ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

Summary

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

Abstract

מערכת הנשימה נמצאת במגע ישיר עם הסביבה החיצונית ודורשת מערכת חיסונית מוסדרת במדויק כדי לספק הגנה תוך דיכוי תגובות לא רצויות לאנטיגנים סביבתיים. הריאות מארחות מספר אוכלוסיות של תאי חיסון מולדים ומסתגלים המספקים מעקב חיסוני אך גם מתווכים בתגובות חיסוניות מגנות. תאים אלה, השומרים על איזון מערכת החיסון הריאתית הבריאה, משתתפים גם במספר מצבים פתולוגיים כגון אסתמה, זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן. ביטוי סלקטיבי של חלבונים פנימיים ותאיים מספק תכונות חיסוניות ייחודיות לתאי החיסון של הריאה. כתוצאה מכך, לציטומטריית זרימה יש תפקיד אינסטרומנטלי בזיהוי אוכלוסיות תאים כאלה במהלך מצב יציב ותנאים פתולוגיים. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר שיטה עקבית וניתנת לשחזור לזיהוי תאי החיסון השוכנים בריאות של עכברים בריאים בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות כדי לסייע בזיהוי שינויים ספציפיים למחלות בנוף מערכת החיסון של הריאות.

Introduction

דרכי הנשימה של מורין מכילות מערכת חיסונית ייחודית האחראית למלחמה בפתוגנים ולשמירה על הומאוסטזיס חיסוני. מערכת החיסון הריאתית מורכבת מאוכלוסיות תאיות עם הטרוגניות משמעותית בפנוטיפ, בתפקוד, במקור ובמיקום שלהן. מקרופאגים מכתשיים מקומיים (AMs), שמקורם בעיקר במונוציטים עובריים, שוכנים בלומן מכתשי1, בעוד שמקרופגים ביניים (IMs) שמקורם במח העצם שוכנים בפרנצ'ימה ^הריאה2. הודעות מיידיות יכולות להיות מסווגות עוד יותר על-ידי הביטוי של CD206. CD206⁺ IMs מאכלסים את אזור הפריברונכיאל והפריקולרי, בעוד ש- CD206^- IMs ממוקמים באינטרסטיטיום מכתשי3. כמה מחלקות משנה של הודעות מיידיות הוצעו ^{לאחרונה3,4,5,6}. למרות IMs נחקרים פחות מאשר AMs, ראיות אחרונות תומכות בתפקיד המכריע שלהם בוויסות המערכת החיסונית של ^הריאה7. בנוסף, CD206 מתבטא גם ב- ^AMs8 המופעלים באופן חלופי.

תאי דנדריטי ריאתי (DCs) הם קבוצה הטרוגנית נוספת של תאי מערכת החיסון של הריאות ביחס למאפיינים התפקודיים שלהם, מיקומם ומוצאם. ארבע קטגוריות משנה של DCs תוארו בריאה: CD103 ⁺ DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC1), CD11b ⁺ DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC2), בקרי DC (MoDCs) שמקורם במונוציטים ו- DC של פלסמציטויד9,10,11,12,13. ניתן להגדיר את שלוש מחלקות המשנה הראשונות כתרכובת היסטו-תאימות מרכזית (MHC) II ⁺CD11c^+9,10,14,15. מחשבי DCs פלזמה מבטאים MHC II והם חיוביים באופן ביניים עבור CD11c אך מבטאים רמות גבוהות של B220 ו- PDCA-19,13,16. בריאות מורין נאיביות, CD103 DCs ו- CD11b DCs ממוקמים interstitium דרכי הנשימה, בעוד DCs plasmacytoid ממוקמים interstitium ^מכתשי17.

שתי אוכלוסיות עיקריות של מונוציטים שוכנות בריאה במצב יציב: מונוציטים קלאסיים ומונוציטים לא קלאסיים. מונוציטים קלאסיים הם Ly6C⁺ והם קריטיים לתגובה הדלקתית הראשונית. לעומת זאת, מונוציטים לא קלאסיים הם Ly6C^- והם נתפסו באופן נרחב כתאים אנטי דלקתיים3,16,18. לאחרונה תוארה אוכלוסייה נוספת של מונוציטים CD64⁺CD16.2⁺CD16.2+, שמקורם ב- Ly6C^- מונוציטים ומעוררים CD206 ^{+ IMs3}.

