバッファーを加えて反応を停止し、350 × g で4°Cで7分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄し、ペレットを染色バッファーに再懸濁し、血球計数器を用いて細胞を計数した。
8. 細胞を5×¹⁰⁶ 細胞/mLの濃度で再懸濁し、表面染色に使用します(セクション3を参照)。
   注:この目的のために、細胞を96ウェル丸底プレートにプレートし、続いて抗体染色および洗浄を行う。プレート遠心分離機が利用できない場合は、プレートの代わりにフローチューブを使用してください。このプロトコールでは、平均サイズの6~10週齢のC57BL/⁶ マウスから、肺あたり約15~20×106個の細胞を得ることができます。

3. 表面抗体染色

1. 1ウェルあたり200 μLの106細胞を⁹⁶ ウェルプレートに1×1個移入する。プレートを350 × g で4°Cで7分間遠心分離する。 その間に、抗16/32抗体(1:100)を染色バッファーで希釈してFcブロック溶液を調製した(表1)。
2. 細胞を50 μLの予め調製したFcブロッキング溶液(材料表)に再懸濁し、4°Cまたは氷上で15〜20分間インキュベートする。
3. 150 μLの染色バッファーを加え、プレートを350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 一方、表面抗体を希釈して表面抗体カクテルを調製する(1:100; 表2)染色バッファーに入れます。
   注:(i)Fcブロッキングのための抗16/32抗体は、同じ混合物中の表面抗体と共に使用することができる。(ii)定着可能な生存率色素を用いる場合は、1:1,000の希釈率で表面抗体カクテルに添加する。
4. 予め調製した表面抗体カクテル50 μLに細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで30〜40分間インキュベートする。染色バッファーで細胞を2回洗浄する。
   注: 細胞内染色が必要ない場合は、細胞を 200 μL の染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメーターでのデータ取得に直接進んでください。あるいは、細胞を固定し、後で取得するために4°Cで保存してもよい。24時間以内にフローサイトメトリーに細胞を使用することをお勧めします。

4. 細胞固定と細胞内染色

1. FoxP3/転写因子染色バッファーセットの固定/透過処理濃縮液3部と固定/透過処理希釈液1部を混合して、固定/透過処理バッファー(Fix/Permバッファー)を調製します(表1)。
2. 96ウェルプレートのウェルあたり50 μLの予め調製されたFix/Perm Bufferに細胞を再懸濁し、セクション3に記載したように細胞を播種し、暗所で4°Cで20〜25分間インキュベートする。
3. 10倍透過処理緩衝液を精製脱イオン水で1:10として希釈し、1x透過処理緩衝液を調製した。
4. 細胞を1倍の透過処理バッファーで1回洗浄します。一方、細胞内抗体を1mLの透過処理バッファーで希釈(1:100)して細胞内抗体カクテルを調製する。
5. 96ウェルプレートの細胞あたり50 μLの予め調製した表面抗体カクテルを用いて細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで40分間インキュベートした。
6. 細胞を透過処理バッファーで 1 回、染色バッファーで 1 回洗浄します。最終洗浄後、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁する。
   注: プレートリーダー付きフローサイトメーターが利用できない場合は、細胞をフローサイトメトリーチューブに移します。
7. フローサイトメーターでサンプルあたり最低1.5×¹⁰⁶ 個の細胞を取得します。
   注: 単色および染色されていない対照サンプルの場合、サンプルあたり 0.5 ~ 1 × ¹⁰⁶ セルで十分です。最適な染色を達成し、コストを削減するために使用される個々の抗体を力価測定することが推奨される。本プロトコルは、FoxP3染色バッファーセットを使用して調製されたFix/Permバッファーを使用して最適化されています。CD68は細胞質であり、核マーカーではないため、低濃度のパラホルムアルデヒドや様々なベンダーのサイトフィックス/サイトパーマキットなどの他の透過処理溶液で十分かもしれません。

結果

ゲーティング戦略
ゲート戦略の最初のステップは、破片とダブレットの排除です(図1A)。ダブレットの慎重な排除は、偽陽性集団を回避するために重要である(補足図S2)。次に、造血細胞のマーカーであるCD45⁺を用いて免疫細胞を同定する(図1B)。生死染色剤を添加して、死細胞を除外することができます。しかし?...

ディスカッション

肺免疫細胞の同定は、肺に存在する複数の免疫細胞型および他の組織に存在する対応するものと比較して、それらのユニークな免疫表現型特性のために困難な場合がある。いくつかの病理学的状態において、明確な表現型特徴を有する細胞が肺に現れる。例えば、ブレオマイシン誘発性肺損傷は、肺胞腔における循環単球由来マクロファージの動員をもたらし、そこでは、それらは1年間も持...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co