Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

Resumen

Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.

Resumen

Durante la expresión génica, el paso vital del empalme pre-ARNm implica el reconocimiento preciso de los sitios de empalme y el ensamblaje eficiente de los complejos espliceosómicos para unir exones y eliminar los intrones antes de la exportación citoplasmática del ARNm maduro. La eficiencia del empalme puede verse alterada por la presencia de mutaciones en los sitios de empalme, la influencia de los factores de empalme de acción trans o la actividad de la terapéutica. Aquí, describimos el protocolo para un ensayo celular que se puede aplicar para monitorear la eficiencia de empalme de cualquier exón dado. El ensayo utiliza un plásmido adaptable codificado 3-exon/2-intron minigene reporter, que puede expresarse en células de mamíferos por transfección transitoria. Después de la transfección, se aísla el ARN celular total, y la eficiencia del empalme de exones en el ARNm reportero se determina mediante la extensión del cebador o la reacción en cadena semicuantitativa de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Describimos cómo se puede determinar el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5′ asociadas a la enfermedad introduciéndolas en el reportero; y cómo la supresión de estas mutaciones se puede lograr mediante la coinfección con el ARN nuclear pequeño (snRNA) U1 que lleva mutaciones compensatorias en su región de 5′ que se fusiona con los sitios de empalme 5′ en las uniones exón-intrón en pre-ARNm. Por lo tanto, el reportero se puede utilizar para el diseño de partículas terapéuticas de U1 para mejorar el reconocimiento de los sitios de empalme mutantes de 5 '. La inserción de sitios reguladores de acción cis, como secuencias de potenciador de empalme o silenciador, en el informador también se puede utilizar para examinar el papel de U1 snRNP en la regulación mediada por un factor de empalme alternativo específico. Finalmente, las células que expresan al reportero se pueden incubar con moléculas pequeñas para determinar el efecto de la terapéutica potencial en el empalme constitutivo de pre-ARNm o en exones que transportan sitios de empalme mutantes de 5 '. En general, el ensayo de reportero se puede aplicar para monitorear la eficiencia del empalme en una variedad de condiciones para estudiar los mecanismos fundamentales de empalme y las enfermedades asociadas al empalme.

Introducción

El empalme pre-ARNm es un paso de procesamiento esencial que elimina los intrones no codificantes y liga con precisión los exones codificantes para formar ARNm maduro. El reconocimiento de secuencias de consenso en las uniones exón-intrón, denominadas sitio de empalme de 5′ y sitio de empalme de 3′, por componentes de la maquinaria de empalme inicia el proceso de empalme. La ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 (snRNP) reconoce el sitio de empalme 5′ por emparejamiento de bases del snRNA U1 con el pre-ARNm1. Las mutaciones heredadas genéticamente que alteran las secuencias del sitio de empalme....

Protocolo

1. Reactivos y tampones

NOTA: Toda la esterilización con filtros de vacío debe realizarse con una membrana de polietersulfona (PES) de 0,2 μm en un gabinete de bioseguridad.

1. Prepare agua sin RNasa agregando 1.0 ml de dietilpirocarbonato (DEPC) a 1.0 L de agua desionizada, mezcle durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (RT), autoclave dos veces y luego enfríe a RT antes de usar.
2. Prepare el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco mezclando un paquete de polvo de DMEM (13.4 g), 3.7 g de bicarbonato de sodio, 100 ml de suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina a ~ 800 ml de agua desionizada estéril. La ....

Resultados

El reportero de empalme Dup51, un minigén de tres exones-dos intrón, se derivó del gen humano β-globina y ha sido descrito previamente (Figura 1A)^11,12 . Creamos un reportero mutante, Dup51p, introduciendo mutaciones en el sitio de empalme 5' asociadas al síndrome de Usher que ocurren en el exón 3 del gen de la protocadherina 15 (PCDH15)¹³. La secuencia del sitio de empalme 5' en la unión exón.......

Discusión

El ensayo se puede adaptar para el análisis de empalme en líneas celulares distintas de HeLa, sin embargo, es posible que sea necesario optimizar los factores que afectan la eficiencia de la transfección, como la confluencia celular y la cantidad de ADN. La relación de constructo reportero-U1 es otro parámetro crítico que puede necesitar ser determinado dependiendo de los niveles de expresión observados en otros tipos de células. La calidad del ARN extraído es crítica para el análisis de empalme; por lo tanto,.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent Grade Deionized Water	ThermoFisher Scientific	23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet	Gibco	12100-046
Sodium Bicarbonate	ThermoFisher Scientific	S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N	Sigma-Aldrich	S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%	ThermoFisher Scientific	A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters	ThermoFisher Scientific	FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate	Amresco	0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	15090046
Sodium Chloride	Fisher Bioreagent	BP358-212
Potassium Chloride	Fisher Bioreagent	BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate	Fisher Bioreagent	BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate	Fisher Bioreagent	BP362-1
Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	11058021
Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000	ThermoFisher Scientific	13778150
TRIzol™ Reagent	ThermoFisher Scientific	15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)	ThermoFisher Scientific	BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents	ThermoFisher Scientific	BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents	ThermoFisher Scientific	BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi	PerkinElmer	NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
Size exclusion beands - Sephadex® G-25	Sigma-Aldrich	G2580-10G
Size exclusion mini columns	USA Scientific	1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt	Affymetrix	76410 100 UL
Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™	Sigma-Aldrich	R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea)	ThermoFisher Scientific	18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	28025013	used for primer extension
Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10342020
Random Hexamers (50 µM)	ThermoFisher Scientific	N8080127
Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix	ThermoFisher Scientific	4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080093	used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	18080093
5X First-Strand Buffer	ThermoFisher Scientific	18080093
Formamide (≥99.5%)	ThermoFisher Scientific	BP228-100	Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt	Sigma-Aldrich	114405-5G
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)	ThermoFisher Scientific	BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)	ThermoFisher Scientific	BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)	ThermoFisher Scientific	BP1406-1	Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)	ThermoFisher Scientific	BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade	VWR	M133-25G
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure	VWR	0761-25ML	Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon	VWR	ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm	VWR	NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm	VWR	NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm	VWR	NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager	GE Healthcare	28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter	GMI	8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems	ThermoFisher Scientific