אאוזינופילים מופיעים בעיקר בריאות במהלך זיהום הלמינת או תנאים אלרגיים. עם זאת, יש מספר קטן של אאוזינופילים בפרנצ'ימה ריאתית במהלך מצב יציב, המכונה אאוזינופילים תושב. בניגוד לאאוזינופילים המקומיים, אאוזינופילים דלקתיים נמצאים באינטרסטיטיום הריאות ובשטיפה סימפונלבולרית (BAL). במודלים של עכבר של קרדית אבק הבית (HDM), אאוזינופילים דלקתיים מגויסים לריאה לאחר גירוי בתיווך אנטיגן. הוצע כי אאוזינופילים תושב עשוי להיות תפקיד רגולטורי באלרגיה על ידי עיכוב T helper 2 (Th2) רגישות ^HDM19.

בניגוד לשאר תאי המיאלואידים הריאתיים, נויטרופילים מבטאים Ly6G אך לא CD68 ומאופיינים בחתימה של ה- CD68-Ly6G ⁺ אימונופנוטיפ16,20,21. מחקרי הדמיה הראו כי במהלך מצב יציב, הריאה שומרת מאגר של נויטרופילים בתא התוך וסקולרי ומארחת מספר ניכר של נויטרופילים חוץ ^{וסקולריים22}. בדומה לאאוזינופילים, נויטרופילים אינם נמצאים ב- BAL במצב יציב; עם זאת, מספר צורות של גירוי חיסוני, כגון אתגר LPS, אסטמה, או דלקת ריאות, לנהוג נויטרופילים לתוך לומן מכתשי, וכתוצאה מכך נוכחותם BAL21,22,23.

מספר משמעותי של תאי CD45⁺ של הריאה מייצגים רוצח טבעי (NK), תאי T ותאי B והם שליליים עבור רוב סמני המיאלואידים24. בריאות של עכברים נאיביים, ניתן לזהות את שלושת סוגי התאים האלה בהתבסס על הביטוי של CD11b ו- MHC ^II18. כ-25% מתאי CD45⁺ הריאתיים הם תאי B, בעוד שאחוז תאי ה-NK גבוה יותר בריאה מאשר רקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות אחרות24,25,26. בקרב תאי T ריאתיים, שבר ניכר הוא ^CD4-CD8- וממלא תפקיד חשוב בזיהומים בדרכי ^{הנשימה26}.

מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות ודווחו על 16,18,20,27. אסטרטגיית ההמצאה המתוארת במסמך זה מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ומערכת חיסונית לא מיאלואידית באמצעות 9 סמנים. סמנים נוספים שימשו לאימות התוצאות. יתר על כן, שיטה מפורטת מסופקת להכנת השעיה של תא יחיד הממזערת את מוות התאים ומאפשרת זיהוי של הפרופיל השלם ביותר של תא התא החיסוני של הריאה. יש לציין כי זיהוי של תאים שאינם חיסוניים של הריאה, כגון תאי אפיתל (CD45-CD326 ⁺CD31^-), תאי אנדותל (CD45-CD326-CD31⁺), ופיברובלסטים דורש גישה שונה ^28,29. זיהוי אוכלוסיות כאלה אינו כלול בפרוטוקול ובשיטה המתוארים כאן.

Protocol

כל המחקרים והניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נערכו תחת הנחיות על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. עכברי C57BL/6 בני שישה עד עשרה שבועות משני המינים שימשו לפיתוח פרוטוקול זה.

1. כריתה כירורגית והכנת רקמות

1. המתת חסד לעכבר על ידי הזרקה תוך-אפריקאית של 1 מ"ל של tribromoethanol (מוכן על פי פרוטוקול סטנדרטי; טבלת חומרים).
   הערה: יש להימנע מחנק _CO2 במחקרי ריאות מכיוון שהוא עלול לגרום לפגיעה בריאה ולשנות את התכונות והמאפיינים של תאי מערכת החיסון של הריאות. יש להימנע גם מפריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא עלולה לגרום לפגיעה מכנית בריאה.
2. מעבירים את העכבר לאזור נקי וייעודי לניתוח.
3. לייצב את הצד הגבי של העכבר כלפי מטה באמצעות מחטים או סרט הדבקה על ארבע הגפיים. השתמש 70% אתנול כדי לחטא את העור של אזור הגחון.
4. בצע חתך בעור, מהצוואר ועד הבטן. הסר בזהירות את העור מאזור בית החזה.
5. הסר בזהירות את עצם החזה והצלעות.
6. לשטוף את הריאות על ידי הזרקת 10 מ"ל של PBS קר ישירות בחדר הימני, באמצעות מחט 18-21 G, עד הריאות להיות לבן לחלוטין.
7. בזהירות להסיר את התימוס והלב מבלי לגעת בריאות.
8. נתק בעדינות את הריאות מהרקמות שמסביב והעבר אותן לצינור עם מאגר BSA קר (טבלה 1).
   הערה: יש לעשות מאמץ כדי להסיר את כל השומן הסמוך מן הריאות לפני המשך הכנת ההשעיה של תא יחיד, כמו זה יכול להטות את הקריאות.

2. הכנת השעיה של תא יחיד

1. מעבירים את הריאות לצלחת פטרי ריקה וטחונים אותן עם שני אזמלים עדינים. מעבירים את כל חלקי הריאה הטחונה לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. השתמש 5 מ"ל של מאגר עיכול כדי לשטוף את הצלחת ולהוסיף אותו צינור 50 מ"ל המכיל את הריאה הטחונה (טבלה 1).
   הערה: יש להכין את מאגר העיכול מיד לפני השימוש. יש להשתמש ב-5 מ"ג/מ"ל ^{קולגנאז28}. שילוב של 1 או 5 מ"ג קולגנאז עם מאגר BSA או PBS ללא חלבון לא שיפר את התוצאות (איור S1 משלים).
2. מאבטחים את מכסה הצינור ומעכלים את הריאה במשך 30 דקות על שייקר מסלולית במהירות של 150 סל"ד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר BSA קר.
3. לאחר העיכול, השתמש במחט 18 גרם כדי לערבב ולהמיס את חתיכות הריאה. מניחים מסננת מסננת 70 מיקרומטר בחלק העליון של צינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
   הערה: שימוש במסנן מיקרון קטן יותר עלול לגרום לאובדן אוכלוסיות מיאלואידיות עיקריות.
4. מעבירים באיטיות את תערובת הריאות המעוכלת ישירות על המסננת. השתמש בצד הגומי של בוכנה מזרק 10 מ"ל כדי לרסק את חתיכות הריאה הנותרות על המסנן. לשטוף את החומר המעובד על המסנן עם מאגר BSA.
5. צנטריפוגה ההשעיה של תא יחיד ב 350 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F ).
6. בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של מאגר תמוגה ACK. מערבבים היטב באמצעות צנרת 1 מ"ל, ודגור במשך 90 שניות בטמפרטורת החדר.
7. הוסף 10 מ"ל של חיץ BSA קר כדי לעצור את התגובה ואת הצנטריפוגה ב 350 × גרם במשך 7 דקות ב 4 °C .בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend את הכדור במאגר כתמים לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
8. לשפץ את התאים בריכוז של 5 × ¹⁰⁶ תאים / מ"ל ולהשתמש בהם להכתמת פני השטח (ראה סעיף 3).
   הערה: למטרה זו, צלחת התאים בצלחת עגולה 96 היטב למטה ואחריו כתמי נוגדנים ושטיפת. אם צנטריפוגת צלחת אינה זמינה, השתמש בצינורות זרימה במקום בלוחות. עם פרוטוקול זה, ~ 15-20 × ¹⁰⁶ תאים לריאה ניתן להשיג מעכבר C57BL / 6 בן 6-10 שבועות בגודל ממוצע.

3. כתמי נוגדנים על פני השטח

1. העבר 1 × ¹⁰⁶ תאים ב 200 μL לבאר בלוח 96-well. צנטריפוגה הצלחת ב 350 × גרם במשך 7 דקות ב 4 °C (4 °F). בינתיים, להכין את הפתרון בלוק Fc על ידי דילול נוגדן נגד 16/32 (1:100) במאגר כתמים (טבלה 1).
2. Resuspend התאים ב 50 μL של פתרון חסימת Fc מוכן מראש (טבלת חומרים) ודגור במשך 15-20 דקות ב 4 °C (4 °F) או על קרח.
3. מוסיפים 150 μL של חיץ כתמים וצנטריפוגה הצלחת ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). בינתיים, להכין את קוקטייל נוגדנים פני השטח על ידי דילול נוגדנים פני השטח (1:100; טבלה 2) במאגר מכתים.
   הערה: (i) נוגדן נגד 16/32 לחסימת Fc ניתן להשתמש עם נוגדני פני השטח באותה תערובת. (ii) אם נעשה שימוש בצבע כדאיות לתיקון, הוסיפו אותו לקוקטייל הנוגדנים על פני השטח בדילול של 1:1,000.
4. Resuspend התאים ב 50 μL של קוקטייל נוגדני משטח מוכן מראש ודגור במשך 30-40 דקות ב 4 °C (60 °F) בחושך. לשטוף את התאים עם חיץ כתמים פעמיים.
   הערה: אם אין צורך בהכתמה תאית, תחבר מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר כתמים ותמשיך ישירות לרכישת נתונים על ציטומטר הזרימה. לחלופין, תאים עשויים להיות קבועים ומאוחסנים ב 4 °C °C (65 °F) לרכישה מאוחר יותר. אנו ממליצים להשתמש בתאים עבור cytometry זרימה בתוך 24 שעות.

4. קיבוע תאים וכתמים תאיים

1. הכן את מאגר הקיבעון /permeabilization (תיקון / מאגר פרם) על ידי ערבוב שלושה חלקים של קיבעון / תרכיז permeabilization וחלק אחד של קיבעון / permeabilization דילול של FoxP3 / מאגר כתמים גורם שעתוק (טבלה 1).
2. Resuspend התאים ב 50 μL של תיקון מוכן מראש / פרם חוצץ לכל באר של צלחת 96-well, שבו תאים היו מצופים כמתואר בסעיף 3, ודגור אותם במשך 20-25 דקות ב 4 °C (4 °F) בחושך.
3. לדלל את מאגר 10x permeabilization כמו 1: 10 במים דה-יוניזציה מטוהרים כדי להכין 1x מאגר permeabilization.
4. לשטוף את התאים פעם אחת עם מאגר 1x permeabilization. בינתיים, להכין את קוקטייל נוגדנים תאיים על ידי דילול נוגדנים תאיים (1:100) ב 1 מ"ל של חיץ permeabilization.
5. resuspend התאים באמצעות 50 μL של קוקטייל נוגדני משטח מוכן מראש לכל תא של צלחת 96-well ודגור במשך 40 דקות ב 4 °C (4 °F) בחושך.
6. לשטוף את התאים פעם אחת עם מאגר permeabilization ופעם אחת עם חיץ כתמים. לאחר הכביסה הסופית, resuspend התאים ב 200 μL של חיץ כתמים.
   הערה: אם אין ציטומטר זרימה עם קורא לוחות זמין, העבר את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה.
7. לרכוש מינימום של 1.5 × ¹⁰⁶ תאים לכל מדגם על cytometer הזרימה.
   הערה: עבור צבעים בודדים ודגימות בקרה לא מוכתמות, 0.5-1 × ¹⁰⁶ תאים לדגימה יספיקו. מומלץ לסמן את הנוגדנים הבודדים המשמשים להשגת כתמים אופטימליים ולהקטנת עלויות. הפרוטוקול הנוכחי עבר מיטוב באמצעות מאגר Fix/Perm שהוכן באמצעות ערכת מאגרי הכתמים של FoxP3. מכיוון ש- CD68 הוא ציטופלסמי ולא סמן גרעיני, פתרונות פרמביליזציה אחרים כגון ריכוז נמוך של ערכות paraformaldehyde או ציטופיקס / cytoperm מספקים שונים עשויים להספיק.

תוצאות

אסטרטגיית גינג
הצעד הראשון באסטרטגיית ההזדווגות שלנו הוא הדרת הפסולת והכפילויות (איור 1A). הדרה זהירה של כפילויות היא קריטית כדי למנוע אוכלוסיות חיוביות כוזבות (איור S2 משלים). לאחר מכן, תאי מערכת החיסון מזוהים באמצעות CD45⁺, סמן לתאי המטופויטיקה (

Discussion

זיהוי של תאי מערכת החיסון הריאתית יכול להיות מאתגר בגלל סוגי תאי החיסון המרובים המתגוררים בריאה ומאפייניהם החיסוניים הייחודיים בהשוואה למקביליהם המתגוררים ברקמות אחרות. במספר מצבים פתולוגיים, תאים עם תכונות פנוטיפיות ברורות מופיעים בריאות. לדוגמה, פגיעה ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין גו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co